Le zanzare con uno "scudo genetico" integrato fermano la malaria: i tassi di infezione diminuiscono del 93%

Superare la resistenza agli insetticidi: come una singola modifica genetica nelle zanzare si autopropaga di generazione in generazione, eliminando virtualmente la trasmissione della malaria senza comprometterne la sopravvivenza.

In uno studio pubblicato di recente su Nature, un team di scienziati ha esaminato se l'allele della glutammina 224 (Q224) nella proteina 1 correlata al fibrinogeno (FREP1) rende le zanzare Anopheles stephensi resistenti all'infezione da Plasmodium, ha stimato i costi di sopravvivenza associati a questo allele e ha testato un sistema di gene drive allelico per diffondere questa mutazione protettiva tra le popolazioni.

Prerequisiti

Circa 600.000 persone sono morte di malaria nel 2023, per lo più bambini nell'Africa subsahariana e nell'Asia meridionale. I metodi tradizionali di controllo – zanzariere, trattamenti insetticidi, farmaci antimalarici – stanno perdendo la loro efficacia a causa della resistenza di zanzare e parassiti. Le tecnologie di gene drive che diffondono alleli benefici nelle popolazioni di zanzare offrono una soluzione promettente e sostenibile.

La proteina FREP1 aiuta i parassiti ad attraversare l'intestino medio della zanzara, ma la variante naturale Q224 può prevenire l'infezione senza compromettere la biologia della zanzara. L'obiettivo era verificare se un tale allele endogeno potesse essere distribuito in modo sicuro per ridurre la trasmissione della malaria mantenendo al contempo la vitalità della zanzara.

Informazioni sullo studio

Utilizzando CRISPR/Cas9, sono stati creati due ceppi di Anopheles stephensi che differivano solo per il 224° amminoacido della proteina FREP1: un ceppo selvatico con leucina (L224) e un ceppo potenzialmente protettivo con glutammina (Q224). L'RNA guida ha bersagliato una regione intronica 126 bp a monte del codone, consentendo la ricombinazione omologa con l'inserimento di un marcatore fluorescente (GFP o RFP).

L'idoneità è stata valutata in base alla lunghezza delle ali, alla fecondità, alla schiudibilità delle uova, alla impupamento, alla comparsa degli adulti e alla durata della vita (analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier).

La competenza del vettore è stata determinata utilizzando l'alimentazione standard con membrana dei parassiti Plasmodium falciparum (umano) e Plasmodium berghei (roditore), con conteggi di oocisti e sporozoiti nelle ghiandole salivari.

Il sistema di allele drive includeva una cassetta con gRNA contro L224 e Cas9 sotto il controllo del promotore vasa. Le frequenze alleliche sono state monitorate utilizzando tag fluorescenti in esperimenti multi-ciclo (10 generazioni). La genotipizzazione è stata eseguita utilizzando PCR, sequenziamento Sanger e NGS. La modellazione bayesiana ha stimato la conversione allelica, i costi di fitness e le dinamiche durante l'accoppiamento libero in laboratorio.

Risultati

L'allele FREP1Q224 non ha causato perdite significative in termini di sopravvivenza: lunghezza delle ali, fecondità, schiusa, impupamento e sfarfallamento degli adulti sono risultati identici a quelli del controllo FREP1L224. Piccole differenze nelle dimensioni e nella durata della vita dei maschi non hanno influenzato la competitività. Le femmine vergini FREP1Q224 hanno vissuto a lungo quanto i controlli, e le femmine dopo l'allattamento al sangue hanno mostrato solo una lieve diminuzione della durata della vita.

Gli esperimenti di sfida hanno rivelato una marcata protezione negli omozigoti.

• A basse concentrazioni di gametociti di P. falciparum (0,08%):
  • Il tasso di infezione è sceso dall'80% a circa il 30% in FREP1Q224;
  • Numero medio di oocisti: da 3 a 0;
  • Sporozoiti nelle ghiandole salivari: da >4000 a 0.
• A gametocitemia più elevata (0,15%):
  • Numero medio di oocisti: da ~32 a
  • Anche gli sporozoiti sono diminuiti drasticamente.
• Per P. berghei:
  • Numero medio di oocisti: da 43 a 25;
  • Sporozoiti: da ~19.000 a 11.000.
• Gli eterozigoti (FREP1L224/Q224) non erano protetti.

Efficienza della trasmissione genica

• Negli incroci accoppiati, Cas9 + gRNA L224 ha convertito dal 50 all'86% degli alleli FREP1L224 in FREP1Q224;
• Con Cas9 materno, la frequenza era più alta;
• Nella seconda generazione, la frequenza dell'allele protettivo ha raggiunto il 93%;
• L'incidenza di errori nel percorso di riparazione dell'NHEJ era bassa (0-12%) e in genere causava danni.
• Nelle popolazioni cellulari con un rapporto donatore:ricevente di 1:3, la frequenza di FREP1Q224 è aumentata dal 25% a >90% in 10 generazioni;
• La frequenza degli alleli NHEJ è scesa dal 5,4% a

La modellazione bayesiana ha supportato l'ipotesi di un'elevata conversione, di una bassa frequenza di mutazioni stabili e di un effetto di mosaicismo sterile letale, in cui gli omozigoti WT con genotipo Cas9 materno soffrivano di mutazioni somatiche e di una sopravvivenza ridotta.

Le generazioni successive hanno mostrato una soppressione quasi completa degli oocisti di P. falciparum (mediana da 0 a 5,5), confermando che la popolazione era diventata ampiamente refrattaria alla trasmissione del parassita.

L'allele protettivo non aveva benefici o effetti collaterali nascosti e si diffondeva tramite trasmissione.

Conclusioni

Lo studio ha scoperto che la sostituzione di un singolo amminoacido nella proteina FREP1 e lo spostamento della sua eredità mediante un gene drive potrebbero rendere l'Anopheles stephensi virtualmente immune alla malaria, sia umana che dei roditori, senza compromettere la vitalità delle zanzare.

Questo approccio integra le misure esistenti (reti, insetticidi, farmaci) la cui efficacia è ridotta dalla resistenza. Un sistema di questo tipo può essere utilizzato anche per ripristinare la sensibilità agli insetticidi o introdurre altri alleli protettivi.

Prima che la tecnologia possa essere implementata, sono necessari rigorosi quadri di riferimento ambientali, etici e di governance, nonché sistemi di controllo della diffusione.