Lavoro sperimentale sul trapianto di cheratinociti allogenici su cicatrici create artificialmente di ratti bianchi

Il desiderio di utilizzare il potenziale cellulare e la necessità di cercare nuovi metodi efficaci per migliorare l'aspetto estetico delle cicatrici ha portato all'idea di provare a studiare la possibilità del trapianto di cheratinociti su superfici cicatrizzanti.

Al fine di dimostrare la possibilità di utilizzare la cultura cheratinociti per migliorare l'aspetto delle cicatrici lavoro sperimentale è stato fatto su topi da laboratorio bianchi, che sono stati creati superficie cicatrice. Il modello del ruminare dei ratti è stato ottenuto a seguito della guarigione delle ferite inflitte artificialmente sul dorso, lungo la spina dorsale. I ratti sono stati tagliati pezzi della stessa pelle, dimensioni di 2x3 cm. Dopo 2,5 mesi dopo l'intervento i ratti "simulazione cicatrici" è stato condotto un intervento chirurgico dermoabrasione (la rimozione degli strati superiori via ignioperation rumine) e cheratinociti allogeniche trapiantati, isolato dalla pelle di giovani ratti 2-4 giorni dopo la nascita.

L'isolamento e la crescita di epidermociti di ratto sono stati effettuati nel laboratorio di tecnologie cellulari dell'Istituto di Citologia RAS della seguente tecnologia.

La pelle è stata lavata in soluzione salina di Hanks contenente 200 U / ml di gentamicina, tagliata a pezzi piccoli con un'area di 0,2-0,5 cm ². I cubetti di pelle sono stati incubati in una soluzione allo 0,5% di disaspasi in una soluzione equilibrata tamponata con fosfato salino a 37 ° C per un'ora. I pezzi sono stati quindi trasferiti alla soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco e l'epidermide è stata separata dal derma. L'epidermide è stata incubata in una soluzione di tripsina allo 0,125% per 10-15 minuti con agitazione a 50 rpm, dopo di che l'azione dell'enzima è stata interrotta mediante aggiunta di siero bovino fetale al 5%. Un terzo della sospensione cellulare ottenuta è stato utilizzato nella sua forma pura per una delle varianti del trapianto in cicatrici, il secondo terzo è stato coltivato su pellicole biocompatibili per uso domestico "Polypor", il terzo - su piastre di Petri senza substrato. L'operazione della dermoabrasione delle cicatrici ottenute nei ratti con successivo trapianto di epidermociti di ratto su di esse è stata effettuata sotto anestesia con etere utilizzando un cauterio termico.

Il primo gruppo di ratti dopo dermoabrasione lucido, lavati con soluzione salina e di superficie essiccato rumine sterili pezzi di prato, che è stato depositato sovrapposte criptato slurry ratto allogenico epidermotsitov ad una concentrazione di 1,5 milioni di cellule per 1 ml (secondo l'Istituto di citologia). I pezzi di Batistovye si adattano alla cicatrice lucidata in modo che le cellule si trovino sulla superficie della cicatrice. Sulla parte superiore è stata cucita una benda di diversi strati di garza, che è stata cucita ai bordi della cicatrice.

Parte della sospensione cellulare risultante è stata placcata in piastre di Petri su pellicole sterili Polypore tagliate a forma di tazze, l'altra parte su piastre di Petri senza pellicola. La coltivazione è stata effettuata in un terreno FAD costituito da una miscela di DMEM e F12 in un rapporto di 3: 1. Con l'aggiunta del 10% di siero bovino fetale, 5 μg / ml di insulina (Sigma), 0,5 μg / ml di idrocortisone emisuccinato (Sigma). 10 μg / ml di fattore di crescita epidermico EGF (Institute of Cytology RAS, San Pietroburgo). Il secondo e il terzo gruppo di ratti con 7 individui sono stati operati 6 giorni dopo il primo. A questo punto, strati di multistrato sono stati formati dalla sospensione dei cheratinociti seminati in piastre di Petri, che sono stati trapiantati nei ratti. Il secondo gruppo è stato trapiantato con epidermociti sul film, il terzo gruppo - con uno strato multistrato senza substrato. Dopo 7 giorni, gli strati multistrato di cheratinociti alogici (MPALK), seminati su pellicole Polypore, sono stati trapiantati dalla coltura direttamente sulla superficie della ferita. Sopra, il film, al fine di evitare il suo strappo, è stato fissato con una garza multistrato e cucito sulla pelle dei topi.

