Lavoro sperimentale sul trapianto di cheratinociti allogenici su cicatrici create artificialmente di ratti bianchi

Il desiderio di sfruttare il potenziale cellulare e la necessità di trovare nuovi metodi efficaci per migliorare l'aspetto estetico delle cicatrici hanno portato all'idea di provare a studiare la possibilità di trapiantare cheratinociti sulle superfici cicatriziali.

Per dimostrare la probabilità di utilizzare la coltura di cheratinociti per migliorare l'aspetto delle cicatrici, è stato condotto uno studio sperimentale su ratti bianchi da laboratorio, sui quali sono state create superfici cicatriziali. Il modello di cicatrice di ratto è stato ottenuto in seguito alla guarigione di ferite inflitte artificialmente sulla schiena, lungo la colonna vertebrale. Dai ratti sono stati prelevati frammenti di pelle identici, di 2x3 cm. Due mesi e mezzo dopo l'operazione di "modellazione della cicatrice", i ratti sono stati sottoposti a dermoabrasione (rimozione degli strati superiori della cicatrice mediante termocaustico) e sono stati trapiantati cheratinociti allogenici, isolati dalla pelle di cuccioli di ratto 2-4 giorni dopo la nascita.

L'isolamento e la coltivazione delle cellule epidermiche di ratto sono stati effettuati nel laboratorio di tecnologie cellulari dell'Istituto di citologia dell'Accademia russa delle scienze utilizzando la seguente tecnologia.

La pelle è stata lavata in soluzione salina di Hank contenente 200 U/ml di gentamicina e tagliata in piccoli pezzi, di 0,2-0,5 cm² di area ^. I pezzi di pelle sono stati incubati in una soluzione di dispasi allo 0,5% in soluzione salina tamponata con fosfato bilanciata a 37 °C per 1 ora. I pezzi sono stati quindi trasferiti in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco e l'epidermide è stata separata dal derma. L'epidermide è stata incubata in una soluzione di tripsina allo 0,125% per 10-15 minuti sotto agitazione a 50 giri al minuto, dopodiché l'azione enzimatica è stata bloccata aggiungendo siero fetale bovino al 5%. Un terzo della sospensione cellulare risultante è stato utilizzato in forma pura per una delle opzioni di trapianto su cicatrici, il secondo terzo è stato coltivato su rivestimenti biocompatibili per uso domestico "Polypor" e il terzo su piastre Petri senza substrato. L'operazione di dermoabrasione delle cicatrici risultanti nei ratti con successivo trapianto di cellule epidermiche di ratto su di esse è stata eseguita in anestesia con etere utilizzando un cauterizzatore termico.

Nel primo gruppo di ratti, dopo la dermoabrasione, pezzi sterili di batista sono stati posizionati sulla superficie della cicatrice lucidata, lavata con soluzione fisiologica e asciugata, su cui è stata applicata una sospensione di epidermociti allogenici di ratto, in agitazione, a una concentrazione di 1,5 milioni di cellule per 1 ml (secondo l'Istituto di Citologia). I pezzi di batista sono stati posizionati sulla cicatrice lucidata in modo che le cellule si adagiassero sulla superficie. Sopra è stata applicata una benda composta da diversi strati di garza, cucita ai bordi della cicatrice.

Una parte della sospensione cellulare ottenuta è stata seminata in piastre Petri su pellicole sterili di Polypore tagliate secondo la forma delle piastre, l'altra parte su piastre Petri senza pellicola. La coltura è stata effettuata in terreno FAD, costituito da una miscela di DMEM e terreno F12 in rapporto 3:1, con l'aggiunta di siero fetale bovino al 10%, 5 μg/ml di insulina (Sigma), 0,5 μg/ml di idrocortisone emisuccinato (Sigma) e 10 μg/ml di fattore di crescita epidermico EGF (Istituto di Citologia RAS, San Pietroburgo). Il secondo e il terzo gruppo di ratti, composti ciascuno da 7 individui, sono stati operati 6 giorni dopo il primo. A questo punto, si erano formati strati multistrato dalla sospensione di cheratinociti seminati nelle piastre Petri, che sono stati trapiantati nei ratti. Il secondo gruppo è stato trapiantato con epidermociti su pellicola, il terzo con uno strato multistrato senza substrato. Dopo 7 giorni, gli strati multistrato di cheratinociti allogenici (MPALK) ottenuti, seminati sui film "Polypore", sono stati trapiantati in coltura direttamente sulla superficie della ferita. Sopra, il film, per evitarne la lacerazione, è stato fissato con una benda di garza multistrato e cucito alla cute dei ratti.

