Una fiala, due obiettivi: diagnosi portatile della tubercolosi basata su CRISPR con sensibilità del 100%

Un articolo su un test portatile per la tubercolosi che può essere eseguito direttamente dall'espettorato, senza attrezzature complesse, è stato pubblicato su Science Advances. L'amplificazione isotermica del DNA e la lettura CRISPR sono combinate in un'unica provetta; due inserzioni conservative di M. tuberculosis (IS6110 e IS1081) vengono testate contemporaneamente, più un gene umano come controllo interno del campione. In un piccolo test "cieco" su campioni clinici, il test ha fornito una sensibilità del 100% (6/6) e una specificità del 100% (7/7) rispetto alla coltura; il limite di rilevamento è di circa 69-81 UFC/ml nell'espettorato simulato. Il risultato è visibile su una striscia reattiva di carta e i reagenti sono liofilizzati (conservazione senza "catena del freddo").

Sfondo

Secondo l'OMS, la tubercolosi ucciderà circa 1,25 milioni di persone nel 2023; la tubercolosi è tornata ad essere la principale causa infettiva di morte, con una stima di 10,8 milioni di casi. Ciò rende fondamentale una diagnosi rapida e accessibile, soprattutto in contesti con risorse limitate.

• I test attuali rappresentano un compromesso tra accuratezza, velocità e prezzo. La coltura "gold standard" è molto accurata ma lenta; la microscopia è veloce ma poco sensibile; le piattaforme PCR come Xpert MTB/RIF Ultra sono significativamente più sensibili (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), ma richiedono attrezzature e cartucce costose, il che ne limita la copertura.
• Perché isotermica e CRISPR. L'amplificazione isotermica RPA funziona a 37-42 °C e non richiede termociclatori: è comoda "sul campo". La lettura CRISPR (Cas12/13) aggiunge specificità di specie e consente il flusso laterale visivo ("strip") senza ottiche complesse. In definitiva, questa è la strada verso test PVR portatili ed economici.
• Perché due target MBT contemporaneamente (IS6110 + IS1081). IS6110 è un inserto multicopia del complesso M. tuberculosis, ma alcune linee ne hanno poche copie e i test per IS6110 da solo potrebbero "non rilevare". L'aggiunta di un secondo inserto IS1081 riduce il rischio di risultati falsi negativi.
• Perché il controllo umano interno? I campioni di respiro possono contenere inibitori e campioni "cattivi". Il controllo umano endogeno (ad esempio RNasi P/DNA genomico) conferma che il materiale è adeguato e che la reazione non è soppressa, altrimenti il risultato non può essere considerato negativo.
• Il formato "one-pot" è di per sé importante. Riduce i passaggi, riduce il rischio di contaminazione e facilita il lavoro al di fuori del laboratorio. Tali approcci per la tubercolosi hanno già dimostrato la loro fattibilità; il nuovo lavoro estende l'idea a un formato a doppio bersaglio con controlli interni, oltre a dimostrare la liofilizzazione dei reagenti e un lettore di strisce reattive.
• Qual è il valore dell'articolo attuale? Gli autori hanno dimostrato la rilevazione direttamente dall'espettorato dopo la preparazione del campione più semplificata, il limite di rilevazione a ~70-80 CFU/ml nell'espettorato simulato e il 100% di sensibilità/specificità su un piccolo set cieco di campioni clinici: una buona "demo tecnica" per ulteriori convalide multicentriche.

Come funziona

• Gli scienziati hanno combinato la tecnica RPA (amplificazione isotermica rapida di materiale genetico a 37 °C) con gli enzimi "di taglio" Cas13a/Cas12a. Dopo aver selezionato gli RNA guida, hanno configurato il sistema per colpire due bersagli MBT simultaneamente e in parallelo al DNA umano (verificando che il materiale fosse presente nel campione e che la reazione non si fosse "bloccata").
• Tutta la chimica viene raccolta in una provetta; dopo l'incubazione, il risultato viene letto con un fluorimetro o su una striscia a flusso laterale, essenzialmente come un test rapido.
• Il trattamento dell'espettorato è stato semplificato, riducendolo al riscaldamento e a una breve centrifugazione, senza estrattori di acidi nucleici. Per le condizioni più limitate, gli autori discutono anche di alternative manuali alla centrifuga.

Cosa hanno mostrato i test

• Limite di rilevabilità: 69,0 CFU/ml (ceppo H37Rv) e 80,5 CFU/ml (BCG) nell'espettorato "spike". Non è stata rilevata alcuna reattività crociata con altri batteri/funghi.
• Contesto clinico (campioni in cieco): su 13 campioni provenienti da una pratica reale - sensibilità del 100% (6/6) e specificità del 100% (7/7) rispetto alla semina. A titolo di confronto, sullo stesso kit GeneXpert Ultra ha mostrato rispettivamente il 100% e l'86%.
• Dettagli tecnici: tra le due opzioni di lettura, Cas13a ha funzionato meglio (per il formato "one-pot", è più sensibile di Cas12a). Inoltre, il test parallelo di due target Mtb riduce il rischio di falsi risultati.

Perché è necessario?

I test odierni rappresentano un compromesso tra accuratezza, velocità e disponibilità: la coltura è molto accurata ma lenta; i tamponi sono veloci ma imprecisi; i sistemi PCR come GeneXpert sono accurati e veloci ma richiedono strumenti e cartucce costosi. Il nuovo approccio CRISPR mira a colmare il divario: diagnostica sul campo che opera a 37 °C, con letture su strisce di carta e la possibilità di conservare i reagenti senza refrigerazione.

Limitazioni e cosa succederà dopo

Si tratta di una dimostrazione preliminare su un piccolo campione clinico: sono necessari test multicentrici su larga scala (inclusa la coinfezione da HIV, nei bambini, con forme paucibacillari e diverse linee di MBT). Gli autori osservano separatamente che nella versione "sul campo", la centrifuga da tavolo dovrà essere sostituita con una soluzione completamente manuale. Ma l'architettura stessa – "due bersagli + controllo interno" in una provetta – ha già dimostrato la sua operatività e fornisce un chiaro percorso verso il perfezionamento per l'uso su larga scala.

Fonte: Alexandra G. Bell et al. Un test semplificato basato su CRISPR per la rilevazione della tubercolosi direttamente dall'espettorato, Science Advances, online 6 agosto 2025 (Vol. 11, Numero 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206