Applicazione di tecnologie cellulari per migliorare l'aspetto delle cicatrici

La scienza moderna è caratterizzata dal rapido sviluppo di una serie di discipline correlate, riunite sotto il nome generale di "biotecnologia". Questa branca della scienza, basata sui più recenti progressi nel campo della biologia, della citologia, della genetica molecolare, dell'ingegneria genetica e della trapiantologia, mira a sfruttare l'enorme potenziale insito nelle cellule vegetali e animali, le unità strutturali di base di tutti gli esseri viventi. "Una cellula vivente è un reattore biotecnologico già pronto in cui si realizzano non solo i processi che portano alla formazione del prodotto finale, ma anche una serie di altri che contribuiscono a mantenere elevata l'attività catalitica del sistema", - John Woodward, 1992. L'inizio della scienza cellulare fu posto nel 1665, quando il fisico inglese R. Hooke creò il primo microscopio e scoprì le cellule, le cellulae ("cellule"), in un tappo di sughero. Nel 1829, M. Schleiden e T. Schwann fondarono la "teoria cellulare", che dimostrò che tutti gli esseri viventi sono costituiti da cellule. Nel 1858, R. Virchow dimostrò che tutte le malattie sono basate su una violazione dell'organizzazione strutturale e del metabolismo delle cellule. Divenne il fondatore della "patologia cellulare". Un contributo fondamentale alla scienza cellulare fu dato nel 1907-1911 da R. Harrison e A. A. Maximov, che dimostrarono la possibilità di coltivare cellule al di fuori del corpo. Il loro lavoro dimostrò che per la coltivazione cellulare, i tessuti animali e le parti delle piante devono essere separati meccanicamente in piccoli pezzi. Per isolare le cellule, i tessuti vengono tagliati con un coltello affilato o un microtomo in sezioni sottili, di circa 0,5-1,0 mm. La separazione fisica delle cellule è chiamata immobilizzazione. Le cellule isolate si ottengono per dispersione enzimatica di frammenti di piante o tessuti. Dopo la macinazione con forbici affilate, i frammenti vengono trattati con tripsina o collagenasi per ottenere una sospensione: una sospensione di singole cellule o dei loro microaggregati in un mezzo speciale. I gel di alginato (alginato di calcio) sono ampiamente utilizzati per immobilizzare le cellule vegetali. È stato dimostrato che le cellule vegetali e animali immobilizzate mantengono la capacità di biosintetizzare. I prodotti della biosintesi cellulare si accumulano nelle cellule e la loro espressione avviene spontaneamente o con l'ausilio di sostanze speciali che favoriscono una maggiore permeabilità delle membrane cellulari.

La coltivazione di cellule animali è un processo molto più complesso rispetto alla coltura di cellule vegetali, che richiede attrezzature moderne e specializzate, alta tecnologia, la presenza di diversi terreni di coltura e fattori di crescita progettati per preservare la vitalità delle cellule e mantenerle in uno stato di elevata attività funzionale. È stato scoperto che la maggior parte delle cellule dei tessuti solidi, come quelli renali, epatici e cutanei, sono dipendenti dalla superficie, quindi possono essere coltivate in vitro solo sotto forma di sottili fogli o monostrati direttamente associati alla superficie del substrato. La durata di vita, la proliferazione e la stabilità funzionale delle cellule ottenute per dispersione enzimatica dei tessuti dipendono in larga misura dal substrato su cui vengono coltivate. È noto che tutte le cellule ottenute da tessuti di vertebrati hanno una carica superficiale negativa, quindi i substrati caricati positivamente sono adatti alla loro immobilizzazione. Le cellule isolate ottenute direttamente da tessuti interi possono essere mantenute in una coltura primaria in stato immobilizzato, mantenendo un'elevata specificità e sensibilità per 10-14 giorni. Le cellule immobilizzate e dipendenti dalla superficie svolgono un ruolo importante in biologia oggi, soprattutto nella ricerca clinica. Vengono utilizzati per studiare i cicli di sviluppo cellulare, la regolazione della loro crescita e differenziazione, le differenze funzionali e morfologiche tra cellule normali e tumorali. I monostrati cellulari immobilizzati vengono utilizzati nei biotest, per la determinazione quantitativa di sostanze biologicamente attive, nonché per studiare l'effetto di vari farmaci e tossine su di esse. Medici di tutte le specialità hanno mostrato grande interesse per le cellule come agente terapeutico per decenni. Le tecnologie cellulari si stanno attualmente sviluppando rapidamente in questa direzione.