Prima del trapianto cheratinociti terzo gruppo di ratti, coltivati senza il substrato, producendo una separazione di PAC dal fondo del trattamento piatto Petri dispasi, avendo la capacità di rompere selettivamente la comunicazione dermo-epidermica. Sotto l'azione di un dispasi serbatoio multistrato distrugge il collegamento dello strato di cellule basali al fondo del piatto Petri e, in misura molto minore, colpisce la comunicazione intercellulare, che rende possibile "rimuovere" l'intero livello. Il distacco dello strato cellulare multistrato dalla disposizione è stato effettuato come segue. Il mezzo di trasporto è stato scaricato dalle piastre di Petri, gli strati di cellule sono stati lavati tre volte con un mezzo nutriente contenente antibiotici, in particolare gentamicina (0,2 mg / ml). I letti a più strati sono stati versati in una soluzione di dispersione allo 0,125% ("Sigma") e posti in un termostato, dove sono stati incubati a t = 37 ° C per 20-30 minuti. L'aspetto di una corolla bianca che si sfalda dalla periferia della formazione è un'indicazione dell'inizio del processo di separazione dai bordi e dal fondo della capsula di Petri. Pochi minuti dopo l'inizio del processo di separazione, la soluzione di disaspase si è fusa, gli strati epiteliali sono stati lavati 2-3 volte con terreno. Sulla stata applicata la superficie dello strato epidermico, tagliati a misura tazza piece medicazioni sterili "Leith-colore, che viene scisso separato dispasi formazione, ulteriormente delaminazione del fondo della tazza con una spatola. Usando una pinzetta oftalmiche strato insieme con il rivestimento del tovagliolo" Leith-colore "(Russo ) rotto dal fondo di una capsula di petri e con attenzione trasferito alla superficie preparata della cicatrice. Tovaglioli "Lita-colore" contiene nella sua composizione e eksolin gentamicina (estratto di collagene), che quando bagnato ambiente resta germogli nel futuro soluzione salina Sem si gonfiò e divenne rivestimento ferita moderna che offre una buona protezione dalle infezioni esterne e rapida guarigione a causa di bagnatura incipiente con la struttura.

I film Polyprop e i tovaglioli Lita sono stati stratificati con bende di garza che sono state cucite sulla pelle dei ratti per una fissazione più duratura. Ogni ratto è stato piantato in una gabbia separata, per creare condizioni ottimali per il suo mantenimento e l'attecchimento dei cheratinociti trapiantati. Fasce ratti che trapiantati sospensione e multistrato serbatoio epidermotsitov colpo dispasi, tutti i giorni più volte al giorno, inumidito con soluzione salina sterile per creare le condizioni più favorevoli per l'attecchimento delle cellule. Considerando che il film "Polypor" era impermeabile all'acqua, i ratti del secondo gruppo non inumidivano le medicazioni, che era uno dei vantaggi rispetto ai trapianti senza film. Dopo 10 giorni, le bende sono state rimosse. Il quadro clinico delle cicatrici dopo il trapianto cellulare differiva poco dalle cicatrici senza trapianto, tranne che per una colorazione più rosa (dovuta alla dermoabrasione) e una maggiore desquamazione. Questo fatto suggerisce questo. Immediatamente dopo la scomparsa delle coperture delle ferite con IPC, non si sono verificati cambiamenti nel rumine.

Prendendo biopsia nei ratti.

Dopo 1, 2, 5 e 9 mesi dopo il trasferimento dei cheratinociti di ratto alogico alle cicatrici macinate dei ratti bianchi, il materiale è stato prelevato per esame istologico, citomorfologico ed al microscopio elettronico. Come campioni di controllo della normale pelle di ratto e cicatrice sono stati prelevati senza trapianto di cellule. L'anestesia nei ratti è stata eseguita con l'anestesia dell'etere.

Dopo l'anestesia, dalle aree marcate, in cui sono stati trapiantati i cheratinociti, un piercer per biopsia con un diametro di 2 mm. I pezzi di tessuto cicatriziale sono stati prelevati e posti in una soluzione di glutaraldeide al 2.5% per preparare il materiale per la microscopia elettronica. Pezzi di tessuto prelevati per l'esame istologico sono stati collocati in una soluzione al 10% di formalina neutra, seguita da cablaggio attraverso spiriti e versamento in paraffina, seguita dal taglio di sezioni ultrasottili e dalla loro visualizzazione in microscopi ottici.

Controllo I. Pelle di topo normale.

Per vedere la differenza tra l'immagine microscopica della normale pelle cicatrizzata di ratti e cicatrici in alcuni momenti dopo il trapianto di IPC, vengono mostrati fotografie e descrizioni a tutti gli stadi di questo studio.

