Cellule staminali mesenchimali

Tra le cellule staminali regionali, un posto speciale è occupato dalle cellule staminali mesenchimali (MSC), i cui derivati costituiscono la matrice stromale di tutti gli organi e tessuti del corpo umano. La priorità nella ricerca sulle MSC spetta ai rappresentanti della scienza biologica russa.

A metà del secolo scorso, nel laboratorio di A. Friedenstein, è stata isolata per la prima volta una coltura omogenea di cellule staminali stromali multipotenti del midollo osseo. Le cellule staminali mesenchimali, attaccate al substrato, hanno mantenuto un'elevata intensità di proliferazione per lungo tempo e, in colture con una bassa densità di semina dopo la fissazione sul substrato, hanno formato cloni di cellule fibroblasto-simili prive di attività fagocitaria. L'arresto della proliferazione delle MSC si è concluso con la loro differenziazione spontanea in vitro in cellule di osso, grasso, cartilagine, muscolo o tessuto connettivo. Ulteriori studi hanno permesso di stabilire il potenziale osteogenico delle cellule fibroblasto-simili dello stroma del midollo osseo di diverse specie di mammiferi, nonché la loro attività formante colonie. Esperimenti in vivo hanno dimostrato che il trapianto, sia eterotopico che ortotopico, di cellule fibroblasto-simili formanti colonie porta alla formazione di osso, cartilagine, tessuto fibroso e adiposo. Poiché le cellule staminali stromali del midollo osseo sono caratterizzate da un'elevata capacità di autorigenerazione e di differenziazione multiforme all'interno di una singola linea cellulare, sono chiamate cellule progenitrici mesenchimali multipotenti.

È opportuno sottolineare che in oltre 45 anni di ricerca fondamentale sulle cellule staminali mesenchimali si sono create le condizioni reali per l'utilizzo dei loro derivati nella pratica clinica.

Oggi non vi è dubbio che tutti i tessuti del corpo umano siano formati da cellule staminali di diverse linee cellulari, come risultato dei processi di proliferazione, migrazione, differenziazione e maturazione. Tuttavia, fino a poco tempo fa si riteneva che le cellule staminali in un organismo adulto fossero tessuto-specifiche, ovvero capaci di produrre linee di cellule specializzate solo dei tessuti in cui si trovano. Questa posizione concettuale è stata confutata dai dati relativi alla trasformazione delle cellule staminali emopoietiche non solo in elementi cellulari del sangue periferico, ma anche in cellule ovali del fegato. Inoltre, le cellule staminali neurali si sono rivelate in grado di dare origine sia a neuroni che a elementi gliali, nonché a linee precoci di cellule progenitrici emopoietiche impegnate. A loro volta, le cellule staminali mesenchimali, che solitamente producono elementi cellulari di osso, cartilagine e tessuto adiposo, sono in grado di trasformarsi in cellule staminali neurali. Si presume che nel processo di crescita, rigenerazione tissutale fisiologica e riparativa, le cellule progenitrici non impegnate vengano generate da riserve staminali tessuto-non-specifiche. Ad esempio, la riparazione del tessuto muscolare può essere realizzata grazie alla migrazione delle cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo ai muscoli scheletrici.

Sebbene tale intercambiabilità incrociata delle cellule staminali non sia riconosciuta da tutti i ricercatori, la possibilità di un uso clinico delle cellule staminali mesenchimali come fonte per il trapianto cellulare e vettore cellulare di informazioni genetiche non è più messa in discussione da nessuno, così come la multipotenza delle cellule staminali stromali del midollo osseo, che possono essere isolate ed espanse in vitro con relativa facilità. Allo stesso tempo, nella letteratura scientifica continuano ad apparire rapporti sulla potenziale pluripotenza delle cellule staminali stromali del midollo osseo. A riprova di ciò, vengono citati protocolli di ricerca in cui, sotto l'influenza di specifici induttori di transdifferenziazione, le MSC vengono trasformate in cellule nervose, cardiomiociti ed epatociti. Tuttavia, alcuni scienziati nutrono seri dubbi sulla possibilità di una ripetuta attivazione ed espressione di geni fin dalla fase iniziale dell'embriogenesi. Allo stesso tempo, è chiaro a tutti che, se si troveranno le condizioni per estendere la multipotenza delle cellule staminali mesenchimali alla pluripotenza delle ESC, molti problemi etici, morali, religiosi e legali nella medicina plastica rigenerativa saranno automaticamente risolti. Inoltre, poiché in questo caso la fonte del potenziale rigenerativo delle cellule staminali sono le cellule stromali autologhe del paziente, viene risolto anche il problema del rigetto immunitario del trapianto cellulare. Il prossimo futuro mostrerà quanto siano realistiche queste prospettive.

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Utilizzo delle cellule staminali mesenchimali in medicina

In clinica, l'uso di derivati delle cellule staminali mesenchimali è principalmente associato al ripristino dei difetti tissutali che si verificano in caso di lesioni cutanee termiche estese e profonde. Nella fase preclinica, è stata condotta una valutazione sperimentale della fattibilità dell'utilizzo di cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili allogeniche per il trattamento delle ustioni profonde. È stato dimostrato che le cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili del midollo osseo formano un monostrato in coltura, il che rende possibile il loro trapianto per ottimizzare i processi di rigenerazione delle ustioni profonde. Gli autori osservano che i fibroblasti embrionali presentano una proprietà simile, ma il loro utilizzo clinico è limitato da problemi etici e legali esistenti. Un'ustione termica profonda con danni a tutti gli strati cutanei è stata modellata sui ratti Wistar. L'area ustionata era pari al 18-20% della superficie cutanea totale. Il primo gruppo sperimentale includeva ratti con ustione termica profonda e trapianto di cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili allogeniche. Il secondo gruppo era costituito da animali con ustione termica profonda e trapianto di fibroblasti embrionali allogenici. Il terzo gruppo era rappresentato da ratti di controllo con ustioni termiche profonde, non sottoposti a terapia cellulare. Una sospensione di cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili e fibroblasti embrionali è stata applicata sulla superficie dell'ustione utilizzando una pipetta in una quantità pari a 2 x 10 ⁴cellule il 2° giorno dopo la modellazione dell'ustione e l'escissione della crosta necrotica risultante. Dopo il trapianto cellulare, la superficie dell'ustione è stata coperta con una garza imbevuta di soluzione isotonica di cloruro di sodio con gentamicina. Le cellule del midollo osseo sono state raccolte per ottenere MSC con la loro successiva induzione in una linea di cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili da ratti Wistar adulti da femori. I fibroblasti embrionali sono stati ottenuti dai polmoni di embrioni di 14-17 giorni di età. I fibroblasti embrionali e le cellule del midollo osseo per ottenere MSC sono stati coltivati preliminarmente in piastre Petri a una temperatura di 37 °C in un incubatore a CO2, in un'atmosfera con il 5% di CO2 e il 95% di umidità. I fibroblasti embrionali sono stati coltivati per 4-6 giorni, mentre la formazione di un monostrato di MSC ha richiesto dai 14 ai 17 giorni. Successivamente, le MSC sono state crioconservate come materiale di origine per cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili, ottenute scongelandole e coltivandole per 4 giorni. Il numero di cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili formate è risultato oltre 3 volte superiore al numero di fibroblasti embrionali formatisi durante lo stesso periodo di coltivazione. Per identificare le cellule trapiantate nelle ustioni in fase di coltivazione, il loro genoma è stato marcato utilizzando un vettore shuttle virale basato sull'adenovirus ricombinante di tipo V che trasporta il gene 1ac-2 che codifica per la ß-galattosidasi di E. coli. Le cellule vive a diversi tempi dal trapianto sono state rilevate immunoistochimicamente in criosezioni con l'aggiunta di substrato X-Gal, che conferisce una caratteristica colorazione blu-verde. Grazie alla valutazione visiva, planimetrica e istologica dinamica delle condizioni della ferita da ustione, è stato stabilito che già al terzo giorno dal trapianto cellulare si manifestavano differenze significative nel decorso della ferita nei gruppi selezionati. Questa differenza è diventata particolarmente evidente il settimo giorno dopo il trapianto cellulare. Negli animali del primo gruppo, in cui erano state trapiantate cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili, la ferita ha acquisito un colore rosa uniformemente intenso, il tessuto di granulazione è cresciuto su tutta la sua area fino al livello dell'epidermide e la superficie dell'ustione si è significativamente ridotta di dimensioni. Il film di collagene formatosi sulla superficie della ferita si è leggermente assottigliato, ma ha continuato a ricoprire l'intera area ustionata. Negli animali del secondo gruppo, in cui erano stati trapiantati fibroblasti embrionali, il tessuto di granulazione è salito fino al livello dell'epidermide dei margini della ferita, ma solo in alcuni punti, mentre la plasmorrea dalla ferita era più intensa rispetto al primo gruppo e il film di collagene inizialmente formatosi è praticamente scomparso. Negli animali che non avevano ricevuto la terapia cellulare, al settimo giorno la ferita da ustione si presentava pallida, butterata, con tessuto necrotico ricoperto di fibrina. La plasmorea è stata osservata su tutta la superficie ustionata. Istologicamente, gli animali del 1° e 2° gruppo hanno mostrato una diminuzione dell'infiltrazione cellulare e dello sviluppo della rete vascolare,e questi segni dell'incipiente processo rigenerativo erano più pronunciati nei ratti del 1° gruppo. Nel gruppo di controllo, sono stati osservati segni di infiltrazione cellulare della ferita, il quadro istologico dei vasi di nuova formazione era assente. Tra il 15° e il 30° giorno di osservazione, l'area della superficie ustionata negli animali del 1° gruppo era significativamente inferiore rispetto ai ratti degli altri gruppi e la superficie di granulazione era più sviluppata. Negli animali del 2° gruppo, l'area della superficie ustionata è diminuita anche rispetto alle dimensioni delle ferite da ustione nei ratti del gruppo di controllo, a causa dell'epitelizzazione marginale. Nel gruppo di controllo, la superficie ustionata è rimasta pallida in alcuni punti con rare granulazioni, su di essa sono comparsi asterischi vascolari, erano presenti isole di placca fibrinosa, una moderata plasmorrea persisteva su tutta la superficie ustionata e in alcuni punti persisteva una crosta difficilmente separabile. In generale, negli animali del 3° gruppo, anche le dimensioni della ferita sono diminuite, ma i margini della ferita sono rimasti compromessi.

