La terapia genica non virale offre una speranza per la lombalgia cronica

In uno studio recente pubblicato sulla rivista Biomaterials, i ricercatori hanno sviluppato una nuova terapia genica non virale per trattare il mal di schiena discogenico (DBP) somministrando il fattore di trascrizione Forkhead Box F1 (FOXF1) mediante vescicole extracellulari ingegnerizzate (eEV) nei dischi intervertebrali degenerativi (IVD) in vivo.

Il mal di schiena cronico (LBP) è un problema globale in crescita a causa dell'invecchiamento della popolazione e del peggioramento della dipendenza da oppioidi. I trattamenti attuali includono trattamenti di breve durata o interventi chirurgici costosi, evidenziando la necessità di terapie che non creino dipendenza e siano meno invasive.

Gli attuali approcci biologici, tra cui la somministrazione di fattori di crescita, la terapia cellulare e la terapia genica virale, possono ridurre la degenerazione nei modelli animali e umani. Tuttavia, problemi come gli effetti a breve termine, la scarsa efficacia a lungo termine e l'immunogenicità e l'oncogenicità non necessarie possono ostacolare l'applicazione diretta di questi approcci.

In questo studio, i ricercatori hanno messo a punto una terapia genica non virale per la degenerazione del disco intervertebrale (IVD) utilizzando FOXF1-eEV.

I ricercatori hanno trasfettato fibroblasti embrionali primari di topo (PMEF) con plasmidi contenenti FOXF1 o pCMV6 come controllo e hanno caratterizzato i campioni di eEV utilizzando il test di tracciamento delle nanoparticelle (NTA).

Hanno valutato l'efficienza del caricamento molecolare negli eEV utilizzando la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR) e la PCR convenzionale. L'analisi Western blot ha identificato proteine specifiche per FOXF1 ed EV nelle formazioni di eEV. Il team ha utilizzato plasmidi che potenziano le regioni di polylinker superiore e inferiore per determinare la presenza di DNA plasmidico di FOXF1 nelle cellule donatrici e ha generato eEV.

Hanno esaminato l'mRNA completo prodotto dal DNA plasmidico negli eEV e nelle cellule donatrici.

I ricercatori hanno creato vescicole extracellulari con fattori di trascrizione per ripristinare la funzionalità dei tessuti e modificare le risposte al dolore in un modello animale di DBP.

Hanno identificato gli EV per il trasporto e la distribuzione di FOXF1 nei dischi intervertebrali danneggiati in un modello murino di mal di schiena discogenico per determinare l'inibizione da parte di FOXF1 eEV della degenerazione del disco intervertebrale.

Il team ha combinato test biomeccanici sui dischi intervertebrali dei topi con imaging, modifiche della matrice extracellulare (ECM) e risposte al dolore valutate dopo 12 settimane per confermare i cambiamenti nella struttura e nella funzione, nonché il dolore, indotti dall'intervento terapeutico.

Le valutazioni del dolore preoperatorie e postoperatorie includevano la microtomografia computerizzata (micro-TC), la risonanza magnetica per immagini (RMI), i test meccanici, la colorazione con blu Alcian (AB) e rosso picrosirio (PSR), il test con blu di dimetilmetilene e l'immunoistochimica (IHC).

Lo studio ha utilizzato una tecnica chirurgica in cui i ricercatori hanno somministrato Buprenorfina ER per via sottocutanea ai topi per controllare il dolore post-operatorio.

Il team ha effettuato valutazioni comportamentali prima dell'intervento e ogni due settimane, da quattro a dodici settimane dopo l'intervento, utilizzando diversi metodi, tra cui il test del campo aperto, la piastra fredda, la sospensione della coda e la sospensione del filo.

Il test in campo aperto ha valutato l'attività spontanea dei topi; i test con piastra fredda hanno misurato l'iperalgesia termica; i test con sospensione della coda hanno misurato il dolore assiale; e i test con sospensione del filo hanno misurato la forza.

Dodici settimane dopo l'intervento chirurgico, il team ha sezionato la colonna lombare degli animali utilizzando il tracciato dei nervi e delle arterie femorali per identificare i dischi intervertebrali tra L4 e L5, L5 e L6 e L6 e il IVD di S1. Hanno utilizzato il IVD di L5/L6 per valutare l'istologia e determinare il contenuto di glicosaminoglicani (GAG).

Gli eEV FOXF1 hanno ridotto significativamente le risposte al dolore, ripristinando al contempo la struttura e la funzione del disco intervertebrale, migliorando l'altezza del disco, l'idratazione dei tessuti, il contenuto di proteoglicani e le proprietà meccaniche.

Lo studio si è concentrato sul rilascio di eEV caricati con FOXF1 da fibroblasti primari trasfettati con il fattore di trascrizione FOXF1. La RT-PCR quantitativa ha mostrato un aumento significativo dei livelli di trascrizione dell'mRNA di FOXF1 e dei livelli di mRNA di FOXF1 trascritto a lunghezza intera rispetto alle cellule trasfettate con pCMV6.

La terapia con FOXF1 eEV può ridurre la risposta al dolore in un modello di puntura del disco lombare nei topi fino a 12 settimane. I topi femmina hanno mostrato tempi di crisi più lunghi nel gruppo trattato con FOXF1 rispetto al gruppo con lesioni, che si sono protratti per almeno 12 settimane dopo il trattamento.

La terapia con FOXF1 eEV ha migliorato l'idratazione e l'altezza dei tessuti IVD negli animali feriti e degenerati in vivo, mantenendo al contempo i livelli di idratazione e l'intensità delle immagini pesate in T2 del disco IVD.

Tuttavia, il team ha osservato una riduzione dell'altezza del disco negli animali con lesioni e negli animali trattati con pCMV6 eEV. I topi trattati con FOXF1 eEV non hanno mostrato alcuna riduzione dell'altezza del disco 12 settimane dopo il trattamento. Il sesso non ha influenzato i risultati funzionali.

Gli eEV FOXF1 hanno ripristinato la funzione meccanica dei dischi intervertebrali danneggiati e degenerati in vivo. Sotto stress assiale, i dischi intervertebrali trattati con eEV FOXF1 hanno mostrato una rigidità NZ normalizzata maggiore rispetto ai dischi intervertebrali danneggiati.

In condizioni di creep, gli IVD danneggiati hanno mostrato maggiori spostamenti di creep normalizzati, indicando una diminuzione della rigidità elastica di creep normalizzata.

I risultati dimostrano che la riduzione del contenuto di GAG nei dischi intervertebrali danneggiati aumenta la flessibilità meccanica, ma la terapia con eEV previene la perdita di glicosaminoglicani e le conseguenti modifiche nella funzione meccanica.

Gli eEV FOXF1 hanno indotto cambiamenti strutturali e funzionali nell'IVD aumentando i livelli di proteoglicani e GAG.

I risultati dello studio hanno dimostrato che gli eEV caricati con fattori di trascrizione dello sviluppo possono trattare patologie articolari dolorose come la DBP, trasportando questi fattori di trascrizione nelle articolazioni degenerative e dolorose tramite IVD.

Questa strategia può aiutare a ridurre le anomalie strutturali e funzionali causate dalla malattia e a regolare le risposte al dolore in modo specifico per genere.

I ricercatori hanno anche raccomandato l'utilizzo di fattori di trascrizione dello sviluppo come FOXF1 per indurre le cellule NP degenerative a uno stato pro-anabolizzante in vivo. Sono necessari ulteriori studi per determinarne l'efficacia terapeutica.