L'epidermide della pelle normale è composta da 7-9 strati di cellule. Strato corneo di spessore moderato. In posti consiste di 6-8 strati di squame cornea. Lo strato basale è rappresentato da cellule di forma cilindrica con grandi nuclei chiari, regolari e diversi nucleoli. Le connessioni desmosomiche tra le cellule e la membrana basale sono chiaramente espresse. Sotto una membrana basale ben marcata, che ha piccole escrescenze nello strato subepidermico, parallelamente ad essa giacciono delicati fasci di fibre di collagene ed elastina, tra cui una forma allungata di fibroblasti, piccoli vasi. Negli strati più profondi, i fasci di fibre di collagene ed elastina si trovano in direzioni diverse. Tra questi ci sono molte navi con pareti sottili dello stesso calibro, elementi cellulari (fibroblasti, mastociti, leucociti). In un gran numero di follicoli piliferi, ghiandole sebacee.

Controllo 2. Cicatrice di un topo di 2 mesi.

Quadro clinico Cicatrici rosa pallido, con peeling, in alcuni punti le croste rimangono. La loro superficie è diminuita a causa della contrazione delle fibre di collagene e diventa circa 3,0-3,5 cm ^:. Gli allegati della pelle sono assenti.

Foto al microscopio L'epidermide consiste di 3-5 strati di cellule, piegate, rappresentate da cellule basali di forma arrotondata, una fila di subulati, 1-2 file di granuli con grani di cheratogialina nello strato superiore, ci sono sezioni di edema intracellulare. Lo strato corneale viene modificato in modo eterogeneo da molto sottile a ispessito. C'è un ripiegamento del rumine dovuto alla (contrazione) del tessuto cicatriziale. Le pieghe penetrano nello strato papillare e danno l'impressione di papille. Il confine tra l'epidermide e il derma è una linea retta. La membrana basale non può essere rintracciata ovunque. Nella parte più bassa degli strati subepidermalny e più profondi - le navi con un muro spesso, allentato, molti hanno abbandonato, con fenomeni di stasi. Intorno alle navi - un gruppo di macrofagi, fibroblasti. I macrofagi circondano gli eritrociti che emergono dai capillari e li fagocitano. Negli strati più superficiali - piccoli capillari. Sotto l'epidermide, le fibre di collagene sono sciolte. Nello strato più profondo del rumine - fasci grossolani di fibre di collagene tra cui ci sono molti fibroblasti.

Cicatrici di un ratto un mese dopo il trapianto di cheratinociti di ratti di ratto MPAl.

Quadro clinico Cicatrici rosa, la loro area è diminuita, soprattutto di diametro e medie di 2,5-3 cm ². Ghiandole sebacee e dei capelli sono assenti.

Questi esame microscopico del materiale ottenuto da ratti con trasferimento MPAlK MPAlK sulla pellicola e il substrato, senza sostanzialmente identica. Tuttavia, tecnicamente, il lavoro con MPAlK supportato molto più difficile e laboriosa che quando coltivate MPAlK sul substrato, quindi l'ulteriore studio del problema sul trapianto kertainotsitov cicatrici abbiamo usato come base per la coltivazione ( "substrato") prato strati.

Foto al microscopio C'è un ispessimento dell'epidermide a 15-20 strati, quasi al centro del quale i cheratinociti hanno una forma stretta, allungata, verticale e una disposizione compatta. Le cellule basali sono disposte in una linea irregolare. I loro nuclei sono leggeri, grandi, di forma rotonda con uno o due nucleoli, che indica la loro elevata attività sintetica e proliferativa. Il confine tra l'epidermide e il derma è una linea retta. Lo strato spinoso è ben sviluppato, consiste di 3-5 strati di cellule di forma rotonda, ci sono 2 cellule di nucleolo.

Immediatamente sotto la membrana basale - fasci sottili di fibre di collagene localizzati in modo denso, in parallelo ad essi un gran numero di vasi vuoti, le fibre di collagene più profonde sono più grossolane, raccolte in fasci densi. Molti grandi fibroblasti, mastociti (2-3 nel campo visivo), macrofagi, leucociti e vasi vuoti, le cui pareti sono allentate, intorno a loro sono fibre di collagene sciolte. In alcune navi - stasi, diapedesis di elementi uniformi. Intorno alle navi - fibroblasti, singoli linfociti. Gli allegati della pelle sono assenti.

Quando una sospensione di cheratinociti viene trapiantata in una cicatrice lucidata, l'immagine microscopica differisce da quella precedente. Nella maggior parte degli animali - l'epidermide è sottile, costituita da 5-6 strati di cellule. Lo strato inferiore è costituito da cellule di forma irregolare, poligonale con nuclei arrotondati di forma irregolare. La condizione dello strato subepidermico è simile a quella del gruppo di animali senza trapianto.

In questo caso, si può parlare sia di ritardo dei processi che accompagnano il trapianto di cellule, sia di una grande perdita di cellule trapiantate sotto forma di sospensione. Quindi, una conclusione è stata fatta che la correzione delle cicatrici da trapianto di cheratinociti sotto forma di sospensione è inappropriata.

Cicatrici del ratto 2 mesi dopo il trapianto di cheratinociti di ratti di ratto MPAl.