Prima di trapiantare i cheratinociti nel terzo gruppo di ratti cresciuti senza substrato, il PAC è stato separato dal fondo della piastra Petri trattandolo con dispasi, che ha la capacità di interrompere selettivamente i legami dermo-epidermici. Agendo su uno strato multistrato, la dispasi interrompe la connessione delle cellule dello strato basale con il fondo della piastra Petri e ha un effetto molto minore sulle connessioni intercellulari, il che rende possibile la "rimozione" completa dello strato. Il distacco dello strato cellulare multistrato con dispasi è stato effettuato come segue. Il terreno di trasporto è stato drenato dalle piastre Petri, gli strati cellulari sono stati lavati tre volte con un terreno nutritivo contenente antibiotici, in particolare gentamicina (0,2 mg/ml). Gli strati multistrato sono stati riempiti con una soluzione di dispasi allo 0,125% ("Sigma") e posti in un termostato, dove sono stati incubati a t = 37 °C per 20-30 minuti. La comparsa di un bordo bianco che si stacca lungo il perimetro dello strato è un indicatore dell'inizio del processo di distacco dai bordi e dal fondo della capsula di Petri. Pochi minuti dopo l'inizio del processo di distacco, la soluzione di dispasi è stata drenata e gli strati epiteliali sono stati lavati 2-3 volte con il terreno di coltura. Un pezzo di medicazione sterile "Lita-color", tagliato delle dimensioni del contenitore, è stato applicato sulla superficie dello strato epidermico, su cui è stato incollato lo strato separato dalla dispasi, staccato ulteriormente dal fondo del contenitore con una spatola. Utilizzando una pinzetta oculare, lo strato insieme al rivestimento del tovagliolo "Lita-color" (Russia) è stato staccato dal fondo della capsula di Petri e trasferito con cura sulla superficie preparata della cicatrice. I tovaglioli "Lita-color" contengono gentamicina ed esolina (estratto di collagene) che, inumidendosi con i resti del terreno di coltura e poi con una soluzione fisiologica, si gonfiano e diventano una moderna medicazione per ferite, offrendo una buona protezione dalle infezioni esterne e una rapida guarigione grazie alla struttura assorbente per l'umidità.

Bende di garza multistrato sono state applicate alle pellicole Polypore e ai tovaglioli Lita-color e cucite alla cute dei ratti per una migliore fissazione. Ogni ratto è stato posto in una gabbia separata per creare condizioni ottimali per il suo mantenimento e l'attecchimento dei cheratinociti trapiantati. Le bende dei ratti in cui è stata trapiantata la sospensione e lo strato multistrato di epidermociti rimossi mediante dispasi sono state inumidite con soluzione salina sterile più volte al giorno per creare le condizioni più favorevoli all'attecchimento delle cellule. Considerando che la pellicola Polypore era impermeabile all'acqua, le bende dei ratti del secondo gruppo non sono state inumidite, il che ha rappresentato uno dei vantaggi rispetto ai trapianti senza pellicole. Le bende sono state rimosse dopo 10 giorni. Il quadro clinico delle cicatrici dopo il trapianto di cellule differiva poco da quello delle cicatrici senza trapianto, fatta eccezione per il colore più rosato (dovuto alla dermoabrasione) e una maggiore desquamazione. Questo fatto suggerisce che, subito dopo la rimozione delle medicazioni con MPC, non si siano verificati cambiamenti nella cicatrice.

Prelievo di materiale bioptico dai ratti.

Dopo 1, 2, 5 e 9 mesi dal trapianto di cheratinociti allogenici di ratto su cicatrici levigate di ratti bianchi, il materiale è stato prelevato per l'esame istologico, citomorfologico e al microscopio elettronico. Campioni di cute di ratto normale e di cicatrice non sottoposta a trapianto di cellule sono stati prelevati come controllo. L'anestesia dei ratti è stata eseguita con etere.

Dopo l'anestesia, frammenti di tessuto cicatriziale sono stati prelevati dalle aree marcate in cui sono stati trapiantati i cheratinociti utilizzando un punch da biopsia di 2 mm di diametro e immersi in una soluzione di glutaraldeide al 2,5% per preparare il materiale all'esame al microscopio elettronico. I frammenti di tessuto prelevati per l'esame istologico sono stati immersi in una soluzione di formalina neutra al 10%, quindi sottoposti a filtrazione alcolica e inclusione in paraffina, per poi essere tagliati in sezioni ultrasottili e osservati al microscopio ottico.

Controllo I. Pelle normale di ratto.

Per evidenziare la differenza tra l'immagine microscopica della normale pelle cicatriziale di un ratto e le cicatrici presenti in determinati momenti dopo il trapianto di MPC, in tutte le fasi dello studio vengono mostrate fotografie e descrizioni delle stesse.