Pertanto, durante uno studio comparativo sulla velocità di guarigione delle ferite utilizzando cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili e fibroblasti embrionali, nonché senza l'uso di terapia cellulare, è stata osservata un'accelerazione della velocità di guarigione della superficie dell'ustione a seguito del trapianto di cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili e fibroblasti embrionali. Tuttavia, nel caso dell'utilizzo di cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili allogeniche, la velocità di guarigione delle ferite è risultata superiore rispetto al trapianto di fibroblasti embrionali. Ciò si è tradotto in un'accelerazione del cambiamento di fase del processo rigenerativo: i tempi di infiltrazione cellulare sono stati ridotti, il tasso di crescita della rete vascolare è aumentato, così come la formazione di tessuto di granulazione.

I risultati della planimetria dinamica indicano che il tasso di guarigione spontanea della ferita da ustione (senza l'uso di terapia cellulare) è stato il più basso. Al 15° e 30° giorno dopo il trapianto di cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili allogeniche, il tasso di guarigione della ferita è stato superiore rispetto al trapianto di fibroblasti embrionali. Il metodo istochimico per il rilevamento della beta-galattosidasi ha mostrato che dopo il trapianto di cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili e fibroblasti embrionali, le cellule trapiantate rimangono vitali sulla superficie e nella profondità delle ferite in rigenerazione per l'intero periodo di osservazione. Gli autori ritengono che il più alto tasso di rigenerazione delle ferite da ustione con l'uso di cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili sia dovuto al rilascio di fattori stimolanti la crescita biologicamente attivi da parte di queste cellule durante il processo di maturazione.

Anche il trapianto di cheratinociti autologhi o allogenici e di fibroblasti allogenici per il trattamento delle ustioni è stato utilizzato nella pratica clinica. È importante notare che il trattamento chirurgico dei bambini con ustioni profonde ed estese è un compito complesso a causa dell'elevata natura traumatica, dei molteplici interventi chirurgici, della significativa perdita di sangue e delle diverse reazioni ai mezzi di infusione utilizzati. Le principali difficoltà nell'esecuzione di interventi di chirurgia plastica cutanea per ustioni profonde ed estese, con un'area superiore al 40% della superficie corporea, sono dovute alla gravità delle condizioni delle vittime e alla mancanza di risorse cutanee da donatore. L'uso di trapianti di mesh con un elevato coefficiente di perforazione non risolve il problema, poiché le cellule formate dopo la perforazione epitelizzano molto lentamente e i lembi cutanei stessi spesso si lisano o si seccano. Rivestimenti per ustioni come xenoskin, alloinnesti da cadavere e rivestimenti in film sintetici non sono sempre sufficientemente efficaci, pertanto si stanno sviluppando nuovi metodi per coprire le superfici ustionate con strati di cheratinociti e fibroblasti coltivati. In particolare, è stato proposto un metodo di copertura delle superfici ustionate con l'ausilio di allofibroblasti coltivati, i quali, una volta trapiantati, esercitano un marcato effetto stimolante sulla proliferazione degli epidermociti conservati nella ferita nelle ustioni borderline, nonché dei cheratinociti nei setti dei trapianti di mesh. Il lavoro di L. Budkevich e coautori (2000) presenta i risultati dell'utilizzo di questo metodo per il trattamento delle ustioni nei bambini. Lo studio ha incluso 31 bambini con trauma termico di età compresa tra 1 e 14 anni. In tre bambini, l'area totale delle ustioni di grado IIIA-B - IV era del 40%, in 25 del 50-70%, in altri tre del 71-85% della superficie corporea. La necrectomia chirurgica precoce è stata combinata con il trapianto di allofibroblasti coltivati e l'autodermoplastica. La prima fase del trattamento ha comportato l'escissione dei tessuti necrotici, la seconda fase ha comportato il trapianto di allofibroblasti in coltura su pellicole di supporto e la terza fase (48 ore dopo il trapianto di allofibroblasti in coltura) ha comportato la rimozione della matrice e l'autodermoplastica con lembi cutanei con un rapporto di perforazione di 1:4. Tre pazienti ricoverati in clinica con ustioni gravi sono stati sottoposti a trapianto di allofibroblasti in coltura su ferite in fase di granulazione. Il trapianto di allofibroblasti in coltura è stato eseguito una volta in 18 bambini, due volte in 11 bambini e tre volte in due pazienti. L'area della superficie della ferita coperta dalla coltura cellulare variava da 30 a 3500 cm². L'efficacia degli allofibroblasti in coltura è stata valutata in base alla percentuale complessiva di attecchimento dell'innesto cutaneo, ai tempi di guarigione dell'ustione e al numero di decessi per trauma termico grave. L'attecchimento dell'innesto è stato completo nell'86% dei pazienti. Il mancato attecchimento parziale degli innesti cutanei è stato osservato nel 14% dei casi. Nonostante il trattamento, sei bambini (19,3%) sono deceduti. L'area totale delle lesioni cutanee variava dal 40 al 70% della superficie corporea.Il trapianto di allofibroblasti coltivati non è stato associato alla mortalità per ustione in nessun paziente.

Analizzando i risultati del trattamento, gli autori osservano che in precedenza un danno cutaneo termico profondo che copriva il 35-40% della superficie corporea era considerato incompatibile con la vita (per i bambini più piccoli - fino a 3 anni - le ustioni profonde che coprono il 30% della superficie corporea sono critiche, per i bambini più grandi - oltre il 40% della superficie corporea). Quando si esegue la necrectomia chirurgica con trapianto di allofibroblasti coltivati e successiva autodermoplastica con lembi cutanei ad alto coefficiente di perforazione, le ustioni di grado IIIB-IV rimangono critiche, ma al momento ci sono prospettive di salvare la vita anche di queste vittime in molti casi. La necrectomia chirurgica in combinazione con trapianto di allofibroblasti coltivati e autodermoplastica nei bambini con ustioni profonde si è dimostrata particolarmente efficace nei pazienti con lesioni cutanee diffuse con carenza di siti donatori. La tattica chirurgica attiva e il trapianto di allofibroblasti coltivati contribuiscono alla rapida stabilizzazione delle condizioni generali di questi pazienti, alla riduzione del numero di complicanze infettive delle ustioni, alla creazione di condizioni favorevoli per l'attecchimento dei trapianti, alla riduzione dei tempi di ripristino della cute persa e della durata del trattamento ospedaliero, nonché alla diminuzione della frequenza di esiti fatali nelle vittime di ustioni estese. Pertanto, il trapianto di allofibroblasti coltivati con successiva autodermoplastica con lembi cutanei consente la guarigione nei bambini con ustioni gravi, precedentemente considerati indifesi.

È generalmente accettato che l'obiettivo primario del trattamento delle ustioni sia il ripristino più completo e rapido possibile della cute danneggiata, al fine di prevenire effetti tossici, complicanze infettive e disidratazione. I risultati dell'utilizzo di cellule in coltura dipendono in larga misura dalla predisposizione della ferita da ustione al trapianto. Nel caso di trapianto di cheratinociti in coltura sulla superficie della ferita dopo necrectomia chirurgica, una media del 55% (per area) delle cellule trapiantate attecchisce, mentre nelle ferite di granulazione il tasso di attecchimento scende al 15%. Pertanto, il trattamento efficace di ustioni cutanee profonde ed estese richiede, innanzitutto, una tattica chirurgica attiva. In presenza di ustioni di grado IIIB-IV, la superficie dell'ustione viene immediatamente liberata dal tessuto necrotico al fine di ridurre l'intossicazione e il numero di complicanze delle ustioni. L'uso di tali tattiche è fondamentale per ridurre il tempo intercorso tra il momento dell'ustione e la sua chiusura e la durata della degenza ospedaliera dei pazienti con ustioni estese, riducendo inoltre significativamente il numero di esiti fatali.

Le prime segnalazioni di utilizzo efficace di cheratinociti coltivati per la copertura di superfici ustionate risalgono ai primi anni '80. Successivamente, questa manipolazione è stata eseguita utilizzando strati di cheratinociti coltivati, il più delle volte ottenuti da autocellule, molto meno spesso da allocheratinociti. Tuttavia, la tecnologia dell'autocheratinocitoplastica non consente la creazione di una banca cellulare, mentre il tempo necessario per produrre un trapianto di cheratinociti di area sufficiente è lungo e ammonta a 3-4 settimane. Durante questo periodo, il rischio di sviluppare infezioni e altre complicazioni delle ustioni aumenta drasticamente, il che prolunga significativamente la durata totale della degenza ospedaliera dei pazienti. Inoltre, gli autocheratinociti praticamente non attecchiscono quando trapiantati su ustioni in fase di granulazione e l'elevato costo di terreni di coltura speciali e di stimolatori biologicamente attivi della crescita dei cheratinociti ne limita significativamente l'uso clinico. Altri metodi biotecnologici, come la collagenoplastica, il trapianto di xenoskin crioconservato e l'uso di vari rivestimenti biopolimerici, aumentano l'efficacia del trattamento di ustioni superficiali estese, ma non di quelle profonde. Il metodo di copertura della superficie della ferita con fibroblasti coltivati è fondamentalmente diverso in quanto i fibroblasti, anziché i cheratinociti, vengono utilizzati come componente principale dello strato cellulare coltivato.