Quadro clinico La cicatrice sembra sottile, tenera. In posti c'è un ecdysis, scale.

Foto al microscopio Lo strato corneo è ispessito, in posti - giperkeratoz. L'epidermide è ispessita, si compone di 12-20 file di cellule. Il confine tra l'epidermide e il derma è una linea retta. Delicate fibre di collagene sotto l'epidermide giacciono piuttosto strettamente. Negli strati più profondi del rumine vengono raccolti in grossi fasci grossolani. Nello strato subepidermico appare una nuova formazione di vasi. Negli strati inferiori del tessuto cicatriziale - molti vasi vuoti, situati parallelamente alla superficie dell'epidermide. I grandi fibroblasti sono distribuiti uniformemente nello spessore del rumine, ci sono macrofagi giganti, sfaccettati e molti.

Cicatrici del ratto 5 mesi dopo il trapianto della MP degli spermociti di ratto.

Quadro clinico La cicatrice sembra liscia, liscia senza desquamazione, ci sono singoli capelli, la loro densità è maggiore sulla periferia delle cicatrici, che indica la crescita marginale dei follicoli piliferi nella cicatrice e la formazione dei follicoli piliferi. L'area delle cicatrici continua a diminuire.

Foto al microscopio L'epidermide è ancora spessa (15-20 strati, a volte fino a 30) negli strati superiori è piena di grani cheratogialinici. La membrana basale è chiaramente visibile. Sotto le sue fibre di collagene giacciono sciolte. Negli strati inferiori il collagene è più potente e ben confezionato. Tra i fasci di collagene ci sono molti capillari .. Negli strati superiori il numero di vasi vuoti è diminuito. L'epidermide e il derma sono leggermente ondulati. Vi sono profonde escrescenze epidermiche nel tessuto cicatriziale. Tra le fibre di collagene sono visibili vasi appena formati. Appare singoli follicoli piliferi e ghiandole sebacee.

Cicatrici del ratto 9 mesi dopo il trapianto di epidermociti di ratto di ratto IPA.

Quadro clinico Le cicatrici sono diventate molto più piccole rispetto ai termini precedenti, le loro medie di area circa 1,5-2,0 cm ². Le cicatrici sono ricoperte in modo non uniforme da capelli sottili, specialmente attorno alla periferia. Il ridimensionamento della piccola piastra minore viene mantenuto.

Foto al microscopio

L'epidermide è diventata più sottile, rappresentata da 6-8 file di cellule, che ricorda la struttura epidermica della pelle normale dei ratti, solo la densità delle cellule di 1 mm. Più in alto e sono più piccoli. Lo strato basale è costituito da piccole cellule di forma cilindrica rotonda. La membrana basale è ben definita, gli emidesmosomi sono chiaramente visibili. Si nota la presenza di escrescenze epidermiche nello strato subepidermico. Lo strato papillare è espresso lungo l'intera lunghezza della cicatrice. Questi fatti indicano che per questo periodo di tempo l'adesione dei cheratinociti trapiantati è diventata significativamente più forte con i tessuti sottostanti del rumine. Di conseguenza, la cura per le cicatrici delle persone con trapianto di MALC 9 mesi dopo il trapianto di IPC può essere tradizionale. Sotto l'epidermide ci sono fibre di collagene più delicate che negli strati profondi. C'erano molte navi, specialmente localizzate superficialmente. In vasi più grandi, le pareti sono ispessite. Follicoli piliferi e ghiandole sebacee in grandi quantità. Il modello microscopico assomiglia a un tessuto dermico.

Risultati del lavoro sperimentale e loro discussione.

Nel corso di questo lavoro, i cheratinociti sono stati trapiantati in diverse forme su cicatrici cutanee create artificialmente di ratti, dopo un'operazione di dermoabrasione, su rivestimenti di ferite, come una sospensione su batista e uno strato multistrato senza substrato. Il lavoro è stato svolto per ottenere dati morfologici sull'effetto dei cheratinociti allogenici trapiantati su cicatrici, oltre a determinare le varianti ottimali del trapianto.

È stato scoperto che tutti e tre i metodi di trapianto sono reali, ma il trapianto di IPAA senza substrato è una procedura molto laboriosa, durante la quale può essere danneggiato l'IPAC, che influisce sui risultati del trapianto. Inoltre, questo metodo di trapianto esclude il lavoro su grandi superfici.