L'epidermide della pelle normale è composta da 7-9 strati di cellule. Lo strato corneo è di spessore moderato. In alcuni punti è costituito da 6-8 strati di scaglie cornee. Lo strato basale è rappresentato da cellule cilindriche con nuclei grandi, chiari e di forma regolare e numerosi nucleoli. Le connessioni desmosomiali tra le cellule e con la membrana basale sono chiaramente evidenti. Sotto la membrana basale ben definita, che presenta piccole escrescenze nello strato sottoepidermico, parallelamente ad essa si trovano delicati fasci di fibre di collagene ed elastina, tra cui fibroblasti allungati e piccoli vasi. Negli strati più profondi, fasci di fibre di collagene ed elastina giacciono in direzioni diverse. Tra questi si trovano numerosi vasi con pareti sottili dello stesso calibro, elementi cellulari (fibroblasti, mastociti, leucociti). Un gran numero di follicoli piliferi e ghiandole sebacee.

Controllo 2. Cicatrice di ratto, 2 mesi.

Quadro clinico. Le cicatrici sono di colore rosa pallido, desquamate, con croste persistenti in alcuni punti. La loro superficie si è ridotta a causa della contrazione delle fibre di collagene e ha raggiunto una dimensione di circa 3,0-3,5 cm ^. Gli annessi cutanei sono assenti.

Immagine microscopica. L'epidermide è composta da 3-5 strati di cellule, ripiegate, rappresentate da cellule basali arrotondate, una fila di cellule subulate, 1-2 file di cellule granulari con granuli di cheratoialina nello strato superiore, sono presenti aree di edema intracellulare. Lo strato corneo cambia in modo irregolare da molto sottile a ispessito. Si notano pieghe cicatriziali dovute alla (contrazione) del tessuto cicatriziale. Le pieghe penetrano fino allo strato papillare e creano l'impressione di papille. Il confine tra epidermide e derma è una linea retta. La membrana basale non è tracciata ovunque. Nella parte inferiore degli strati sottoepidermici e più profondi sono presenti vasi con una parete spessa e allentata, molti sono deserti, con stasi. Intorno ai vasi si accumulano macrofagi e fibroblasti. I macrofagi circondano gli eritrociti rilasciati dai capillari e li fagocitano. Negli strati più superficiali sono presenti piccoli capillari. Sotto l'epidermide, le fibre di collagene sono localizzate in modo lasso. Nello strato più profondo della cicatrice si trovano fasci di fibre di collagene grossolane, tra cui numerosi fibroblasti.

Cicatrice di ratto un mese dopo il trapianto di cheratinociti di ratto.

Quadro clinico. Le cicatrici sono rosa, la loro superficie è diminuita, soprattutto in diametro, ed è in media di 2,5-3 cm² ^. Sono assenti peli e ghiandole sebacee.

I dati dell'esame microscopico del materiale ottenuto da ratti con trapianto di MPaLK su pellicola e MPaLK senza substrato sono praticamente identici. Tuttavia, dal punto di vista puramente tecnico, lavorare con MPaLK senza substrato è molto più complicato e laborioso rispetto alla coltivazione di MPaLK su substrato; pertanto, nell'approfondire lo studio del trapianto di cheratinociti su cicatrici, abbiamo utilizzato il cambrico multistrato come base per la crescita ("substrati").

Immagine microscopica. Si nota un ispessimento dell'epidermide a 15-20 strati, quasi al centro dei quali i cheratinociti hanno una forma stretta, allungata, verticale e una disposizione compatta. Le cellule basali sono disposte in una linea irregolare. I loro nuclei sono chiari, grandi, arrotondati con uno o due nucleoli, il che indica la loro elevata attività sintetica e proliferativa. Il confine tra epidermide e derma è una linea retta. Lo strato spinoso è ben sviluppato, costituito da 3-5 strati di cellule arrotondate, con cellule a 2 nucleoli.

Immediatamente sotto la membrana basale si trovano fasci sottili e densi di fibre collagene, parallelamente a essi si trova un gran numero di vasi deserti, mentre le fibre collagene più profonde sono più grossolane, raccolte in fasci densi. Numerosi fibroblasti di grandi dimensioni, mastociti (2-3 nel campo visivo), macrofagi, leucociti e vasi deserti, le cui pareti sono lasse, sono circondati da fibre collagene lasse. In alcuni vasi si osserva stasi, diapedesi di elementi figurati. Intorno ai vasi si trovano fibroblasti e singoli linfociti. Gli annessi cutanei sono assenti.

Quando si trapianta una sospensione di cheratinociti su una cicatrice levigata, il quadro microscopico differisce dal precedente. Nella maggior parte degli animali, l'epidermide è sottile e composta da 5-6 strati di cellule. Lo strato inferiore è costituito da cellule di forma irregolare e poligonale con nuclei di forma rotonda-irregolare. Lo stato dello strato sottoepidermico è simile a quello del gruppo di animali senza trapianto MPALK.

In questo caso, si può parlare di un ritardo nei processi che accompagnano il trapianto cellulare o di una notevole perdita di cellule trapiantate in sospensione. Da qui la conclusione che la correzione delle cicatrici mediante il trapianto di cheratinociti in sospensione non sia appropriata.

Cicatrice di ratto 2 mesi dopo il trapianto di cheratinociti di ratto.

Quadro clinico. La cicatrice appare sottile e delicata. In alcuni punti si osservano desquamazione e chiazze squamose.

