La terapia genica non virale offre speranza per la lombalgia cronica

In un recente studio pubblicato sulla rivista Biomaterials, i ricercatori hanno sviluppato una nuova terapia genica non virale per trattare il mal di schiena discogenico (DBP) fornendo il fattore di trascrizione Forkhead Box F1 (FOXF1) che utilizza vescicole extracellulari (eEV) ingegnerizzate in dischi intervertebrali degenerativi (IVD) in vivo.

La lombalgia (LBP) cronica è un problema globale in crescita a causa dell'invecchiamento della popolazione e del peggioramento dei problemi legati agli oppioidi. I trattamenti attuali includono sollievo a breve termine o interventi chirurgici costosi, evidenziando la necessità di terapie che non creino dipendenza e siano meno invasive.

Le attuali terapie biologiche, tra cui la somministrazione di fattori di crescita, la terapia cellulare e le terapie geniche virali, possono ridurre la degenerazione nei modelli animali e umani. Tuttavia, preoccupazioni quali effetti a breve termine, scarsa efficacia a lungo termine e immunogenicità e tumorigenicità non necessarie possono impedire l'applicazione diretta di questi metodi.

In questo studio, i ricercatori hanno stabilito una terapia genica non virale per la degenerazione del disco intervertebrale (IVD) utilizzando FOXF1-eEV.

I ricercatori hanno trasfettato fibroblasti embrionali primari di topo (PMEF) con un plasmide contenente FOXF1 o pCMV6 come controllo e hanno caratterizzato campioni eEV utilizzando il test di tracciamento delle nanoparticelle (NTA).

Hanno valutato il caricamento efficiente del carico molecolare negli eEV utilizzando la reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR) e la PCR convenzionale. L'analisi Western blot ha identificato FOXF1 e specifiche proteine EV nelle formazioni eEV. Il team ha utilizzato plasmidi che potenziano le regioni del polylinker a monte e a valle per determinare la presenza del DNA plasmidico FOXF1 nelle cellule donatrici e ha generato eEV.

Hanno esaminato l'mRNA a lunghezza intera prodotto dal DNA plasmidico negli eEV e nelle cellule donatrici.

I ricercatori hanno creato vescicole extracellulari con fattori di trascrizione per ripristinare la funzione dei tessuti e modificare le risposte al dolore in un modello animale di DBP.

Hanno identificato gli EV per trasportare e distribuire FOXF1 ai dischi intervertebrali danneggiati in un modello murino di mal di schiena discogenico per determinare l'inibizione di FOXF1 eEV della degenerazione del disco intervertebrale.

Il team ha combinato test biomeccanici dei dischi intervertebrali di topo con imaging, cambiamenti della matrice extracellulare (ECM) e risposte al dolore valutate dopo 12 settimane per confermare i cambiamenti nella struttura e nella funzione, nonché il dolore indotto dall'intervento terapeutico.

Le valutazioni del dolore preoperatorio e post-trattamento includevano tomografia microcomputerizzata (micro-CT), risonanza magnetica (MRI), test meccanici, colorazione con blu Alcian (AB) e rosso picrosirius (PSR), test con blu dimetilmetilene e immunoistochimica (IHC) ) ).

Lo studio prevedeva una tecnica chirurgica in cui i ricercatori iniettavano buprenorfina ER per via sottocutanea nei topi per controllare il dolore postoperatorio.

Il team ha condotto valutazioni comportamentali prima dell'intervento chirurgico e ogni due settimane da quattro a dodici settimane dopo l'intervento, utilizzando una varietà di tecniche come il test in campo aperto, la piastra fredda, la sospensione della coda e la sospensione tramite filo.

Il test in campo aperto ha valutato l'attività spontanea dei topi; i test con piastra fredda hanno misurato l'iperalgesia termica; I test di sospensione della coda hanno misurato il dolore assiale; e i test di sospensione a filo hanno misurato la resistenza.

Dodici settimane dopo l'intervento chirurgico, il team ha sezionato le spine lombari degli animali, utilizzando il tracciamento del nervo femorale e dell'arteria per identificare i dischi intervertebrali tra L4 e L5, L5 e L6 e L6 e S1 IVD. Hanno utilizzato L5/L6 IVD per valutare l'istologia e determinare il contenuto di glicosaminoglicani (GAG).

Gli eEV FOXF1 hanno ridotto significativamente le risposte al dolore ripristinando la struttura e la funzione dell'IVD, inclusi miglioramenti nell'altezza del disco, nell'idratazione dei tessuti, nel contenuto di proteoglicani e nelle proprietà meccaniche.

Lo studio si è concentrato sul rilascio di eEV caricati con FOXF1 da fibroblasti primari trasfettati con il fattore di trascrizione FOXF1. La RT PCR quantitativa ha mostrato un aumento significativo dei livelli di trascrizione dell'mRNA di FOXF1 e dei livelli di mRNA di FOXF1 trascritto a lunghezza intera rispetto alle cellule trasfettate con pCMV6.

La terapia FOXF1 eEV può ridurre le risposte al dolore in un modello murino di puntura del disco lombare fino a 12 settimane. I topi femmine hanno mostrato tempi di acquisizione più lunghi nel gruppo trattato con FOXF1 rispetto al gruppo lesionato, che sono durati almeno 12 settimane dopo il trattamento.

La terapia FOXF1 eEV ha migliorato l'idratazione e l'altezza del tessuto IVD negli animali feriti e degenerati in vivo, mantenendo i livelli di idratazione e l'intensità dell'immagine IVD pesata in T2.

Tuttavia, il team ha osservato una diminuzione dell'altezza del disco negli animali feriti e negli animali trattati con pCMV6 eEV. I topi trattati con FOXF1 eEV non hanno avuto alcuna riduzione dell'altezza del disco 12 settimane dopo il trattamento. Il sesso non ha influenzato i risultati funzionali.

Gli eEV FOXF1 hanno ripristinato la funzione meccanica degli IVD danneggiati e degenerati in vivo. Sotto stress assiale, gli IVD trattati con FOXF1 eEV hanno mostrato una rigidità NZ normalizzata più elevata rispetto agli IVD danneggiati.

In condizioni di scorrimento viscoso, gli IVD danneggiati hanno mostrato un aumento degli spostamenti di scorrimento normalizzato, indicando una diminuzione della rigidità elastica di scorrimento normalizzato.

I risultati mostrano che la riduzione del contenuto di GAG negli IVD danneggiati aumenta la flessibilità meccanica, ma la terapia eEV previene la perdita di glicosaminoglicani e i conseguenti cambiamenti nella funzione meccanica.

Gli eEV FOXF1 hanno causato cambiamenti strutturali e funzionali nell'IVD aumentando i livelli di proteoglicani e GAG.

I risultati dello studio hanno mostrato che gli eEV caricati con fattori di trascrizione dello sviluppo possono trattare malattie articolari dolorose come il DBP fornendo questi fattori di trascrizione alle articolazioni IVD degenerative e dolorose.

Questa strategia può aiutare a ridurre le anomalie strutturali e funzionali causate dalla malattia, nonché a regolare le risposte al dolore specifiche per genere.

I ricercatori hanno inoltre raccomandato l'uso di fattori di trascrizione dello sviluppo come FOXF1 per convertire le cellule NP degenerative in uno stato pro-anabolico in vivo. Sono necessarie ulteriori ricerche per determinarne l'efficacia terapeutica.