Il trapianto della sospensione di cheratinociti è un metodo molto più economico, non richiede una lunga coltura cellulare ed è semplice nella nostra versione proposta utilizzando billette sterili di cambria le cui dimensioni corrispondono alla dimensione delle cicatrici. Il ritardo dell'effetto terapeutico durante il trapianto della sospensione cellulare per circa un mese rispetto alla MIC sul rivestimento della ferita non è un momento significativo con la durata del trattamento, calcolato in molti mesi. È noto che durante il trapianto di IPC per bruciare i pazienti, la trasformazione dello stato della struttura cutanea si è verificata gradualmente e per diversi anni. Il trapianto della coltura dei cheratinociti sulle coperture delle ferite è il metodo più conveniente e promettente, tuttavia è anche molto più costoso. Inoltre, richiedendo per oggi la ricerca di rivestimenti più sofisticati che devono essere plastici, igroscopici, hanno proprietà batteriostatiche o battericide ed essere biologicamente neutri per le cellule. Film Polypore - una variante intermedia del rivestimento della pellicola del film domestico, nonostante alcune imperfezioni, ci ha permesso di studiare nell'esperimento un trapianto di cheratinociti di ratti in cicatrici e di trarre conclusioni sull'efficacia di questa direzione nella cicatrizzazione delle cicatrici.

Gli autori che hanno eseguito il trapianto di IPC su ferite bruciate hanno notato che durante la prima settimana dopo il trapianto dello strato di cheratinociti multistrato sulle ferite igienizzate, l'epidermide si è ispessita e stratificata. Tutti gli strati dell'epidermide erano ben definiti. È interessante notare che il numero di strati cellulari nei trapianti è maggiore del 10-30% rispetto ai campioni di biopsia cutanea. Gli autori hanno notato la comparsa di granuli di cheratogialina il 5 ° giorno dopo il trapianto di MPA, la membrana basale e l'emidesmosoma - già il terzo giorno.

J. Rives ed altri (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov et al. (1998) trovarono che durante i primi periodi seguenti pazienti BMD trapianto con difetti cutanei polnosloynymi dopo le ustioni, la comunicazione tra il derma e dell'epidermide è molto debole ed è una linea retta, strato papillare è assente. Entro la fine del secondo mese inizia la formazione di papille e appendici superficiali, la connessione tra il derma e l'epidermide diventa più duratura. I dati della letteratura parlano del trapianto di cheratinociti allogenici sulle ferite dei pazienti ustionati, come metodo promettente. Nonostante il fatto che il rifiuto di cheratinociti allogenici avviene presentata da vari autori nel periodo da 10 giorni a 3 mesi, tuttavia, hanno un ruolo nella guarigione della superficie della ferita, rilasciando fattori di crescita e di chiusura meccanicamente il difetto. Si ritiene che MPALK abbia una ridotta attività antigenica, poiché durante la coltivazione in vitro, le cellule di Langerhans perdono, il che consente loro di esistere per lungo tempo nell'organismo ricevente. Inoltre, la coltura allogenica ottenuta dalla pelle di giovani sane ha un potenziale biologico incomparabilmente maggiore rispetto alla coltura autologa di pazienti dopo un trauma.

L'obiettivo principale del nostro studio è stato quello di scoprire se i cheratinociti allogenici sopravviveranno sulle cicatrici e quali saranno i cambiamenti nel tessuto cicatriziale sotto l'influenza di tale "rivestimento della ferita" biologicamente attivo. In caso di risultato positivo, elaborare la tecnologia più efficace e meno laboriosa in questo settore della medicina riabilitativa.

I dati ottenuti da noi per molti aspetti si sono rivelati simili ai dati della letteratura sui cambiamenti morfologici che si verificano nell'epidermide umana dopo il trasferimento di cheratinociti allogenici per bruciare le ferite. Ma ci sono differenze significative, sia in termini di substrato morfologico, che viene trapiantato, sia in termini di tecnologia. So. Il processo di formazione della membrana basale e le connessioni dermo-epidermiche (emidesmosomi, papille) si verificano in una data successiva rispetto al trapianto di cheratinociti sulle superfici della ferita senza modifiche della cicatrice. Ciò sembra essere dovuto alla scarsa nutrizione dei tessuti del rumine rispetto al derma o alla fascia muscolare. La cicatrice, in particolare quella vecchia, è un tessuto connettivo denso con un numero molto piccolo di vasi, il fondo della ferita da ustione è un tessuto di granulazione ricco di vasi sanguigni. Pertanto, è ovvio che le condizioni in cui si verificano il trapianto e l'attecchimento dei cheratinociti sono completamente differenti. Più è vascolarizzato l'area del trapianto di cellule, più è facile elaborarle. Da questo postulato c'è una conclusione sulla preferenza per lavorare con cicatrici giovani, in cui il tessuto connettivo è ancora abbastanza sciolto e ricco di vasi sanguigni.