L'inizio della terapia tissutale e cellulare è legato al nome del famoso scienziato russo V.P. Filatov, che nel 1913 pose le basi della dottrina della terapia tissutale, studiando i risultati dei trapianti di cornea da donatori sani a pazienti affetti da cataratta. Lavorando sui trapianti di cornea, scoprì che la cornea conservata al freddo per 1-3 giorni a una temperatura di -2-4 °C attecchisce meglio di quella fresca. Fu così scoperta la proprietà delle cellule di secernere alcune sostanze in condizioni sfavorevoli che stimolano i processi vitali nei tessuti trapiantati e quelli rigenerativi nei tessuti del ricevente. I tessuti e le cellule separati dal corpo si trovano in uno stato di stress, ovvero con un'attività vitale lenta. La circolazione sanguigna al loro interno si interrompe, e di conseguenza anche la nutrizione. La respirazione tissutale è estremamente difficoltosa, l'innervazione e il trofismo sono alterati. Trovandosi in un nuovo stato qualitativo, adattandosi alle nuove condizioni di vita, le cellule producono sostanze speciali con proprietà medicinali. Queste sostanze di natura non proteica furono chiamate da V.P. Filatov "stimolanti biogenici". Insieme a VV Skorodinskaya, stabilì che materiale proveniente da animali e piante può essere liberamente autoclavato a 120 °C per un'ora dopo essere stato conservato in condizioni sfavorevoli, e che non solo non perdeva attività, ma al contrario la aumentava, il che veniva spiegato dal rilascio di stimolanti biologici dai tessuti conservati. Inoltre, perdevano proprietà antigeniche, il che riduceva significativamente la possibilità di rigetto. Il materiale sterile conservato veniva introdotto nell'organismo mediante impianto (impianto) sottocutaneo o sotto forma di iniezioni di estratti, con risultati soddisfacenti. Si scoprì inoltre che i tessuti fetali contengono un numero significativamente maggiore di sostanze biologicamente attive rispetto ai tessuti degli individui adulti, e alcuni fattori sono presenti solo negli embrioni. I tessuti fetali inoculati non vengono percepiti dall'organismo del ricevente come estranei a causa dell'assenza di proteine responsabili della specificità di specie, tessuto e individuo (proteine del complesso maggiore di istocompatibilità) nelle membrane citoplasmatiche. Di conseguenza, l'inoculazione di tessuti fetali animali nell'organismo umano non innesca meccanismi di protezione immunitaria né reazioni di incompatibilità e rigetto. VP Filatov utilizzava ampiamente la placenta e la pelle umana nella sua pratica medica. I cicli di trattamento consistevano in 30-45 iniezioni di estratti tissutali e 1-2 impianti di tessuti autoclavati.

Avendo iniziato le sue ricerche con tessuti e cellule umani e animali, trasferì le sue generalizzazioni al mondo vegetale. Conducendo esperimenti con parti vive di piante (aloe, piantaggine, agave, cime di barbabietola, iperico, ecc.), creò condizioni sfavorevoli per la loro crescita, collocando le foglie recise in un luogo buio, poiché la pianta necessita di luce per le sue funzioni vitali. Isolò anche stimolanti biogenici dal fango e dalla torba degli estuari, poiché fango e torba si formano con la partecipazione di microflora e microfauna.

La terapia tissutale ha conosciuto un nuovo sviluppo alla fine degli anni '70, quando le conoscenze e l'esperienza accumulate nel corso dei decenni hanno permesso di utilizzare tessuti e cellule animali e vegetali a un livello qualitativamente nuovo per curare gli esseri umani e prolungarne la longevità attiva. Così, in alcune cliniche nazionali e in numerose cliniche straniere, le donne in menopausa fisiologica con sindrome climaterica o in fase di ovariectomia hanno iniziato a sottoporsi a terapia tissutale con tessuti fetali di placenta, ipotalamo, fegato, ovaie, timo e tiroide per rallentare il processo di invecchiamento, lo sviluppo di aterosclerosi, osteoporosi e disfunzioni del sistema immunitario, endocrino e nervoso. In una delle cliniche di gerontocosmetologia più prestigiose dell'Europa occidentale, le iniezioni di estratti ottenuti da tessuti fetali delle gonadi di arieti vengono utilizzate per gli stessi scopi da diversi decenni.