Immagine microscopica. Lo strato corneo è ispessito, in alcuni punti si osserva ipercheratosi. L'epidermide è ispessita ed è composta da 12-20 file di cellule. Il confine tra epidermide e derma è una linea retta. Le delicate fibre di collagene sotto l'epidermide sono piuttosto dense. Negli strati più profondi della cicatrice, si raccolgono in grandi fasci grossolani. Nello strato sottoepidermico si forma una nuova vascolarizzazione. Negli strati inferiori del tessuto cicatriziale, sono presenti numerosi vasi abbandonati, disposti parallelamente alla superficie dell'epidermide. Grandi fibroblasti sono distribuiti uniformemente nello spessore della cicatrice, e sono presenti numerosi macrofagi giganti, multi-ramificati.

Cicatrice di ratto 5 mesi dopo il trapianto di cellule epidermiche di ratto.

Quadro clinico. La cicatrice appare uniforme, liscia e senza desquamazione; sono presenti singoli peli, la cui densità è maggiore nella periferia della cicatrice, il che indica una crescita marginale dei follicoli piliferi all'interno della cicatrice e una nuova formazione di follicoli piliferi. L'area delle cicatrici continua a ridursi.

Immagine microscopica. L'epidermide è ancora spessa (15-20 strati, in alcuni punti fino a 30); negli strati superiori è ricca di granuli di cheratoialina. La membrana basale è chiaramente visibile. Al di sotto di essa, le fibre di collagene sono distese in modo lasso. Negli strati inferiori, il collagene è più consistente e compatto. Tra i fasci di collagene sono presenti numerosi capillari. Negli strati superiori, il numero di vasi sanguigni dispersi è diminuito. La giunzione tra epidermide e derma è leggermente ondulata. In alcuni punti, sono presenti profonde escrescenze epidermiche nel tessuto cicatriziale. Sono visibili vasi di nuova formazione tra le fibre di collagene. Compaiono singoli follicoli piliferi e ghiandole sebacee.

Cicatrice nel ratto 9 mesi dopo il trapianto di cellule MPA epidermiche di ratto.

Quadro clinico. Le cicatrici sono diventate significativamente più piccole rispetto ai periodi precedenti, con una superficie media di circa 1,5-2,0 cm² ^. Le cicatrici sono ricoperte in modo non uniforme da peli fini, soprattutto nella zona periferica. Permane una lieve desquamazione a lamina sottile.

Immagine microscopica.

L'epidermide si è assottigliata, è rappresentata da 6-8 file di cellule e la sua struttura ricorda quella dell'epidermide di un ratto normale, solo che la densità cellulare è di 1 mm superiore e le cellule sono più piccole. Lo strato basale è costituito da piccole cellule rotonde-cilindriche. La membrana basale è ben espressa, gli emidesmosomi sono chiaramente visibili. Si nota la presenza di escrescenze epidermiche nello strato sottoepidermico. Lo strato papillare è espresso lungo l'intera lunghezza della cicatrice. Questi dati indicano che a questo punto l'adesione dei cheratinociti trapiantati con i tessuti cicatriziali sottostanti è diventata molto più forte. Pertanto, la cura delle cicatrici nei pazienti sottoposti a trapianto di MPALK 9 mesi dopo il trapianto di MPC può essere tradizionale. Sotto l'epidermide, le fibre di collagene sono più delicate rispetto agli strati profondi. Sono comparsi numerosi vasi sanguigni, soprattutto quelli superficiali. Le pareti dei vasi più grandi sono ispessite. I follicoli piliferi e le ghiandole sebacee sono presenti in grandi quantità. L'immagine microscopica ricorda il tessuto dermico.

Risultati del lavoro sperimentale e loro discussione.

Nel corso di questo lavoro, cheratinociti di varie forme sono stati trapiantati su cicatrici cutanee di ratto create artificialmente dopo un intervento di dermoabrasione: su rivestimenti per ferite, come sospensione su batuffolo di cotone e come strato multistrato senza substrato. Il lavoro è stato condotto con l'obiettivo di ottenere dati morfologici sull'effetto dei cheratinociti allogenici trapiantati sulle cicatrici, nonché di determinare le opzioni di trapianto ottimali.

Si è constatato che tutti e tre i metodi di trapianto sono fattibili, ma il trapianto dell'MPAC senza substrato è una procedura molto laboriosa, durante la quale l'MPAC può subire lesioni, il che influisce sui risultati del trapianto. Inoltre, questo metodo di trapianto esclude interventi su ampie superfici.