Come risultato di questo lavoro sperimentale, è dimostrato che:

1. È possibile un trapianto di MALK a cicatrici. 
2. Il metodo ottimale di trapianto è il trapianto di cheratinociti sulla copertura della ferita.
3. La superficie della cicatrice dovrebbe essere macinata usando una dermoabrasione operativa usando il laser di Schumann o un cutter.
4. Sotto l'influenza di MPALK, si verifica una rapida epitelizzazione della superficie del terreno del rumine.
5. Il migliore tessuto cicatriziale vascolarizzato, cioè, più giovane è la cicatrice, migliori sono i risultati del trapianto di cheratinociti.
6. Il tessuto cicatriziale sotto l'influenza dei cheratinociti trapiantati viene gradualmente trasformato e si trasforma in un tessuto cicatriziale simile a quello dermico (più friabile con appendici della pelle).
7. L'allentamento graduale del tessuto cicatriziale inizia con lo strato subepidermico. Migliora la sua vascolarizzazione, i fasci di fibre di collagene nella parte superiore e inferiore del rumine prendono una posizione più friabile rispetto al tessuto cicatriziale senza trapianto di cellule. Ci sono i follicoli piliferi e le ghiandole sebacee. L'epidermide nella sua struttura, dopo aver superato la fase di ipertrofia, si sta avvicinando all'epidermide della pelle normale.
8. I cambiamenti osservati sono associati a fattori di crescita derivati da cheratinociti, citochine, che migliorano il trofismo del tessuto cicatriziale e facilitano la sua trasformazione da tessuto fibroso grossolano in uno più sciolto, il che porta a un miglioramento del tipo di cicatrice.

Pertanto, sulla base di questo studio, si può concludere che l'effetto benefico dei cheratinociti trapiantati sul tessuto cicatriziale, che può essere di importanza pratica per la riabilitazione di pazienti con vari tipi di cicatrici.

Questo lavoro sui ratti ha permesso anche di formulare requisiti. Alle coperture delle ferite, su cui vengono coltivati i cheratinociti.

Le coperture delle ferite dovrebbero essere:

• biocompatibile con cellule,
• traspirante,
• avere una base elastica e formatrice,
• essere idrofilo,
• come additivi medicinali contengono farmaci antibatterici e antiossidanti non sono tossici per le cellule in coltura.

Risultati clinici del trattamento biotecnologico delle cicatrici.

In precedenza, N. Carver et al. (1993) hanno scoperto che le medicazioni occlusive sono le migliori per attaccarsi alla ferita e la sopravvivenza dei cheratinociti, ma non consentono la formazione di un'epidermide stratificata (matura). Per formare l'epidermide stratificata, è necessario un ambiente aereo. Pertanto, dopo aver applicato lo strato multistrato, dopo 7-10 è stato suggerito un rivestimento occlusivo della ferita per rimuovere e condurre ferite sotto bende asciutte o unguenti idrosolubili. Possiamo dire che la qualità e le proprietà del "substrato" su cui sono coltivate le cellule sono molto importanti per l'efficacia del trapianto del materiale cellulare e, di conseguenza, per i risultati del lavoro dei medici. Ma oggi non esiste una ferita ideale che copra, nonostante l'abbondanza delle opzioni proposte (pelle artificiale, tessuto non tessuto di carbossimetilcellulosa, rivestimenti di fibrina, film di poliuretano semipermeabili). Il momento non trascurabile in questa materia è il costo dei "substrati" (rivestimenti speciali per ferite), poiché il loro costo elevato aumenta il costo totale del trattamento biotecnologico.

L'efficacia delle tecnologie cellulari è stata dimostrata fino ad oggi, ma, sfortunatamente, queste tecnologie sono molto costose, specialmente nei paesi in cui la produzione industriale di composizioni cellulari non è stabilita. Tuttavia, paesi come gli Stati Uniti hanno da tempo stabilito un'industria per la produzione di materiale cellulare per il trapianto di bruciato. In particolare, BioSurface Technology Inc, dal 1989, ha coltivato 37.000 strati di cheratinociti multistrato che sono stati usati per trattare 240 pazienti in 79 paesi (R.Odessey, 1992) con 1 cm ^{2 di} costi di coltura cellulare circa 7-8 $ US.

La tecnologia di trattare varie malattie e problemi della pelle ha una serie di differenze, ma al centro di qualsiasi trattamento con cellule è la produzione di materiale cellulare di qualità e il suo trapianto.

Questo processo consiste dei seguenti passaggi:

• selezione della pelle dall'influenzato (o dai donatori),
• trasporto di lembi cutanei al centro di biotecnologia,
• l'isolamento delle cellule dello strato basale e la loro moltiplicazione,
• accumulo di strati multistrato di cheratinociti (IPC).
• trapianto di colture cellulari.