Anche nel nostro Paese, il trattamento biostimolante ha trovato ampia applicazione. Fino a poco tempo fa, ai pazienti affetti da varie patologie venivano prescritte iniezioni di estratti di placenta, aloe, kalanchoe, sedum major (biosed), FiBS, distillato di peloide, peloidina, torba e humisol, preparati secondo il metodo di V.P. Filatov. Attualmente, è quasi impossibile acquistare in farmacia questi preparati tissutali nazionali altamente efficaci ed economici, di origine animale, vegetale e minerale.

Le basi per l'ottenimento di vari preparati biogenici da tessuti e organi umani di produzione importata, come il rumalon (da tessuto cartilagineo e midollo osseo), l'actovegin (da sangue di vitello), il solcoseryl (estratto di sangue bovino), così come i preparati nazionali - corpo vitreo (dal corpo vitreo dell'occhio bovino), il kerakol (dalla cornea bovina), la splenin (dalla milza bovina), l'epitalamina (dalla regione epitalamico-epifisaria) - sono anch'esse frutto della ricerca di V.P. Filatov. La proprietà unificante di tutti i preparati tissutali è l'effetto generale sull'intero organismo. Pertanto, la "Terapia Tissutale" dell'accademico V.P. Filatov ha costituito la base per la maggior parte degli sviluppi e delle direzioni moderne in chirurgia, immunologia, ostetricia e ginecologia, gerontologia, combustiologia, dermatologia e cosmetologia relative alla cellula e ai prodotti della sua biosintesi.

Il problema del trapianto di tessuti ha interessato l'umanità fin dall'antichità. Infatti, nel papiro di Ebers, risalente all'8.000 a.C., si parla già dell'uso del trapianto di tessuti per compensare difetti in singole aree del corpo. Nel "Libro della Vita" dello scienziato indiano Sushruta, vissuto 1.000 anni a.C., si trova una descrizione dettagliata del ripristino del naso mediante la pelle delle guance e della fronte.

La necessità di pelle da donatori è cresciuta proporzionalmente all'aumento del numero di interventi di chirurgia plastica e ricostruttiva. A questo proposito, si è iniziato a utilizzare la pelle di cadaveri e fetali. C'era bisogno di preservare le risorse di donatori e di trovare modi per sostituire la pelle umana con tessuti animali e diverse opzioni di modellamento cutaneo. Ed è stato in questa direzione che gli scienziati hanno lavorato quando, nel 1941, P. Medovar ha dimostrato per la prima volta la possibilità fondamentale della crescita dei cheratinociti in vitro. La successiva tappa importante nello sviluppo delle tecnologie cellulari è stata il lavoro di Karasek M. e Charlton M., che nel 1971 hanno effettuato il primo trapianto riuscito di cheratinociti autologhi da una coltura primaria su ferite di coniglio, utilizzando gel di collagene come substrato per la coltura di CC, il che ha migliorato la proliferazione cellulare in coltura. J. Rheinvvald. H. Green. ha sviluppato una tecnologia per la coltivazione seriale di grandi quantità di cheratinociti umani. Nel 1979 Green e i suoi coautori scoprirono le prospettive dell'uso terapeutico della coltura di cellule cheratinocitarie nel ripristino della pelle in casi di ustioni estese, dopodiché questa tecnica, in continuo miglioramento, iniziò a essere utilizzata dai chirurghi nei centri ustionati all'estero e nel nostro Paese.