Il trapianto di sospensione di cheratinociti è un metodo molto più conveniente, non richiede una coltivazione cellulare a lungo termine ed è semplice nella versione che proponiamo, utilizzando blocchetti sterili di cambrico, le cui dimensioni corrispondono a quelle delle cicatrici. Il ritardo nell'effetto terapeutico del trapianto di una sospensione cellulare di circa un mese rispetto al trapianto di cheratinociti su un rivestimento per ferite non è significativo, con una durata del trattamento di molti mesi. È noto che quando si trapiantano cheratinociti su pazienti ustionati, la trasformazione della struttura cutanea avviene gradualmente e nell'arco di diversi anni. Il trapianto di colture di cheratinociti su rivestimenti per ferite è il metodo più conveniente e promettente, ma anche significativamente più costoso. Inoltre, attualmente è necessaria la ricerca di opzioni di rivestimento più avanzate, che siano flessibili, igroscopiche, con proprietà batteriostatiche o battericide e biologicamente neutre per le cellule. Il film "Polypor", una versione intermedia del rivestimento per ferite in film domestico, nonostante alcune imperfezioni, ci ha permesso di studiare sperimentalmente il trapianto di cheratinociti di ratto su cicatrici e di trarre conclusioni sull'efficacia di questa direzione di trattamento delle cicatrici.

Gli autori che hanno trapiantato MPC su ustioni hanno notato che durante la prima settimana dopo il trapianto di uno strato multistrato di cheratinociti su ferite disinfettate, l'epidermide si è ispessita e stratificata. Tutti gli strati dell'epidermide erano chiaramente visibili. È interessante notare che il numero di strati cellulari nei trapianti era del 10-30% maggiore rispetto alle biopsie cutanee. Gli autori hanno notato la comparsa di granuli di cheratoialina il quinto giorno dopo il trapianto di MPC e la membrana basale e gli emidesmosomi già il terzo giorno.

J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) hanno riscontrato che nelle fasi iniziali del trapianto di cheratinociti allogenici (MPC) in pazienti con difetti cutanei a tutto spessore post-ustione, la connessione tra derma ed epidermide è molto debole e si presenta come una linea retta, con l'assenza dello strato papillare. Entro la fine del secondo mese, iniziano a formarsi papille superficiali e annessi cutanei, e la connessione tra derma ed epidermide si rafforza. I dati della letteratura indicano che il trapianto di cheratinociti allogenici sulle ferite nei pazienti ustionati è un metodo promettente. Nonostante il rigetto dei cheratinociti allogenici si verifichi, secondo diversi autori, entro 10 giorni-3 mesi, essi svolgono comunque un ruolo nella guarigione della superficie della ferita, secernendo fattori di crescita e chiudendo meccanicamente il difetto. Si ritiene che le MPALC abbiano una ridotta attività antigenica, poiché durante la coltivazione in vitro perdono le cellule di Langerhans, che consentono loro di sopravvivere a lungo nell'organismo del ricevente. Inoltre, una coltura allogenica ottenuta dalla pelle di giovani persone sane ha un potenziale biologico incomparabilmente maggiore rispetto a una coltura autologa di pazienti dopo una lesione.

L'obiettivo principale del nostro studio era scoprire se i cheratinociti allogenici attecchiscono sulle cicatrici e quali cambiamenti si verificano nel tessuto cicatriziale sotto l'influenza di un "rivestimento della ferita" biologicamente attivo. In caso di risultato positivo, sviluppare la tecnologia più efficace e meno laboriosa per quest'area della medicina riabilitativa.

I dati ottenuti erano per molti aspetti simili a quelli presenti in letteratura sui cambiamenti morfologici che si verificano nell'epidermide umana dopo il trapianto di cheratinociti allogenici su ferite da ustione. Tuttavia, vi sono anche differenze significative, sia in termini di substrato morfologico su cui avviene il trapianto, sia in termini di tecnologia. Pertanto, il processo di formazione della membrana basale e delle connessioni dermo-epidermiche (emidesmosomi, papille) avviene in una fase successiva rispetto al trapianto di cheratinociti su superfici di ferite senza alterazioni cicatriziali. Apparentemente, ciò si verifica a causa della minore nutrizione del tessuto cicatriziale rispetto al derma o alla fascia muscolare. Una cicatrice, soprattutto se di vecchia data, è un tessuto connettivo denso con un numero molto ridotto di vasi, mentre il fondo di una ferita da ustione è un tessuto di granulazione ricco di vasi. Pertanto, è ovvio che le condizioni in cui avvengono il trapianto e l'attecchimento dei cheratinociti sono completamente diverse. Quanto più vascolarizzata è l'area del trapianto cellulare, tanto più facile è il processo di attecchimento. Da questo postulato deriva la conclusione sulla preferenza di lavorare su cicatrici giovani, in cui il tessuto connettivo è ancora piuttosto lasso e ricco di vasi.