Il prerequisito per lo sviluppo del metodo era il dato che i periciti che circondano i piccoli vasi sono cellule mesenchimali progenitrici capaci di trasformarsi in fibroblasti che producono numerosi fattori di crescita e garantiscono la guarigione delle ferite grazie a un forte effetto stimolante sulla proliferazione e l'adesione dei cheratinociti. L'uso di fibroblasti in coltura per la chiusura delle superfici delle ferite ha immediatamente rivelato una serie di vantaggi significativi di questo metodo rispetto all'uso di cheratinociti in coltura. In particolare, l'ottenimento di fibroblasti in coltura non richiede l'uso di terreni nutritivi speciali e stimolanti della crescita, il che riduce il costo del trapianto di oltre 10 volte rispetto al costo dell'ottenimento dei cheratinociti. I fibroblasti sono facilmente passivati, durante i quali perdono parzialmente gli antigeni di istocompatibilità di superficie, il che a sua volta apre la possibilità di utilizzare cellule allogeniche per la produzione di trapianti e la creazione delle relative banche. Il tempo necessario per ottenere trapianti pronti per l'uso in clinica si riduce da 3 settimane (per i cheratinociti) a 1-2 giorni (per i fibroblasti). Una coltura primaria di fibroblasti può essere ottenuta coltivando cellule da frammenti di pelle prelevati durante l'autodermoplastica, e la densità di semina cellulare per ottenere sottocolture di fibroblasti umani è di sole 20 x 10³ ^per 1 ^cm².

Al fine di studiare l'effetto dei fibroblasti e delle loro proteine regolatrici sulla proliferazione e la differenziazione dei cheratinociti, è stata eseguita un'analisi comparativa della morfologia e della proliferazione dei cheratinociti su substrati di collagene di tipo I e III, nonché di fibronectina in una coltura congiunta con fibroblasti umani. I cheratinociti umani sono stati isolati da frammenti di pelle di pazienti con ustioni, prelevati durante l'autodermoplastica. La densità di semina dei cheratinociti era di 50 x 103 cellule per 1 cm². L'efficacia clinica del trapianto di fibroblasti in coltura è stata valutata in 517 pazienti. Tutti i pazienti sono stati suddivisi in due gruppi: Gruppo 1 - vittime adulte con ustioni di grado IIA, B - IV; Gruppo 2 - bambini con ustioni profonde di grado IIIB - IV. La valutazione della dinamica dell'organizzazione strutturale e funzionale dei fibroblasti in coltura monostrato, tenendo conto del ruolo dei glicosamminoglicani, della fibronectina e del collagene nei processi di rigenerazione, ha permesso agli autori di determinare il terzo giorno come il periodo più favorevole per l'utilizzo di colture di fibroblasti per la realizzazione di trapianti. Uno studio sull'effetto dei fibroblasti sulla proliferazione e la differenziazione dei cheratinociti ha dimostrato che i fibroblasti in vitro hanno un pronunciato effetto stimolante, principalmente sui processi di adesione dei cheratinociti, aumentando di oltre 2 volte il numero di cellule adese e la velocità della loro fissazione. La stimolazione dei processi di adesione è accompagnata da un aumento dell'intensità della sintesi del DNA e del livello di proliferazione dei cheratinociti. Inoltre, è emerso che la presenza di fibroblasti e della matrice extracellulare da essi formata è una condizione necessaria per la formazione dell'apparato tonofibrillare dei cheratinociti, delle connessioni intercellulari e, in definitiva, per la differenziazione dei cheratinociti e la formazione della membrana basale. Nel trattamento dei bambini con ustioni profonde, è stata dimostrata un'elevata efficacia clinica del trapianto di colture di allofibroblasti, in particolare nel gruppo di pazienti con lesioni cutanee estese in condizioni di carenza del sito donatore. Uno studio morfofunzionale completo ha dimostrato che i fibroblasti trapiantati sono caratterizzati dalla sintesi attiva di DNA, nonché di collagene, fibronectina e glicosaminoglicani, che fanno parte della matrice extracellulare formata dalle cellule. Gli autori sottolineano un'alta percentuale di attecchimento dei fibroblasti trapiantati (fino al 96%), una netta riduzione del tempo di ricezione (entro 24-48 ore anziché 2-3 settimane nel caso dell'utilizzo di cheratinociti), una significativa accelerazione dell'epitelizzazione della superficie ustionata e una significativa riduzione (di 10 volte) del costo della tecnologia per la crescita di un trapianto da fibroblasti rispetto al trapianto di cheratinociti. L'uso del trapianto di allofibroblasti coltivati consente di salvare la vita di bambini con ustioni critiche - danni termici su oltre il 50% della superficie corporea,che in precedenza era considerato incompatibile con la vita. Va notato che con il trapianto di fibroblasti embrionali allogenici, è stata dimostrata in modo convincente non solo una più rapida rigenerazione delle ferite e una convalescenza più rapida nei pazienti con ustioni di vario grado e area, ma anche una significativa riduzione della loro mortalità.

I fibroblasti autologhi vengono utilizzati anche in un'area complessa della chirurgia plastica come la correzione ricostruttiva delle lesioni delle corde vocali. A questo scopo viene solitamente utilizzato il collagene bovino, la cui durata d'azione è limitata dalla sua immunogenicità. Essendo una proteina estranea, il collagene bovino è sensibile alla collagenasi del ricevente e può causare reazioni immunitarie, per ridurre il rischio di reazioni di questo tipo sono state sviluppate tecnologie per ottenere preparati di collagene reticolati con glutaraldeide. Il loro vantaggio risiede in una maggiore stabilità e in una minore immunogenicità, che ha trovato applicazione pratica nell'eliminazione di difetti e atrofie delle corde vocali. Le iniezioni di collagene autologo sono state utilizzate per la prima volta nel 1995. La tecnica ha garantito la conservazione della struttura primaria delle fibre di collagene autologo, inclusi i legami crociati intramolecolari catalizzati da enzimi. Il fatto è che le fibre di collagene naturale sono più resistenti alla distruzione da parte delle proteasi rispetto al collagene ricostituito, in cui i telopeptidi vengono tagliati. L'integrità dei telopeptidi è importante per la struttura quaternaria delle fibre di collagene e per la formazione di legami crociati tra molecole di collagene adiacenti. A differenza delle preparazioni di collagene bovino, il collagene autologo non causa reazioni immunitarie nel ricevente, ma non è sufficientemente efficace come agente di reintegro. Una correzione stabile può essere ottenuta attraverso la produzione locale di collagene mediante trapianto di fibroblasti autologhi. Tuttavia, durante lo studio dell'efficacia del trapianto di fibroblasti autologhi in clinica sono state identificate alcune difficoltà. Nel periodo iniziale successivo al trapianto di fibroblasti, l'effetto clinico è stato più debole rispetto a quello ottenuto dopo l'introduzione di collagene bovino. Nella coltura di fibroblasti autologhi, non si può escludere la possibilità che i fibroblasti normali si trasformino in fibroblasti patologici, i cosiddetti miofibroblasti, responsabili dello sviluppo di fibrosi e formazione di cicatrici, come evidenziato dalla contrazione del gel di collagene causata dall'interazione specifica tra fibroblasti e fibrille di collagene. Inoltre, dopo i passaggi seriali in vitro, i fibroblasti perdono la capacità di sintetizzare le proteine della matrice extracellulare.

Tuttavia, è stato recentemente sviluppato sperimentalmente un metodo per la coltura di fibroblasti umani autologhi che elimina le carenze sopra menzionate e non provoca la trasformazione oncogenica dei fibroblasti normali. I fibroblasti autologhi ottenuti con questo metodo vengono utilizzati per riparare difetti nei tessuti molli del viso. In uno studio di G. Keller et al. (2000), sono stati trattati 20 pazienti di età compresa tra 37 e 61 anni con rughe e cicatrici atrofiche. Biopsie cutanee (4 mm) prelevate dalla regione retroauricolare sono state trasportate in laboratorio in provette sterili contenenti 10 ml di terreno di coltura (terreno di Eagle con antibiotico, micosettico, piruvato e siero fetale di vitello). Il materiale è stato posto all'interno di 3-5 piastre di coltura di 60 mm di diametro e incubate in un termostato con un'atmosfera contenente il 5% di CO2. Dopo 1 settimana, le cellule sono state rimosse dalle piastre mediante tripsinizzazione e collocate in fiale da 25 cm². Le cellule sono state iniettate nei pazienti in una quantità pari a 4 x 107. Un effetto clinico significativo e persistente è stato osservato nei pazienti durante la correzione delle pieghe naso-labiali, così come nei pazienti con cicatrici a 7 e 12 mesi dal terzo trapianto di fibroblasti autologhi. Secondo la citometria a flusso, i fibroblasti in coltura hanno prodotto un'elevata quantità di collagene di tipo I. Studi in vitro hanno mostrato una normale contrattilità dei fibroblasti iniettati. Due mesi dopo la somministrazione sottocutanea di fibroblasti in coltura a una dose di 4 x 107 cellule, non è stata rilevata alcuna neoplasia nei topi nudi. I fibroblasti iniettati non hanno causato cicatrici o fibrosi diffusa nei pazienti. Secondo l'autore, i fibroblasti autologhi innestati sono in grado di produrre costantemente collagene, il che fornirà un effetto di ringiovanimento estetico. Allo stesso tempo, poiché la durata di vita delle cellule differenziate è limitata, i fibroblasti prelevati da un paziente giovane sono più efficaci di quelli ottenuti da persone anziane. In futuro, si presume che sarà possibile crioconservare una coltura di fibroblasti prelevati da un giovane donatore per poi trapiantare le sue cellule giovani in un paziente anziano. In conclusione, non è del tutto corretto affermare che i fibroblasti autologhi, purché funzionalmente conservati, siano un mezzo ideale per correggere i difetti dei tessuti molli del viso. Allo stesso tempo, l'autore stesso osserva che durante lo studio sono emerse alcune situazioni problematiche legate all'uso del sistema fibroblasti-collagene autologhi. L'effetto clinico è stato spesso più debole rispetto all'utilizzo del collagene bovino, il che ha causato delusione nei pazienti.

