Analisi del polimorfismo di lunghezza del frammento di restrizione

L'uso diffuso di diverse endonucleasi di restrizione per l'analisi del DNA cromosomico ha rivelato l'enorme variabilità del genoma umano. Anche piccole alterazioni nelle regioni codificanti e regolatrici dei geni strutturali possono portare all'interruzione della sintesi di una determinata proteina o alla perdita della sua funzione nell'organismo umano, con conseguenti effetti sul fenotipo del paziente. Tuttavia, circa il 90% del genoma umano è costituito da sequenze non codificanti, che sono più variabili e contengono numerose cosiddette mutazioni neutre, o polimorfismi, e non hanno espressione fenotipica. Tali regioni polimorfiche (loci) vengono utilizzate nella diagnosi di malattie ereditarie come marcatori genetici. I loci polimorfici sono presenti in tutti i cromosomi e sono legati a una specifica regione del gene. Determinando la localizzazione di un locus polimorfico, è possibile stabilire quale gene sia associato alla mutazione che ha causato la malattia nel paziente.

Per isolare regioni polimorfiche del DNA, si utilizzano enzimi batterici, le restrizioni, i cui prodotti sono siti di restrizione. Le mutazioni spontanee che si verificano nei siti polimorfici li rendono resistenti o, al contrario, sensibili all'azione di una specifica restrizione.

La variabilità mutazionale nei siti di restrizione può essere rilevata modificando la lunghezza dei frammenti di DNA di restrizione, separandoli mediante elettroforesi e successiva ibridazione con sonde specifiche. In assenza di restrizione in un sito polimorfico, un frammento di grandi dimensioni verrà rilevato sugli elettroforegrammi e, in sua presenza, sarà presente un frammento più piccolo. La presenza o l'assenza di un sito di restrizione in loci identici di cromosomi omologhi consente una marcatura abbastanza affidabile del gene mutante e di quello normale e di tracciarne la trasmissione alla prole. Pertanto, quando si studia il DNA di pazienti in entrambi i cromosomi in cui è presente un sito di restrizione in una regione polimorfica, verranno rilevati sull'elettroforegramma frammenti di DNA corti. Nei pazienti omozigoti per una mutazione che modifica il sito di restrizione polimorfico, verranno rilevati frammenti più lunghi e nei pazienti eterozigoti, frammenti corti e lunghi.

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