Nel processo di studio delle cellule viventi, si è scoperto che le cellule producono non solo stimolatori biogenici di origine non proteica, ma anche una serie di citochine, mediatori, fattori di crescita e polipeptidi, che svolgono un ruolo importante nella regolazione dell'omeostasi dell'intero organismo. Si è scoperto che diverse cellule e tessuti contengono bioregolatori peptidici, che hanno un ampio spettro di azione biologica e coordinano i processi di sviluppo e funzionamento dei sistemi multicellulari. È iniziata l'era dell'utilizzo della coltura cellulare come agente terapeutico. Nel nostro Paese, il trapianto di sospensioni di fibroblasti e di strati cellulari di cheratinociti multistrato è stato adottato in combustiologia negli ultimi decenni. Un tale interesse per il trapianto di cellule cutanee su pazienti ustionati è spiegato dalla necessità di una rapida chiusura di ampie superfici ustionate e dalla carenza di pelle donatrice. La possibilità di isolare cellule da un piccolo lembo di pelle, in grado di coprire una superficie della ferita 1000 o addirittura 10.000 volte più grande dell'area della pelle donatrice, si è rivelata molto interessante e importante per la combustiologia e i pazienti ustionati. La percentuale di attecchimento dello strato di cheratinociti varia dal 71,5 al 93,6% a seconda dell'area ustionata, dell'età e delle condizioni di salute del paziente. L'interesse per il trapianto di cheratinociti e fibroblasti è associato non solo alla possibilità di chiudere rapidamente un difetto cutaneo, ma anche al fatto che questi trapianti hanno un potente potenziale biologicamente attivo per migliorare l'aspetto dei tessuti ottenuti a seguito del trapianto. Formazione di nuovi vasi, sollievo dall'ipossia, miglioramento del trofismo, maturazione accelerata del tessuto immaturo: questa è la base morfo-funzionale di questi cambiamenti positivi che si verificano grazie al rilascio di fattori di crescita e citochine da parte delle cellule trapiantate. Pertanto, grazie all'introduzione nella pratica medica di tecnologie cellulari all'avanguardia per il trapianto di strati multicellulari di cheratinociti e fibroblasti autologhi e allogenici su ampie superfici di ferite, i combustiologi sono stati in grado non solo di ridurre il tasso di mortalità delle vittime di ustioni con un'alta percentuale di lesioni cutanee, ma anche di migliorare qualitativamente il tessuto cicatriziale che inevitabilmente si forma nel sito di ustioni di grado IIb, IIIa e b. L'esperienza dei combustiologi nel trattamento delle superfici delle ferite nei pazienti ustionati ha suggerito l'idea di utilizzare il metodo Green, già modificato, nella pratica dermatochirurgica per varie patologie cutanee ed estetiche (ulcere trofiche, vitiligine, nevi, epidermolisi bollosa, rimozione di tatuaggi, alterazioni cutanee legate all'età e per migliorare l'aspetto delle cicatrici).

L'uso di cheratinociti allogenici in chirurgia, combustiologia e dermatocosmetologia presenta numerosi vantaggi rispetto all'uso di cheratinociti autologhi, poiché il materiale cellulare può essere preparato in anticipo in quantità illimitate, conservato e utilizzato all'occorrenza. È inoltre noto che i CC allogenici presentano una ridotta attività antigenica, poiché durante la coltivazione in vitro perdono le cellule di Langerhans, portatrici degli antigeni del complesso HLA. L'uso dei CC allogenici è inoltre supportato dal fatto che, secondo diversi autori, vengono sostituiti da quelli autologhi dopo il trapianto entro un periodo compreso tra 10 giorni e 3 mesi. A questo proposito, in molti paesi sono state create banche cellulari, grazie alle quali è possibile ottenere trapianti cellulari nella quantità richiesta e al momento opportuno. Tali banche esistono in Germania, negli Stati Uniti e in Giappone.

L'interesse per l'uso delle tecnologie cellulari in dermatocosmetologia è dovuto al fatto che le "composizioni cellulari" possiedono un potente potenziale bioenergetico e informativo, grazie al quale è possibile ottenere risultati terapeutici qualitativamente nuovi. Le autochine secrete dalle cellule trapiantate (fattori di crescita, citochine, ossido nitrico, ecc.) agiscono principalmente sui fibroblasti dell'organismo, aumentandone l'attività sintetica e proliferativa. Questo fatto è particolarmente interessante per i ricercatori, poiché il fibroblasto è una cellula chiave del derma, la cui attività funzionale determina le condizioni di tutti gli strati cutanei. È inoltre noto che dopo una lesione cutanea con cauterizzazione, laser, ago e altri strumenti, la pelle viene rifornita di nuovi precursori staminali dei fibroblasti provenienti dal midollo osseo, dal tessuto adiposo e dai periciti capillari, contribuendo al "ringiovanimento" del pool cellulare corporeo. Iniziano attivamente a sintetizzare collagene, elastina, enzimi, glicosamminoglicani, fattori di crescita e altre molecole biologicamente attive, il che porta ad una maggiore idratazione e vascolarizzazione del derma, migliorandone la resistenza,