In generale, i dati della letteratura sulle prospettive per l'uso clinico delle cellule staminali mesenchimali appaiono piuttosto ottimistici. Si stanno tentando di utilizzare cellule progenitrici mesenchimali multipotenti autologhe da midollo osseo per trattare lesioni articolari degenerative. Sono in corso i primi studi clinici sull'uso di cellule progenitrici mesenchimali coltivate nel trattamento di fratture ossee complesse. Le cellule stromali mesenchimali autologhe e allogeniche da midollo osseo vengono utilizzate per creare tessuto cartilagineo da trapiantare nella correzione di difetti della cartilagine articolare dovuti a traumi o lesioni autoimmuni. Sono in fase di sviluppo metodi per l'uso clinico di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti per eliminare difetti ossei nei bambini con una grave forma di osteogenesi incompleta causata da mutazioni nel gene del collagene di tipo I. Dopo la mieloablazione, i bambini riceventi vengono trapiantati con midollo osseo proveniente da donatori sani HLA-compatibili, poiché il midollo osseo non frazionato può contenere un numero sufficiente di cellule staminali mesenchimali per compensare un grave difetto osseo. Dopo il trapianto di midollo osseo allogenico, questi bambini hanno mostrato alterazioni istologiche positive nelle ossa trabecolari, un aumento del tasso di crescita e una riduzione dell'incidenza di fratture ossee. In alcuni casi, si ottiene un risultato clinico positivo trapiantando midollo osseo allogenico e osteoblasti strettamente correlati. Il trapianto di MSC viene utilizzato anche per trattare la fragilità ossea congenita causata da uno squilibrio tra osteoblasti e osteoclasti nel tessuto osseo. In questo caso, il ripristino della formazione ossea si ottiene attraverso la chimerizzazione del pool di cellule staminali e progenitrici stromali nel tessuto osseo dei pazienti.

Continua il miglioramento dei metodi di modificazione genetica delle cellule staminali mesenchimali del donatore per la correzione dei difetti genetici dei tessuti stromali. Si prevede che nel prossimo futuro le cellule progenitrici mesenchimali saranno utilizzate in neurologia per la chimerizzazione mirata delle cellule cerebrali e la creazione di un pool cellulare sano in grado di generare enzimi o fattori carenti responsabili delle manifestazioni cliniche della malattia. Il trapianto di cellule staminali mesenchimali può essere utilizzato per il ripristino dello stroma del midollo osseo nei pazienti oncologici dopo radioterapia e chemioterapia e, in combinazione con cellule del midollo osseo, per il ripristino dell'emopoiesi. Lo sviluppo di una terapia sostitutiva volta all'eliminazione dei difetti del sistema muscolo-scheletrico con l'ausilio delle MSC è promosso dagli sviluppi ingegneristici nel campo della progettazione di biomateriali a matrice o di biomimetici che formano strutture popolate dalla progenie di cellule staminali mesenchimali.

Fonti di cellule staminali mesenchimali

La principale fonte di cellule staminali mesenchimali è il midollo osseo, le cui cellule staminali emopoietiche presenti nell'organismo dei mammiferi si differenziano costantemente in cellule del sangue e del sistema immunitario, mentre le cellule staminali mesenchimali sono rappresentate da una piccola popolazione di cellule fibroblasto-simili dello stroma del midollo osseo e contribuiscono al mantenimento dello stato indifferenziato delle cellule staminali emopoietiche. In determinate condizioni, le cellule staminali mesenchimali si differenziano in cellule cartilaginee e ossee. Quando seminate su un terreno di coltura in condizioni di impianto a bassa densità, le cellule stromali mononucleari del midollo osseo formano colonie di cellule adesive, che sono, in realtà, cellule progenitrici mesenchimali multipotenti fibroblasto-simili. Alcuni autori ritengono che le cellule staminali mesenchimali non impegnate si depositino nel midollo osseo e, grazie alla loro capacità di autorigenerarsi e all'elevato potenziale di differenziazione, forniscano a tutti i tessuti del corpo precursori mesenchimali degli elementi stromali per tutta la vita dell'organismo dei mammiferi.

Nel midollo osseo, gli elementi cellulari stromali formano una rete che riempie lo spazio tra i sinusoidi e il tessuto osseo. Il contenuto di MSC dormienti nel midollo osseo di un adulto è paragonabile alla quantità di cellule staminali emopoietiche e non supera lo 0,01-0,001%. Le cellule staminali mesenchimali isolate dal midollo osseo e non sottoposte a coltura sono prive di molecole di adesione. Tali MSC non esprimono CD34, ICAM, VCAM, collagene di tipo I e III, CD44 e CD29. Di conseguenza, in vitro, non sono le cellule staminali mesenchimali a fissarsi sul substrato di coltura, ma derivati progenitori più avanzati di cellule staminali mesenchimali che hanno già formato i componenti del citoscheletro e l'apparato recettoriale delle molecole di adesione cellulare. Le cellule stromali con fenotipo CD34 si trovano anche nel sangue periferico, sebbene nel midollo osseo siano significativamente meno numerose rispetto alle cellule mononucleate CD34-positive. Le cellule CD34 isolate dal sangue e trasferite in coltura si attaccano al substrato e formano colonie di cellule simili ai fibroblasti.

È noto che nel periodo embrionale la base stromale di tutti gli organi e tessuti dei mammiferi e dell'uomo deriva da un pool comune di cellule staminali mesenchimali prima e durante la fase di organogenesi. Pertanto, si ritiene che in un organismo maturo la maggior parte delle cellule staminali mesenchimali debba essere presente nel tessuto connettivo e osseo. È stato stabilito che la parte principale degli elementi cellulari dello stroma del tessuto connettivo lasso e osseo è rappresentata da cellule progenitrici impegnate, che tuttavia mantengono la capacità di proliferare e formare cloni in vitro. Quando tali cellule vengono introdotte nel flusso sanguigno generale, oltre il 20% delle cellule progenitrici mesenchimali si impianta tra gli elementi stromali del tessuto emopoietico e degli organi parenchimatosi.

Una potenziale fonte di cellule staminali mesenchimali è il tessuto adiposo, tra le cui cellule staminali sono stati identificati precursori degli adipociti impegnati in varia misura. Gli elementi progenitori meno maturi del tessuto adiposo sono le cellule stroma-vascolari che, come le cellule precursori mesenchimali multipotenti del midollo osseo, sono in grado di differenziarsi in adipociti sotto l'influenza di glucocorticoidi, fattore di crescita insulino-simile e insulina. In coltura, le cellule stroma-vascolari si differenziano in adipociti e condrociti, e nel tessuto adiposo di origine midollare sono presenti cellule che formano adipociti e osteoblasti.

Cellule staminali stromali sono state trovate anche nei muscoli. Nella coltura primaria di cellule isolate dal muscolo scheletrico umano, vengono rilevate cellule stellate e miotubi multinucleati. In presenza di siero di cavallo, le cellule stellate proliferano in vitro senza segni di citodifferenziazione e, dopo l'aggiunta di desametasone al terreno nutritivo, la loro differenziazione è caratterizzata dalla comparsa di elementi cellulari con il fenotipo delle cellule muscolari scheletriche e lisce, dell'osso, della cartilagine e del tessuto adiposo. Pertanto, nel tessuto muscolare umano sono presenti cellule progenitrici mesenchimali multipotenti sia impegnate che non impegnate. È stato dimostrato che la popolazione di cellule progenitrici presente nel muscolo scheletrico origina da cellule progenitrici mesenchimali multipotenti non impegnate del midollo osseo e differisce dalle cellule satellite miogeniche.

Cellule stellate adesive corrispondenti a cellule progenitrici mesenchimali multipotenti in potenziale di differenziazione sono state riscontrate anche nel miocardio di ratti neonati, poiché sotto l'influenza del desametasone si differenziano in adipociti, osteoblasti, condrociti, cellule muscolari lisce, mioblasti del muscolo scheletrico e cardiomiociti. È stato dimostrato che le cellule muscolari lisce vascolari (periciti) derivano da cellule progenitrici mesenchimali multipotenti perivascolari indifferenziate. In coltura, le cellule staminali mesenchimali perivascolari esprimono l'α-actina della muscolatura liscia e il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine e sono in grado di differenziarsi almeno in cellule muscolari lisce.

Un posto speciale, dal punto di vista delle riserve staminali, è occupato dal tessuto cartilagineo, il cui potenziale riparativo estremamente basso si ritiene sia dovuto a una carenza di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti o di fattori di differenziazione e crescita. Si presume che le cellule progenitrici mesenchimali multipotenti predestinate alla condrogenesi e all'osteogenesi penetrino nel tessuto cartilagineo da altre fonti tissutali.

Anche l'origine tissutale e le condizioni di adesione delle cellule progenitrici mesenchimali nei tendini non sono state stabilite. Osservazioni sperimentali indicano che nel periodo postnatale precoce, le cellule del tendine d'Achille di coniglio in colture primarie e al primo passaggio mantengono l'espressione di collagene di tipo I e decorina, ma con l'ulteriore coltivazione perdono i marcatori di differenziazione dei tenociti.

Va notato che non è ancora stata data risposta alla domanda se le cellule progenitrici mesenchimali multipotenti localizzate in vari tessuti siano effettivamente costantemente presenti nel loro stroma o se il pool tissutale di cellule staminali mesenchimali venga rifornito dalla migrazione delle cellule staminali stromali del midollo osseo.