Il problema principale nel trattamento con il trapianto di strati di cheratinociti multistrato è la necessità di cellule vitali in tutte le fasi del trapianto di cellule. I pezzi di pelle per isolare le cellule autologhe o allogeniche dovrebbero essere il più sottili possibile, poiché in questo caso sono più facili da separare usando metodi meccanici ed enzimatici e per ottenere una sospensione delle cellule viventi per la crescita. Possono essere ottenuti tagliando il dermatomo o usando la pelle delle palpebre, il prepuzio, la superficie interna della spalla. Dato che le cellule sono sensibili agli alogeni (cloro, iodio), il perossido di idrogeno, non possono essere utilizzate nel trattamento della pelle al momento del prelievo del materiale.

La resa quantitativa e qualitativa delle cellule dagli innesti cutanei e l'efficacia della loro coltivazione dipendono anche dallo stato di salute e dall'età del donatore. Inoltre, i campioni bioptici cutanei devono essere consegnati al laboratorio il più presto possibile e in condizioni appropriate (ambiente, temperatura) consegnati a un laboratorio certificato e accreditato.

Il mezzo medio o medio di Eagle con l'aggiunta di siero bovino al 10%, mezzo DMEM integrato con siero fetale bovino al 5% e antibiotici può essere utilizzato per conservare e trasportare i lembi cutanei.

Nel laboratorio citologico, la biopsia cutanea viene dapprima meccanicamente suddivisa in piccoli pezzi, quindi l'elaborazione dei frammenti cutanei viene effettuata con l'aiuto di enzimi: tripsina, collagenasi, dispepsia, ecc.

Sotto l'azione degli enzimi, avviene la distruzione per desmosomi e i cheratinociti vengono rilasciati nel mezzo come cellule separate o aggregati costituiti da diversi numeri di cellule. Per la coltura, vengono utilizzati solo cheratinociti basali che vengono coltivati su terreni speciali in incubatori contenenti il 5% di CO., In piastre di Petri o in flaconi a t = 37 ° C. Entro 48 ore, si osserva la formazione di colonie di cheratinociti, che gradualmente convergono in un monostrato. Dopo aver ottenuto un numero sufficiente di cellule, la sospensione risultante viene distribuita sulle coperture delle ferite preparate a tale scopo e collocate in piastre di Petri. Dalla sospensione, si formano prima un monostrato e poi uno strato multistrato di cheratinociti. Schematicamente, gli stadi del processo di coltivazione dei cheratinociti sono mostrati in Fig. 12 (33.43.54.65).

La formazione di una formazione di cheratinociti multistrato adatta al trapianto richiede in genere 7-10 giorni. A volte questo periodo è più lungo, che dipende dalla qualità del materiale di partenza (età, salute del donatore, correttezza del materiale, qualità dei supporti utilizzati, ecc.). Se lo strato multistrato si sovrasta, allora sulla sua superficie possono esserci cellule con fenomeni di apoptosi inadatti al trapianto. Le piastre di Petri, con la loro crescita su coperture a ferite da strati multistrato di cheratinociti (IPC), vengono consegnate alla clinica in appositi contenitori ad una temperatura non inferiore a + 15 ° C.

Il metodo di Green modificato per far crescere l'IPC

Nel nostro lavoro come rivestimento di una ferita, abbiamo usato un cambrico multistrato, abbandonando i film polypore con i quali abbiamo iniziato a lavorare in un esperimento con i ratti. Così, strati di cheratinociti multistrato sono stati coltivati da noi su prefato e batista sterile, anche se non è anche la copertura della ferita ottimale.

Sono stati condotti studi clinici su volontari con l'osservanza delle norme etiche necessarie: la firma di un trattato e il consenso informato.

1. È stata applicata la cultura del proprio (autologo) e prelevata dalle cellule (allogeniche) dei cheratinociti.
2. I propri cheratinociti sono stati ottenuti da un pezzo di pelle tagliata dall'interno della spalla dei pazienti.
3. L'operazione di dermoabrasione delle cicatrici è stata effettuata con l'aiuto del termocoppia, dei dischi rotanti e del laser all'erbio.
4. Sono stati presi gruppi di pazienti con cicatrici normotrophic, hypotrophic e ipertrofiche.

Il processo tecnologico per l'applicazione della tecnologia cellulare per migliorare il tipo di cicatrici cutanee consisteva nelle seguenti fasi:

1. Selezione di pazienti.
2. Spiegare l'essenza del trattamento, i tempi per ottenere i risultati attesi, la firma di un trattato e il consenso informato.
3. Nomina di pazienti per 2-3 settimane prima dell'intervento selmevit di 1t. 3 volte al giorno, zinkteral su 1t. 3 volte al giorno.
4. Prendendo un pezzo di pelle lungo 2,0 cm e largo 0,7-1,0 cm dalla superficie interna della spalla, alto, quasi nella parte inferiore della regione ascellare, per ottenere cheratinociti autologhi.
5. Nel caso in cui i pazienti rifiutassero di isolare i propri cheratinociti a causa della possibilità di ottenere una cicatrice lineare sulla superficie interna della spalla, il materiale cellulare è stato prelevato da una banca cellulare (cheratinociti allogenici).
6. I cheratinociti sono stati isolati e coltivati nelle condizioni di un laboratorio certificato per questo tipo di lavoro.
7. Dopo aver ricevuto un IPC sufficiente per il trapianto, un giorno di chirurgia è stato somministrato alle cicatrici presso la clinica, dove il materiale è stato portato in contenitori speciali in piastre di Petri.
8. L'operazione di dermoabrasione del rumine, emostasi è stata effettuata, la superficie del terreno è stata lavata con soluzione salina sterile, essiccata, dopo di che l'IPC è stato trapiantato su "cellule" di batista sterili verso il basso. Cioè, le celle che erano superiori al MIC erano più basse, adiacenti alla superficie levigata.
9. Sulla parte superiore è stato sovrapposto un film sterile, fissato alla pelle con una benda elastica o un cerotto elastico Omnifix. Invece del film, possono anche essere usati indifferenti rivestimenti per ferite contenenti silicone, ad esempio Mepitel, Mepiform, piastre di gel di silicone.

Dopo 5-7 giorni, il film o il rivestimento in silicone viene rimosso. A questo punto, tutti i cheratinociti devono strisciare sulla cicatrice lucidata e attaccarsi alla sua superficie.

10. L'ambiente umido creato sotto il film e il rivestimento in silicone sta contribuendo attivamente a questo. Il battista che rimane sulla cicatrice da questo punto può essere impregnato di gel curioso o chitosano. Di conseguenza, il 2 ° giorno, viene creata una crosta densa che, per la comodità del paziente, è meglio fissare con un cerotto elastico e permeabile all'aria, ad esempio Omnifix. La crosta traspirante consente all'epidermide appena formata di differenziarsi e trasformarsi in uno maturo.

A seconda del tipo di cicatrice e della profondità della macinatura, la medicazione viene rifiutata dopo 8-10 giorni. L'epidermide in questo momento ha il 30-40% in più di strati cellulari rispetto alla pelle normale. La membrana basale non è formata. I cheratinociti dell'epidermide ispessita rilasciano una massa di molecole biologicamente attive nel tessuto cicatriziale.

Il successo del trattamento biotecnologico delle cicatrici dipende in gran parte dal modo in cui sono presi in considerazione nel periodo postoperatorio. Le colture cellulari sono un tipo "tenero" di copertura della ferita e nei primi periodi dopo il trapianto, la BMD può essere facilmente staccata dai tessuti sottostanti. Pertanto, i pazienti sono invitati a prendersi cura della cicatrice dopo l'intervento chirurgico. Per 8-9 mesi, non strofinare e lavorare facilmente con acqua bollita fredda per evitare di strappare una sottile epidermide appena creata che non ha una presa salda con i tessuti sottostanti.

Nota.

Prima dell'intervento e durante l'uso dermoabrasione di ossidanti alogenati e conservanti (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, clorexidina, acqua ossigenata) è consentito prima del trapianto kletok- assolutamente controindicato per i loro effetti citotossici. Tossico per le cellule sono anche blu di metilene. Verde brillante.

Per evitare l'infezione, specialmente quando si lavora con cicatrici ipertrofiche, è possibile trattare il campo operatorio con neomicina solfato, polimixina o gentamicina. Non esercitano un effetto citotossico sui cheratinociti.

Come risultato di questo trattamento, si ottiene un triplice effetto.

1. Allineamento della superficie del rumine.
2. Creare uno strato sopra di esso di una nuova epidermide, spessore normale.
3. La trasformazione del tessuto cicatriziale in forma dermoide dovuta all'azione di citochine, fattori di crescita e altre molecole biologicamente attive, secrete dalle cellule trapiantate e stimolate da loro cheratinociti, fibroblasti e macrofagi.

La cicatrice diventa meno evidente, più elastica, i pori appaiono in esso, i peli, la pigmentazione può essere ripristinata a causa della presenza di melanociti nel MPC.

Tuttavia, tutti questi momenti positivi nella cicatrice non vengono immediatamente. A questo proposito, è necessario avvertire i pazienti. Che il processo di trasformazione del tessuto cicatriziale nel derma è lento e il risultato ottimale di tale trattamento può essere previsto non prima di 10-14 mesi. Immediatamente dopo che la medicazione è stata respinta, le superfici levigate hanno una policromia pronunciata, più luminoso è il processo di macinazione. Il minimo danno alla pelle si verifica quando si macinano cicatrici normotropiche con un laser ad erbio. Il colore delle cicatrici e della pelle circostante è stato ripristinato nel periodo da 3 a 8 settimane. Nonostante tali precauzioni, a volte esiste un'iperpigmentazione postoperatoria, che può continuare indipendentemente per diversi mesi.

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