In seguito a questo lavoro sperimentale è stato dimostrato che:

1. È possibile il trapianto di MPALK sulle cicatrici.
2. Il metodo ottimale di trapianto è il trapianto di cheratinociti sulla copertura della ferita.
3. La superficie della cicatrice deve essere lucidata utilizzando una dermoabrasione laser chirurgica o una fresa di Schumann.
4. Sotto l'azione di MPALK si verifica una rapida epitelizzazione della superficie levigata della cicatrice.
5. Quanto più il tessuto cicatriziale è vascolarizzato, cioè più giovane è la cicatrice, tanto migliori saranno i risultati del trapianto di cheratinociti.
6. Sotto l'azione dei cheratinociti trapiantati, il tessuto cicatriziale si trasforma gradualmente, trasformandosi in un tessuto simile al derma (tessuto cicatriziale più lasso con annessi cutanei).
7. Graduale allentamento del tessuto cicatriziale, a partire dallo strato sottoepidermico. La sua vascolarizzazione migliora, i fasci di fibre collagene nelle parti superiore e inferiore della cicatrice assumono una disposizione più allentata rispetto al tessuto cicatriziale senza trapianto di cellule. Compaiono follicoli piliferi e ghiandole sebacee. L'epidermide, nella sua struttura, dopo aver superato la fase di ipertrofia, si avvicina all'epidermide della pelle normale.
8. I cambiamenti osservati sono associati ai fattori di crescita e alle citochine secrete dai cheratinociti, che, migliorando il trofismo del tessuto cicatriziale, favoriscono la sua trasformazione da tessuto fibroso grossolano a tessuto più lasso, con conseguente miglioramento dell'aspetto della cicatrice.

Pertanto, sulla base di questo studio, si può concludere che i cheratinociti trapiantati hanno un effetto benefico sul tessuto cicatriziale, il che può avere implicazioni pratiche per la riabilitazione dei pazienti con vari tipi di cicatrici.

Questo lavoro sui ratti ci ha anche consentito di formulare i requisiti per le coperture delle ferite su cui vengono coltivati i cheratinociti.

Le medicazioni delle ferite dovrebbero essere:

• biocompatibile con le cellule,
• traspirante,
• avere una base elastica e modellante,
• essere idrofilo,
• poiché gli additivi medicinali contengono farmaci antibatterici e antiossidanti che non sono tossici per le cellule coltivate.

Risultati clinici del trattamento biotecnologico delle cicatrici.

In precedenza, N. Carver et al. (1993) hanno scoperto che le medicazioni occlusive promuovono al meglio l'adesione alla ferita e la sopravvivenza dei cheratinociti, ma non consentono la formazione di epidermide stratificata (matura). Un ambiente ventilato è necessario per la formazione di epidermide stratificata. Pertanto, dopo l'adesione di uno strato multistrato, è stato proposto di rimuovere la medicazione occlusiva dopo 7-10 giorni e trattare le ferite con medicazioni asciutte o unguenti idrosolubili. Si può affermare che la qualità e le proprietà del "substrato" su cui vengono coltivate le cellule siano un punto molto importante per l'efficacia del trapianto di materiale cellulare e, di conseguenza, per i risultati del lavoro dei medici. Tuttavia, oggi non esiste una medicazione ideale per le ferite, nonostante l'abbondanza di opzioni proposte (pelle artificiale, tessuto non tessuto in carbossimetilcellulosa, rivestimenti in fibrina, film semipermeabili in poliuretano). Un punto importante in questa questione è il costo dei “substrati” (speciali rivestimenti per le ferite), poiché il loro costo elevato aumenta il costo complessivo del trattamento biotecnologico.

L'efficacia delle tecnologie cellulari è stata dimostrata fino ad oggi, ma purtroppo queste tecnologie sono molto costose, soprattutto nei paesi in cui la produzione industriale di composizioni cellulari non è ancora stata avviata. Tuttavia, paesi come gli Stati Uniti hanno da tempo avviato un'industria per la produzione di materiale cellulare per il trapianto di ustioni. In particolare, l'azienda BioSurface Technology Inc., dal 1989, ha coltivato 37.000 strati di cheratinociti multistrato, utilizzati per trattare 240 pazienti in 79 paesi in tutto il mondo (R. Odessey, 1992), mentre 1 cm² di coltura ^cellulare costa circa 7-8 dollari USA.

Le tecnologie per il trattamento di varie malattie e problemi della pelle presentano numerose differenze, ma qualsiasi trattamento cellulare si basa sull'ottenimento di materiale cellulare di alta qualità e sul suo trapianto.

Questo processo consiste nei seguenti passaggi:

• prelevare la pelle dalle vittime (o dai donatori),
• trasporto di lembi cutanei a un centro biotecnologico,
• isolamento delle cellule dello strato basale e loro proliferazione,
• crescita di strati di cheratinociti multistrato (MLK).
• trapianto di colture cellulari.

Il problema principale nell'esecuzione del trattamento mediante trapianto di foglietti di cheratinociti multistrato è la necessità di cellule vitali in tutte le fasi del trapianto. I frammenti di pelle per l'isolamento di cellule autologhe o allogeniche devono essere il più sottili possibile, poiché in questo caso sono più facili da separare con metodi meccanici ed enzimatici e da cui si ottiene una sospensione di cellule vive per la coltura. Possono essere ottenuti mediante taglio con un dermatomo o utilizzando la pelle delle palpebre, del prepuzio e della superficie interna della spalla. Poiché le cellule sono sensibili agli alogeni (cloro, iodio) e al perossido di idrogeno, non possono essere utilizzate durante la lavorazione della pelle durante il prelievo del materiale.