Oltre al midollo osseo e ad altre zone di tessuto mesenchimale di un organismo adulto, il sangue del cordone ombelicale può essere un'altra fonte di MSC. È stato dimostrato che il sangue della vena del cordone ombelicale contiene cellule con caratteristiche morfologiche e antigeniche simili alle cellule progenitrici mesenchimali multipotenti, capaci di adesione e non inferiori alle cellule progenitrici mesenchimali multipotenti di origine midollare in termini di potenziale di differenziazione. Nelle colture di cellule staminali mesenchimali del sangue del cordone ombelicale, è stato riscontrato dal 5 al 10% di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti non impegnate. Si è scoperto che il loro numero nel sangue del cordone ombelicale è inversamente proporzionale all'età gestazionale, il che indica indirettamente la migrazione di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti verso vari tessuti durante lo sviluppo fetale. Sono apparse le prime informazioni sull'uso clinico delle cellule staminali mesenchimali isolate dal sangue del cordone ombelicale, nonché di quelle ottenute da biomateriale embrionale, che si basa sulla nota capacità delle cellule staminali fetali di integrarsi, attecchire e funzionare negli organi e nei sistemi tissutali dei riceventi adulti.

Ricerca di nuove fonti di cellule staminali mesenchimali

L'utilizzo di cellule staminali mesenchimali di origine embrionale, così come di altre cellule fetali, solleva una serie di problemi etici, legali, giudiziari e legislativi. Pertanto, la ricerca di materiale cellulare extraembrionale da donatore continua. Un tentativo di utilizzo clinico di fibroblasti cutanei umani non ha avuto successo, predeterminato non solo dall'elevata capacità finanziaria della tecnologia, ma anche dalla rapida differenziazione dei fibroblasti in fibrociti, che hanno un potenziale proliferativo significativamente inferiore e producono un numero limitato di fattori di crescita. Ulteriori progressi nello studio della biologia delle MSC e delle cellule progenitrici mesenchimali multipotenti del midollo osseo hanno permesso di sviluppare una strategia per l'uso clinico di cellule staminali mesenchimali autologhe. La tecnologia del loro isolamento, coltivazione, riproduzione ex vivo e differenziazione mirata ha richiesto, innanzitutto, lo studio dello spettro dei marcatori molecolari delle MSC. La loro analisi ha dimostrato che le colture primarie di tessuto osseo umano contengono diversi tipi di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti. Il fenotipo proosteoblastico è stato rilevato in cellule che esprimono il marcatore delle cellule progenitrici stromali STRO-1, ma non il marcatore osteoblastico, la fosfatasi alcalina. Tali cellule sono caratterizzate da una scarsa capacità di formare matrice ossea mineralizzata, nonché dall'assenza di espressione dell'osteopontina e del recettore dell'ormone paratiroideo. I derivati delle cellule STRO-1-positive che non esprimono la fosfatasi alcalina sono rappresentati da osteoblasti differenziati in modo intermedio e completo. È stato riscontrato che gli elementi cellulari di linee clonate di cellule ossee trabecolari umane STRO-1-positive sono in grado di differenziarsi in osteociti e adipociti maturi. La direzione della differenziazione di queste cellule dipende dall'effetto degli acidi grassi polinsaturi, delle citochine proinfiammatorie - IL-1β e fattore di necrosi tumorale a (TNF-α), nonché del TGF-β, con azione antinfiammatoria e immunosoppressiva.

Successivamente si è scoperto che le cellule progenitrici mesenchimali multipotenti sono prive di un fenotipo specifico intrinseco, ma esprimono un complesso di marcatori caratteristici delle cellule mesenchimali, endoteliali, epiteliali e muscolari in assenza di espressione di antigeni immunofenotipici delle cellule emopoietiche: CD45, CD34 e CD14. Inoltre, le cellule staminali mesenchimali producono costitutivamente e inducibilmente fattori di crescita emopoietici e non emopoietici, interleuchine e chemochine, e recettori per alcune citochine e fattori di crescita sono espressi sulle cellule progenitrici mesenchimali multipotenti. Cellule dormienti, o quiescenti, con un immunofenotipo quasi identico al profilo antigenico delle cellule progenitrici mesenchimali multipotenti non trattate con 5-fluorouracile sono state trovate tra le cellule della matrice stromale del corpo umano: entrambe le cellule esprimono CD117, che caratterizza le cellule staminali "adulte".

Pertanto, non è stato ancora identificato un marcatore cellulare specifico per le cellule staminali mesenchimali. Si presume che le cellule quiescenti rappresentino una popolazione di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti non impegnate, poiché non esprimono marcatori delle cellule impegnate nell'osteogenesi (Cbfa-1) o nell'adipogenesi (PPAR-γ-2). L'esposizione prolungata di cellule quiescenti a lenta proliferazione al siero bovino fetale porta alla formazione di progenitori impegnati in fase terminale di differenziazione, caratterizzati da una rapida crescita. L'espansione clonale di tali cellule staminali mesenchimali è supportata da FGF2. Sembra che il genoma delle cellule staminali stromali sia piuttosto "chiuso". Esistono segnalazioni dell'assenza di differenziazione spontanea nelle MSC: in assenza di condizioni specifiche per l'impegno, non si trasformano nemmeno in cellule della linea mesenchimale.

Per studiare la struttura della popolazione dei derivati delle cellule staminali mesenchimali, viene effettuata una ricerca di proteine marcatrici di differenziazione su linee cellulari stromali e in colture primarie. L'analisi clonale in vitro di cellule formanti colonie di midollo osseo ha dimostrato che l'EGF aumenta la dimensione media delle colonie e riduce l'espressione clonale della fosfatasi alcalina quando applicato a colture primarie, mentre l'aggiunta di idrocortisone attiva l'espressione della fosfatasi alcalina, che è un marcatore della direzione osteogenica della differenziazione delle MSC. Gli anticorpi monoclonali anti-STRO-1 hanno permesso di separare e studiare la popolazione di cellule adesive STRO-1-positive in un sistema eterogeneo di colture Dexter. È stato determinato uno spettro di citochine che regolano non solo la proliferazione e la differenziazione delle cellule emopoietiche e linfoidi, ma partecipano anche alla formazione, formazione e riassorbimento dei tessuti scheletrici attraverso meccanismi para-, auto- ed endocrini. Il rilascio mediato da recettori di messaggeri secondari come cAMP, diacilglicerolo, inositolo trifosfato e Ca2+ viene utilizzato anche per l'analisi di marcatori di varie categorie di cellule del tessuto stromale che esprimono i corrispondenti recettori. L'uso di anticorpi monoclonali come marcatori ha permesso di stabilire l'appartenenza delle cellule reticolari dello stroma degli organi linfoidi alle zone T e B dipendenti.

Per un certo periodo, il dibattito scientifico si è concentrato sulla possibilità che le MSC provengano da una cellula staminale emopoietica. Infatti, quando sospensioni di cellule del midollo osseo vengono espiantate in colture monostrato, vi crescono colonie distinte di fibroblasti. Tuttavia, è stato dimostrato che la presenza di precursori di colonie di fibroblasti e di vari germogli di differenziazione del tessuto emopoietico nel midollo osseo non è una prova della loro origine comune da una cellula staminale emopoietica. Utilizzando l'analisi discriminante delle cellule staminali del midollo osseo, è stato stabilito che il microambiente durante il trapianto eterotopico di midollo osseo non viene trasferito dalle cellule emopoietiche, il che dimostra l'esistenza di una popolazione di MSC nel midollo osseo istogeneticamente indipendente dalle cellule emopoietiche.

Inoltre, il metodo di clonazione selettiva ha permesso di identificare una nuova categoria di cellule progenitrici stromali in colture monostrato di cellule del midollo osseo, determinarne il numero e studiarne le proprietà, il potenziale proliferativo e differenziativo. Si è scoperto che le cellule stromali simili ai fibroblasti proliferano in vitro e formano colonie diploidi che, una volta trapiantate nell'organismo, favoriscono la formazione di nuovi organi emopoietici. I risultati dello studio dei singoli cloni indicano che tra le cellule progenitrici stromali esiste una popolazione di cellule che, per il loro potenziale proliferativo e differenziativo, possono rivendicare il ruolo di cellule staminali del tessuto stromale, istogeneticamente indipendenti dalle cellule staminali emopoietiche. Le cellule di questa popolazione sono caratterizzate da una crescita autosufficiente e si differenziano in elementi cellulari progenitori di osso, cartilagine e tessuto reticolare del midollo osseo.

Di grande interesse sono i risultati degli studi di R. Chailakhyan e coautori (1997-2001), che hanno coltivato cellule progenitrici stromali del midollo osseo da conigli, cavie e topi su terreno nutritivo a-MEM con l'aggiunta di siero fetale di vitello. Gli autori hanno eseguito l'espianto con una densità iniziale di 2-4 x 103 cellule del midollo osseo per 1 cm². Cellule del midollo osseo omologhe o eterologhe inattivate con radiazioni sono state utilizzate come feeder in una dose che ha mantenuto l'effetto feeder ma ne ha bloccato completamente la proliferazione. Colonie primarie discrete di fibroblasti di due settimane sono state tripsinizzate per ottenere ceppi monoclonali. La prova dell'origine clonale delle colonie è stata ottenuta utilizzando un marcatore cromosomico in colture miste di midollo osseo di cavie maschili e femminili, fotografie time-lapse di colture vive e in colture miste di midollo osseo singenico di topi CBA e CBAT6T6. Il trapianto di una sospensione di cellule midollari fresche isolate o di fibroblasti stromali cresciuti in vitro sotto la capsula renale è stato eseguito in scaffold porosi di ivalon o gelatina, nonché in matrice ossea spugnosa di coniglio inattivata. Per il trapianto di cloni in una guaina ossea, i femori di cavia sono stati ripuliti dai tessuti molli e dal periostio, le epifisi sono state rifilate e il midollo osseo è stato accuratamente lavato via. L'osso è stato tagliato in frammenti (3-5 mm), essiccato e irradiato a una dose di 60 Gy. Singole colonie di fibroblasti sono state posizionate nelle guaine ossee e impiantate per via intramuscolare. Per il trapianto intraperitoneale di fibroblasti stromali coltivati in vitro sono state utilizzate camere di diffusione di tipo A (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) e O (V=0,15 cm3, h=2 mm).

Studiando le dinamiche di crescita dei ceppi clonali, R. Chailakhyan et al. (2001) hanno scoperto che le singole cellule che formano colonie di fibroblasti, così come i loro discendenti, hanno un enorme potenziale proliferativo. Al decimo passaggio, il numero di fibroblasti in alcuni ceppi era di 1,2-7,2 x 109 ^cellule. Durante il loro sviluppo, hanno eseguito fino a 31-34 raddoppi cellulari. In questo caso, il trapianto eterotopico di ceppi derivati dal midollo osseo formati da precursori stromali di diverse decine di cloni ha portato al trasferimento del microambiente midollare e alla formazione di un nuovo organo emopoietico nella zona di trapianto. Gli autori si sono chiesti se i singoli cloni siano in grado di trasferire il microambiente midollare delle cellule stromali o se sia necessaria la cooperazione di diversi precursori stromali clonogenici per questo. E se i singoli cloni sono in grado di trasferire il microambiente, questo sarà completo per tutti e tre gli germogli emopoietici, oppure cloni diversi forniscono la formazione del microambiente per diversi germogli emopoietici? Per risolvere questi problemi, è stata sviluppata una tecnologia per la coltura di cellule progenitrici stromali su un gel di collagene, consentendo la rimozione delle colonie di fibroblasti cresciute dalla superficie per il successivo trapianto eterotopico. Singoli cloni di fibroblasti stromali cresciuti da cellule di midollo osseo di topi CBA e cavie sono stati escissi insieme a un frammento del rivestimento in gel e trapiantati eterotopicamente: sotto la capsula renale di topi singenici o nel muscolo addominale di cavie autologhe. Una volta trapiantate nel muscolo, le colonie sul gel sono state posizionate in guaine ossee.

Gli autori hanno scoperto che 50-90 giorni dopo il trapianto di colonie di fibroblasti del midollo osseo, lo sviluppo di osso o di tessuto osseo ed emopoietico è stato osservato nella zona di trapianto nel 20% dei casi. Nel 5% degli animali riceventi, i focolai di tessuto osseo formati contenevano una cavità riempita di midollo osseo. All'interno dei cilindri ossei, tali focolai avevano una forma arrotondata e una capsula costituita da tessuto osseo con osteociti e uno strato osteoblastico ben sviluppato. La cavità midollare conteneva tessuto reticolare con cellule mieloidi ed eritroidi, il cui rapporto proporzionale non differiva da quello del midollo osseo normale. Nel rene, il trapianto era un tipico organo del midollo osseo formatosi durante il trapianto di midollo osseo nativo, con la capsula ossea che copriva la cavità midollare solo dal lato della capsula renale. Il tessuto emopoietico includeva elementi mieloidi, eritroidi e megacariocitari. Lo stroma della cavità midollare presentava un sistema sinusale ben sviluppato e conteneva tipiche cellule adipose. Allo stesso tempo, è stato riscontrato tessuto osseo privo di segni di emopoiesi nella zona di trapianto di alcune colonie sotto la capsula renale. Lo studio del potenziale proliferativo e differenziativo dei singoli cloni è stato proseguito su ceppi monoclonali di midollo osseo di coniglio, le cui cellule sono state risospese in un terreno nutritivo e, in una spugna di ivalon separata con una massa di 1-2 mg, sono state trapiantate sotto la capsula renale di un donatore di midollo osseo di coniglio. Cellule di 21 ceppi monoclonali sono state sottoposte a tale autotrapianto. I risultati sono stati valutati dopo 2-3 mesi. Gli autori hanno riscontrato che nel 14% dei casi, i ceppi monoclonali trapiantati formavano un organo midollare costituito da tessuto osseo e una cavità midollare riempita di cellule emopoietiche. Nel 33% dei casi, i ceppi trapiantati formavano un osso compatto di dimensioni variabili con osteociti murati nelle cavità e uno strato osteoblastico sviluppato. In alcuni casi, nelle spugne con cloni trapiantati si è sviluppato tessuto reticolare privo di osso o elementi emopoietici. Talvolta, si è formato uno stroma reticolare con una rete ben sviluppata di sinusoidi, ma non popolato di cellule emopoietiche. Pertanto, i risultati ottenuti sono stati simili ai dati ottenuti durante il trapianto di cloni su gel di collagene. Tuttavia, se il trapianto di cloni cresciuti su un substrato ha portato alla formazione di tessuto midollare osseo nel 5% dei casi, tessuto osseo nel 15% e tessuto reticolare nell'80% dei casi, con il trapianto di ceppi monoclonali la formazione di elementi midollari è stata osservata nel 14% dei casi, tessuto osseo nel 53% e tessuto reticolare nel 53% dei casi. Secondo gli autori, ciò indica che le condizioni per l'implementazione del potenziale proliferativo e differenziativo dei fibroblasti stromali durante il trapianto su scaffold porosi erano più ottimali rispetto al trapianto in guaine ossee e su un substrato di collagene.È possibile che l'uso di metodi più avanzati di coltura e trapianto inverso di cloni possa migliorare le condizioni per la realizzazione del loro potenziale di differenziazione da parte dei cloni stessi e modificarne i rapporti. In un modo o nell'altro, il significato principale degli studi condotti è che alcuni cloni di cellule stromali sono in grado di formare tessuto osseo e, contemporaneamente, di fornire un microambiente emopoietico stromale per tre germogli di emopoiesi midollare contemporaneamente: eritroide, mieloide e megacariocitario, creando piattaforme piuttosto ampie di tessuto emopoietico e una certa massa ossea.

Gli autori hanno poi affrontato la questione della capacità delle singole cellule progenitrici stromali clonogeniche di subire questi tipi di differenziazione cellulare in un sistema chiuso di camere di diffusione. Inoltre, era necessario determinare se i singoli cloni possedessero polipotenza o se la manifestazione del potenziale differenziativo richiedesse l'interazione cooperativa di diversi cloni con un tratto citodifferenziativo fisso, i cui diversi rapporti determinano la formazione preferenziale di tessuto osseo, reticolare o cartilagineo. Combinando due approcci metodologici – l'ottenimento di ceppi monoclonali di cellule progenitrici stromali del midollo osseo e il loro trapianto in camere di diffusione – R. Chailakhyan e coautori (2001) hanno ottenuto risultati che hanno permesso loro di avvicinarsi alla comprensione dell'organizzazione strutturale dello stroma del midollo osseo. Il trapianto di ceppi monoclonali di cellule progenitrici stromali in camere di tipo O ha portato alla formazione sia di tessuto osseo che cartilagineo, a indicare la capacità dei discendenti di una singola cellula stromale formante colonie di formare simultaneamente tessuto osseo e cartilagineo. L'ipotesi che il tessuto osseo e cartilagineo provengano da una comune cellula progenitrice stromale è stata ripetutamente avanzata. Tuttavia, questa ipotesi non ha trovato una corretta conferma sperimentale. La formazione di osso e cartilagine nelle camere di diffusione era la prova necessaria dell'esistenza di una cellula progenitrice comune per questi due tipi di tessuto tra le cellule staminali stromali del midollo osseo.

Successivamente, 29 ceppi clonali dei passaggi del secondo-terzo ottenuti da colture primarie di midollo osseo di coniglio sono stati posti in camere di diffusione e impiantati per via intraperitoneale in animali omologhi. Gli studi hanno dimostrato che il 45% dei ceppi monoclonali di midollo osseo possiede potenziale osteogenico. Nove camere contenevano esclusivamente tessuto reticolare, ma questo era presente insieme a tessuto osseo e cartilagineo in altre 13 camere, che costituivano il 76% di tutti i ceppi. Nelle camere di tipo O, dove era possibile la differenziazione sia del tessuto osseo che di quello cartilagineo, sono stati studiati 16 ceppi. In quattro camere (25%) si sono formati sia tessuto osseo che cartilagineo. Va notato ancora una volta che negli studi di R. Chailakhyan et al. (2001), le singole cellule progenitrici hanno subito da 31 a 34 raddoppi all'interno di un ceppo cellulare e la loro progenie comprendeva 0,9-2,0 x 10 ⁹ cellule. Il numero di mitosi a cui sono andate incontro le cellule progenitrici dei ceppi policlonali era praticamente identico a quello dei ceppi monoclonali. La velocità di sviluppo dei ceppi policlonali, soprattutto nella prima fase della loro formazione, dipendeva in misura significativa dal numero di colonie utilizzate per avviare i ceppi. Anche i ceppi diploidi di fibroblasti embrionali umani (WI-38), una volta riclonati al 12°-15° livello di raddoppio, formavano colonie che differivano per diametro e contenuto cellulare. Le colonie di grandi dimensioni contenenti più di 103 cellule costituivano solo il 5-10%. Con l'aumento del numero di divisioni, la percentuale di colonie di grandi dimensioni diminuiva. I ceppi mono- e policlonali di fibroblasti stromali del midollo osseo conservavano un corredo cromosomico diploide dopo 20 o più raddoppi, e la tendenza del loro sviluppo era paragonabile alla dinamica di sviluppo dei ceppi diploidi di fibroblasti embrionali. L'analisi del potenziale di differenziazione delle singole cellule progenitrici stromali del midollo osseo, effettuata trapiantando ceppi monoclonali in camere di diffusione, ha mostrato che metà di esse era osteogenica. Le colonie di grandi dimensioni rappresentavano il 10% del loro numero totale. Di conseguenza, il numero di cellule formanti colonie osteogeniche corrispondeva a circa il 5% della loro popolazione totale. La massa totale di cellule progenitrici osteogeniche identificata dagli autori includeva cellule in grado di formare simultaneamente tessuto osseo e cartilagineo. Inoltre, è stato stabilito per la prima volta che questi due tipi di tessuto in un organismo adulto hanno una cellula progenitrice comune: il 25% dei cloni testati è stato creato da tali cellule e il loro numero nella popolazione totale di cellule progenitrici era almeno del 2,5%.