La resa quantitativa e qualitativa delle cellule degli innesti cutanei e l'efficienza della loro coltivazione dipendono anche dallo stato di salute e dall'età del donatore. Inoltre, le biopsie cutanee devono essere consegnate il più rapidamente possibile e in condizioni appropriate (ambiente, temperatura) a un laboratorio certificato e accreditato a tale scopo.

Per la conservazione e il trasporto dei lembi cutanei è possibile utilizzare il terreno di Eagle o il terreno 199 con l'aggiunta del 10% di siero bovino, il terreno DMEM con l'aggiunta del 5% di siero fetale bovino e antibiotici.

Nel laboratorio di citologia, la biopsia cutanea viene prima divisa meccanicamente in piccoli pezzi, che poi vengono processati utilizzando enzimi: tripsina, collagenasi, dispasi, ecc.

Sotto l'azione degli enzimi, i desmosomi vengono distrutti e i cheratinociti vengono rilasciati nel terreno di coltura sotto forma di singole cellule o aggregati costituiti da un numero variabile di cellule. Per la coltura vengono utilizzati solo cheratinociti basali, che vengono coltivati su terreni di coltura speciali in termostati contenenti il 5% di CO2, in piastre Petri o in fiasche a t = 37 °C. Già dopo 48 ore, si osserva la formazione di colonie di cheratinociti, che si fondono gradualmente formando un monostrato. Dopo aver ricevuto un numero sufficiente di cellule, la sospensione risultante viene seminata su medicazioni per ferite preparate a tale scopo e poste in piastre Petri. Dalla sospensione si forma prima un monostrato e poi uno strato multistrato di cheratinociti. Le fasi del processo di coltura dei cheratinociti sono illustrate schematicamente in Figura 12 (33,43,54,65).

La formazione di uno strato multistrato di cheratinociti idoneo al trapianto richiede solitamente 7-10 giorni. Talvolta questo periodo è più lungo, a seconda della qualità del materiale di partenza (età, stato di salute del donatore, correttezza del prelievo, qualità del terreno di coltura utilizzato, ecc.). Se lo strato multistrato cresce eccessivamente, sulla sua superficie possono comparire cellule con fenomeni di apoptosi non idonee al trapianto. Le piastre Petri con strati di cheratinociti multistrato (MLK) coltivati su teli di copertura delle ferite vengono consegnate alla clinica in appositi contenitori a una temperatura di almeno +15 °C.

Metodo Green modificato per la crescita di MPC

Nel nostro lavoro, abbiamo utilizzato il cambrico multistrato come rivestimento per ferite, abbandonando i film "Polypor" con cui avevamo iniziato a lavorare nell'esperimento sui ratti. Abbiamo quindi coltivato strati di cheratinociti multistrato su cambrico pre-sgrassato e sterile, sebbene anche questo non sia un rivestimento ottimale per ferite.

Gli studi clinici sono stati condotti su volontari nel rispetto degli standard etici necessari: firma di un accordo e consenso informato.

1. È stata utilizzata una coltura di cheratinociti del paziente stesso (autologhi) e di cheratinociti conservati in banca (allogenici).
2. I cheratinociti dei pazienti sono stati ottenuti da un pezzo di pelle tagliato dalla parte interna della parte superiore delle loro braccia.
3. L'intervento di dermoabrasione delle cicatrici è stato eseguito utilizzando termocauterizzazione, dischi rotanti e laser all'erbio.
4. Sono stati selezionati gruppi di pazienti con cicatrici normotrofiche, ipotrofiche e ipertrofiche.

Il processo tecnologico per l'applicazione della tecnologia cellulare al fine di migliorare l'aspetto delle cicatrici cutanee si è articolato nelle seguenti fasi:

1. Selezione dei pazienti.
2. Spiegazioni sull'essenza del trattamento, sui tempi per ottenere i risultati attesi, sulla firma del contratto e sul consenso informato.
3. Prescrivere ai pazienti 2-3 settimane prima dell'intervento chirurgico 1 compressa di selmevit 3 volte al giorno e 1 compressa di zinctheral 3 volte al giorno.
4. Prelievo di un pezzo di pelle lungo 2,0 cm e largo 0,7-1,0 cm dalla superficie interna della spalla, in alto, quasi nella parte inferiore della regione ascellare, per ottenere cheratinociti autologhi.
5. Nei casi in cui i pazienti si rifiutavano di sottoporsi all'isolamento dei propri cheratinociti a causa della possibilità di una cicatrice lineare sulla superficie interna della spalla, il materiale cellulare veniva prelevato da una banca cellulare (cheratinociti allogenici).
6. I cheratinociti sono stati isolati e coltivati in un laboratorio certificato per questo tipo di lavoro.
7. Dopo aver ottenuto una quantità sufficiente di MPC da trapiantare sulle cicatrici, è stato fissato un giorno per l'operazione in clinica, dove il materiale è stato portato in appositi contenitori in piastre di Petri.
8. È stata eseguita una dermoabrasione della cicatrice, l'emostasi, la superficie lucidata è stata lavata con una soluzione salina sterile, asciugata e le cellule staminali pluripotenti (MPC) sono state trapiantate su una base di cambrico sterile, posizionata "verso il basso". In altre parole, le cellule che si trovavano in alto nella MPC si sono rivelate più basse, adiacenti alla superficie lucidata.
9. Sulla parte superiore è stata applicata una pellicola sterile, fissata alla pelle con una benda elastica o un cerotto elastico Omnifix. In alternativa alla pellicola, è possibile utilizzare medicazioni per ferite indifferenti contenenti silicone, ad esempio Mepitel, Mepiform o fogli di gel di silicone.

Dopo 5-7 giorni, la pellicola o il rivestimento in silicone vengono rimossi. A questo punto, tutti i cheratinociti dovrebbero essersi depositati sulla cicatrice levigata e aderirvi.

10. L'ambiente umido che si crea sotto la pellicola e il rivestimento in silicone contribuisce attivamente a questo risultato. La cambrica che rimane sulla cicatrice da questo punto in poi può essere imbevuta di curiosina o gel di chitosano. Di conseguenza, al secondo giorno si forma una crosta densa che, per maggiore comodità del paziente, può essere fissata al meglio con un cerotto elastico e traspirante, come Omnifix. La crosta traspirante consente all'epidermide formata di differenziarsi e maturare.

A seconda del tipo di cicatrice e della profondità della levigatura, il bendaggio viene rigettato dopo 8-10 giorni. A questo punto, l'epidermide presenta il 30-40% di strati cellulari in più rispetto alla pelle normale. La membrana basale non è ancora formata. I cheratinociti dell'epidermide ispessita secernono numerose molecole biologicamente attive nel tessuto cicatriziale.

Il successo del trattamento biotecnologico delle cicatrici dipende in larga misura dal metodo di cura adottato nel periodo postoperatorio. Le colture cellulari rappresentano un tipo di copertura "delicata" per le ferite e, nelle fasi iniziali del trapianto, le cellule incapsulate possono essere facilmente staccate dai tessuti sottostanti. Pertanto, si consiglia ai pazienti di maneggiare la cicatrice con cura dopo l'intervento. Per 8-9 mesi, non strofinare e trattare delicatamente con acqua fredda bollita per evitare di strappare la sottile epidermide neoformata, che non ha un legame stretto con i tessuti sottostanti.

Nota.

Prima dell'intervento chirurgico e durante la dermoabrasione, è consentito l'uso di antisettici e ossidanti alogenati (iodopirone, suliodopirone, iodinolo, iodinato, clorexidina, perossido di idrogeno); prima del trapianto cellulare, invece, è severamente controindicato a causa del loro effetto citotossico. Anche il blu di metilene e il verde brillante sono tossici per le cellule.

Per evitare infezioni, soprattutto quando si lavora su cicatrici ipertrofiche, il campo chirurgico può essere trattato con solfato di neomicina, polimixina o gentamicina. Questi non hanno effetto citotossico sui cheratinociti.

Grazie a questo trattamento si ottiene un triplice effetto.

1. Livellamento della superficie della cicatrice.
2. Creazione di uno strato di nuova epidermide di spessore normale al di sopra di essa.
3. Trasformazione del tessuto cicatriziale in tessuto simile al derma grazie all'azione di citochine, fattori di crescita e altre molecole biologicamente attive secrete dalle cellule trapiantate e stimolate da cheratinociti, fibroblasti e macrofagi.

La cicatrice diventa meno evidente, più elastica, al suo interno compaiono pori e peli vellus e la pigmentazione può essere ripristinata grazie alla presenza di melanociti nell'IPC.

Tuttavia, tutti questi aspetti positivi della cicatrice non si manifestano immediatamente. A questo proposito, è necessario avvertire i pazienti che il processo di trasformazione del tessuto cicatriziale in tessuto dermico avviene lentamente e che il risultato ottimale di tale trattamento può essere atteso non prima di 10-14 mesi. Subito dopo la rimozione delle medicazioni, le superfici lucidate presentano una policromia pronunciata, tanto più luminosa quanto più profonda è stata la lucidatura. Il danno cutaneo minimo si osserva durante la lucidatura delle cicatrici normotrofiche con un laser all'erbio. Il colore delle cicatrici e della pelle circostante viene ripristinato entro 3-8 settimane. Nonostante tali precauzioni, a volte si verifica iperpigmentazione postoperatoria, che può scomparire spontaneamente entro pochi mesi.

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