Pertanto, il trapianto eterotopico di singoli cloni di fibroblasti del midollo osseo ha rivelato nuovi aspetti dell'organizzazione strutturale della popolazione di cellule progenitrici mesenchimali. Sono state individuate cellule progenitrici stromali in grado di trasferire contemporaneamente un microambiente specifico per tutti gli stimoli emopoietici, il cui numero, tra i grandi cloni studiati in diversi modelli, varia dal 5 al 15% (0,5-1,5% del numero totale di cellule progenitrici rilevate). Oltre ai cloni che trasferiscono l'intero microambiente del midollo osseo, esistono cellule progenitrici specifiche solo per l'osteogenesi, che, se trasferite in un sistema aperto, formano tessuto osseo che non supporta lo sviluppo dell'emopoiesi. Il loro numero sul numero totale di cellule progenitrici è pari all'1,5-3%. Alcune di queste cellule sono in grado di formare tessuto osseo con un periodo di automantenimento limitato. Di conseguenza, la popolazione di cellule progenitrici stromali presenta un potenziale differenziativo eterogeneo. Tra queste, vi è una categoria di cellule che si definiscono cellule staminali stromali, capaci di differenziarsi in tutte e tre le direzioni caratteristiche del tessuto stromale del midollo osseo, formando tessuto osseo, cartilagineo e reticolare. I dati presentati ci permettono di sperare che, utilizzando diversi marcatori cellulari, sarà possibile determinare il contributo di ciascun tipo di cellule stromali all'organizzazione di uno specifico microambiente e al supporto dell'ematopoiesi nelle colture di Dexter.

Caratteristiche delle cellule staminali mesenchimali

Negli ultimi anni, è stato stabilito che nelle colture stazionarie di midollo osseo, le cellule progenitrici mesenchimali multipotenti sono rappresentate da una popolazione limitata di piccole cellule agranulari (cellule RS-1) caratterizzate da una bassa capacità di formazione di colonie e dall'assenza di espressione dell'antigene Ki-67 specifico per le cellule proliferanti. I parametri antigenici delle cellule RS-1 dormienti differiscono dallo spettro antigenico delle cellule progenitrici stromali impegnate in rapida proliferazione. È stato stabilito che un elevato tasso di proliferazione delle cellule progenitrici impegnate si osserva solo in presenza di cellule RS-1. A loro volta, le cellule RS-1 aumentano il loro tasso di crescita sotto l'influenza di fattori secreti dai derivati più maturi delle cellule progenitrici mesenchimali multipotenti. Sembra che le cellule RS-1 siano una sottoclasse di MSC non impegnate in grado di riciclarsi. In vitro, le cellule progenitrici stromali del midollo osseo resistenti al 5-fluorouracile sono caratterizzate da un basso contenuto di RNA e da un'elevata espressione del gene dell'ornitina decarbossilasi, un marcatore delle cellule non proliferanti.

La proliferazione intensiva delle cellule progenitrici stromali inizia dopo la loro fissazione sul substrato. In questo caso, viene espresso il profilo marcatore delle cellule scarsamente differenziate: SH2 (recettore del TGF-(3)), SH3 (dominio proteico di segnalazione), collagene di tipo I e III, fibronectina, recettori di adesione VCAM-1 (CD106) e ICAM (CD54), caderina-11, CD44, CD71 (recettore della transferrina), CD90, CD120a e CD124, ma senza l'espressione dei marcatori caratteristici delle cellule staminali emopoietiche (CD34, CD14, CD45). La crescita clonale consente il passaggio ripetuto di cellule staminali mesenchimali con la formazione in coltura di numerose cellule progenitrici stromali pluripotenti geneticamente omogenee. Dopo 2-3 passaggi, il loro numero raggiunge i 50-300 milioni. In una coltura di densità sufficiente, dopo l'arresto della proliferazione, le cellule progenitrici stromali, a differenza dei fibroblasti ematopoietici, si differenziano in adipociti, miociti, cartilagine e cellule ossee. Una combinazione di tre segnali regolatori di differenziazione, tra cui 1-metil-isobutilxantina (un induttore della formazione intracellulare di cAMP), desametasone (un inibitore delle fosfolipasi A e C) e indometacina (un inibitore della cicloossigenasi, che riduce anche l'attività della trombossano sintasi), converte fino al 95% delle cellule progenitrici mesenchimali in adipociti. La formazione di adipociti da elementi stromali immaturi è confermata dall'espressione del gene della lipoproteina lipasi, dalla rilevazione istochimica delle apolipoproteine e dei recettori perossisomiali. Cellule dello stesso clone sotto l'influenza di TGF-β in un terreno privo di siero creano una popolazione omogenea di condrociti. La coltura cellulare multistrato di questo tessuto cartilagineo è caratterizzata da una matrice intercellulare sviluppata costituita da proteoglicani e collagene di tipo II. In un terreno nutritivo con il 10% di L'effetto di un complesso segnale di differenziazione costituito da β-glicerofosfato (un donatore di fosfato inorganico), acido ascorbico e desametasone nella stessa coltura di cellule progenitrici stromali porta alla formazione di aggregati cellulari. In tali cellule, si osserva un progressivo aumento dell'attività della fosfatasi alcalina e dei livelli di osteopontina, indicando la formazione di tessuto osseo, la cui mineralizzazione delle cellule è confermata da un progressivo aumento del contenuto di calcio intracellulare.

Secondo alcuni dati, la capacità delle cellule staminali mesenchimali di dividersi e riprodursi illimitatamente in vari tipi di cellule della linea di differenziazione mesenchimale è associata a un elevato grado di plasticità. Una volta introdotte nei ventricoli o nella sostanza bianca del cervello, le cellule staminali mesenchimali migrano verso il parenchima del tessuto nervoso e si differenziano in derivati della linea cellulare gliale o neuronale. Inoltre, sono disponibili informazioni sulla transdifferenziazione delle MSC in cellule staminali emopoietiche sia in vitro che in vivo. Un'analisi più approfondita di alcuni studi ha determinato un'eccezionale plasticità delle MSC, che si manifesta nella loro capacità di differenziarsi in astrociti, oligodendrociti, neuroni, cardiomiociti, cellule muscolari lisce e cellule muscolari scheletriche. Numerosi studi sul potenziale di transdifferenziazione delle MSC in vitro e in vivo hanno stabilito che le cellule progenitrici mesenchimali multipotenti originarie del midollo osseo si differenziano in modo terminale in linee cellulari che formano tessuto osseo, cartilagineo, muscolare, nervoso e adiposo, nonché tendini e stroma che supportano l'ematopoiesi.

Tuttavia, altri studi non sono riusciti a rivelare alcun segno di restrizione della pluripotenza del genoma delle cellule staminali mesenchimali e delle popolazioni progenitrici delle cellule stromali, sebbene siano stati studiati più di 200 cloni di MSC isolati da una coltura primaria per testare la possibile pluripotenza delle cellule stromali. La stragrande maggioranza dei cloni in vitro ha mantenuto la capacità di differenziarsi in direzione osteogenica, condrogenica e adipogenica. Escludendo la probabilità di migrazione delle cellule riceventi mediante trapianto di cellule staminali mesenchimali sotto la capsula renale o in camere di diffusione, è emerso che le cellule progenitrici stromali in situ mantengono un fenotipo eterogeneo, che indica l'assenza di fattori di restrizione nella zona di trapianto o l'assenza di pluripotenza delle MSC in quanto tale. Allo stesso tempo, è ammessa l'esistenza di un raro tipo di cellule staminali somatiche pluripotenti, precursori comuni di tutte le cellule staminali adulte.

La multipotenza, ma non la pluripotenza, delle vere cellule staminali mesenchimali, che costituiscono una percentuale molto piccola di cellule del midollo osseo e sono in grado di proliferare in determinate condizioni durante la coltura in vitro senza differenziarsi, è dimostrata dal loro impegno indotto a livello di cellule ossee, cartilaginee, adiposo e muscolari, nonché di tenociti ed elementi stromali che supportano l'ematopoiesi. Di norma, l'esposizione prolungata a un terreno di coltura con siero fetale di vitello provoca il rilascio di MSC nelle cellule progenitrici stromali impegnate, la cui progenie subisce una differenziazione terminale spontanea. In vitro, è possibile ottenere una formazione mirata di osteoblasti aggiungendo desametasone, ß-glicerofosfato e acido ascorbico al terreno di condizionamento, mentre una combinazione di segnali di differenziazione da desametasone e insulina induce la formazione di adipociti.

È stato stabilito che, prima di entrare nella fase di differenziazione terminale, le MSC del midollo osseo si differenziano inizialmente in cellule staminali mesenchimali fibroblastiche in determinate condizioni di coltura. I derivati di queste cellule in vivo partecipano alla formazione di ossa, cartilagine, tendini, tessuto adiposo e muscolare, nonché dello stroma che supporta l'ematopoiesi. Molti autori intendono il termine "cellule progenitrici mesenchimali multipotenti" come riferito sia alle MSC stesse sia alle cellule progenitrici stromali assegnate del midollo osseo e dei tessuti mesenchimali. L'analisi clonale delle cellule progenitrici mesenchimali multipotenti di origine midollare ha mostrato che poco più di un terzo di tutti i cloni si differenzia in osteociti, condrociti e adipociti, mentre le cellule dei cloni rimanenti hanno solo potenziale osteogenico e formano solo condrociti e osteociti. Un clone di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti come BMC-9, in appropriate condizioni microambientali, si differenzia in cellule con il fenotipo e le caratteristiche funzionali non solo di osteoblasti, condrociti e adipociti, ma anche di cellule stromali che supportano l'ematopoiesi. Un clone di cellule RCJ3.1 isolato da midollo osseo fetale di ratto si differenzia in cellule mesenchimali di vari fenotipi. Sotto l'azione combinata di acido ascorbico, β-glicerofosfato e desametasone, gli elementi cellulari di questo clone formano dapprima miociti multinucleari e poi, in sequenza, adipociti, condrociti e isole di tessuto osseo mineralizzato. La popolazione di cellule granulari del periostio dei feti di ratto corrisponde a cellule progenitrici mesenchimali multipotenti non impegnate, poiché è caratterizzata da un basso tasso di proliferazione, non esprime marcatori di differenziazione e in condizioni di coltura si differenzia per formare condro-, osteo- e adipociti, nonché cellule muscolari lisce.

Bisogna quindi riconoscere che la questione della pluripotenza o multipotenza del genoma delle cellule staminali mesenchimali resta aperta, il che, di conseguenza, influenza anche le idee sul potenziale di differenziazione delle cellule progenitrici stromali, che non è stato ancora stabilito in modo definitivo.

Una caratteristica importante e sperimentalmente provata delle cellule staminali mesenchimali è la loro capacità di lasciare la nicchia tissutale e circolare nel flusso sanguigno generale. Per attivare il programma di differenziazione genetica, tali cellule staminali circolanti devono entrare nel microambiente appropriato. È stato dimostrato che con l'introduzione sistematica di MSC nel flusso sanguigno di animali riceventi, cellule immature vengono impiantate in vari organi e tessuti, differenziandosi poi in cellule del sangue, miociti, adipociti, condrociti e fibroblasti. Di conseguenza, in zone tissutali locali, si verificano interazioni segnale-regolatrici tra cellule progenitrici stromali non impegnate e impegnate, nonché tra queste e le cellule mature circostanti. Si presume che il differenziamento sia indotto da fattori regolatori paracrini di origine mesenchimale e non mesenchimale (fattori di crescita, eicosanoidi, molecole della matrice extracellulare), che forniscono connessioni spaziali e temporali nel microambiente delle cellule progenitrici mesenchimali multipotenti. Pertanto, il danno locale al tessuto mesenchimale dovrebbe portare alla formazione di zone del microambiente delle cellule progenitrici mesenchimali multipotenti qualitativamente diverse dal complesso di segnali regolatori dei tessuti intatti, in cui si verificano processi di rigenerazione fisiologica piuttosto che riparativa. Questa differenza è estremamente importante in termini di specializzazione del fenotipo cellulare nel microambiente normale e in quello indotto dal danno.

Secondo i concetti, è qui che si inseriscono i meccanismi della differenza fondamentale tra i due processi noti: rigenerazione fisiologica e proliferazione infiammatoria. Il primo si conclude con il ripristino della composizione cellulare specializzata del tessuto e della sua funzione, mentre il risultato dell'implementazione del processo di proliferazione è la formazione di elementi maturi del tessuto connettivo e la perdita di funzionalità della zona tissutale danneggiata. Pertanto, per sviluppare programmi ottimali per l'uso di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti nella medicina plastica-rigenerativa, è necessario uno studio approfondito delle caratteristiche dell'impatto dei fattori microambientali sulla differenziazione delle MSC.

La dipendenza della struttura del compartimento delle cellule staminali da regolatori cellulari para- e autocrini, la cui espressione è modulata da segnali esterni, è indubitabile. Tra le funzioni dei fattori regolatori, le più importanti sono il controllo della divisione asimmetrica delle MSC e l'espressione dei geni che determinano le fasi di attivazione e il numero di divisioni cellulari. I segnali esterni, da cui dipende l'ulteriore sviluppo delle MSC, sono forniti dal loro microambiente. Allo stato immaturo, le MSC proliferano a lungo, mantenendo la capacità di differenziarsi in linee di adipociti, miofibroblasti, stroma tissutale ematogeno, cartilagine e cellule ossee. È stato stabilito che una popolazione limitata di elementi cellulari stromali CD34-negativi circolanti nel sangue ritorna dal flusso sanguigno generale allo stroma del midollo osseo, dove viene trasformata in linee di cellule staminali ematopoietiche CD34-positive. Queste osservazioni suggeriscono che il ricircolo delle cellule progenitrici mesenchimali nel flusso sanguigno mantenga l'equilibrio tissutale delle cellule staminali stromali in diversi organi, mobilizzando un pool comune di elementi stromali immaturi del midollo osseo. La differenziazione delle MSC in cellule con molteplici fenotipi mesenchimali e il loro coinvolgimento nella rigenerazione o riparazione di ossa, cartilagini, tessuto adiposo e tendini in vivo è stata dimostrata utilizzando modelli di trasferimento adottivo in animali da esperimento. Secondo altri autori, la migrazione a distanza delle MSC lungo il letto vascolare si combina con il movimento a breve distanza o locale di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti all'interno del tessuto durante la riparazione della cartilagine, la rigenerazione muscolare e altri processi riparativi.

Le riserve staminali locali della base del tessuto stromale fungono da fonte di cellule nei processi di rigenerazione tissutale fisiologica e vengono reintegrate dal trasporto a distanza di MSC man mano che le risorse staminali del tessuto stromale si esauriscono. Tuttavia, in condizioni di necessità di mobilizzazione d'emergenza del potenziale cellulare riparativo, ad esempio in caso di politrauma, l'intero gruppo di MSC partecipa ai processi di rigenerazione riparativa e le cellule progenitrici mesenchimali del midollo osseo vengono reclutate in periferia attraverso il flusso sanguigno generale.

Trapianto di cellule staminali mesenchimali

Si possono tracciare alcuni parallelismi tra i processi di rigenerazione fisiologica dei tessuti e la loro formazione durante lo sviluppo intrauterino. Nell'embriogenesi umana e dei mammiferi, la formazione di vari tipi di cellule specializzate avviene a partire dal pool ecto-, meso- ed endodermico dei foglietti germinali, ma con la partecipazione obbligatoria del mesenchima. La rete cellulare lassa del tessuto mesenchimale embrionale svolge numerose funzioni regolatorie, metaboliche, di struttura e morfogenetiche. La deposizione degli organi provvisori avviene solo dopo la condensazione del mesenchima, grazie alla crescita clonogenica delle cellule progenitrici, che generano i segnali morfogenetici primari dell'organogenesi. I derivati stromali del mesenchima embrionale creano la struttura cellulare degli organi provvisori e costituiscono la base per il loro futuro apporto energetico-plastico grazie alla crescita dei vasi sanguigni e linfatici primari. In altre parole, gli elementi stromali dell'unità microcircolatoria degli organi fetali si formano prima della formazione delle loro unità strutturali e funzionali. Inoltre, la migrazione attiva delle cellule mesenchimali durante l'organogenesi fornisce l'orientamento spaziale degli organi in via di sviluppo, marcandone i confini di volume attraverso la restrizione dei tipi Hox omeotici. La struttura stromale funge anche da base per l'assemblaggio delle unità strutturali e funzionali degli organi parenchimatosi, che spesso includono cellule completamente diverse dal punto di vista morfogenetico e funzionale. Di conseguenza, durante l'embriogenesi, le funzioni del mesenchima sono primarie e si realizzano attraverso la generazione di segnali regolatori che attivano la proliferazione e la differenziazione regionale delle cellule progenitrici epiteliali. Le cellule mesenchimali embrionali producono fattori di crescita come HGF-β, HGF-β, CSF, per i quali le cellule progenitrici parenchimali presentano recettori corrispondenti. Nel tessuto maturo differenziato di un organismo adulto, la rete cellulare stromale genera anche segnali per mantenere la vitalità e la proliferazione delle cellule progenitrici di origine non mesenchimale. Tuttavia, lo spettro dei segnali regolatori stromali nell'ontogenesi postnatale è diverso (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, ecc.) ed è finalizzato a garantire la rigenerazione o la riparazione fisiologica delle zone tissutali danneggiate. Inoltre, le caratteristiche spettrali dei fattori regolatori stromali in ciascun tipo di tessuto e persino all'interno di un singolo organo sono diverse. In particolare, l'ematopoiesi e la linfopoiesi, con la proliferazione e la differenziazione delle cellule ematopoietiche e immunocompetenti, si verificano solo in determinati organi, entro i cui confini opera il microambiente stromale, che fornisce le condizioni per la maturazione delle cellule ematopoietiche e linfoidi. La capacità delle cellule ematopoietiche e linfoidi di ripopolare un dato organo, proliferare e maturare nelle sue nicchie microstrutturali dipende dai fattori regolatori del microambiente.

Tra i componenti della matrice extracellulare prodotti dalle cellule progenitrici mesenchimali multipotenti, vanno menzionati fibronectina, laminina, collagene e proteoglicani, nonché CD44 (recettore dell'acido ialuronico e dell'osteopontina), che svolgono un ruolo importante nell'organizzazione delle interazioni intercellulari e nella formazione della matrice extracellulare nel midollo osseo e nel tessuto osseo. È stato dimostrato che le cellule progenitrici mesenchimali multipotenti del midollo osseo creano un microambiente stromale che fornisce segnali induttivi e regolatori non solo alle MSC, ma anche ai progenitori emopoietici e ad altre cellule staminali non mesenchimali del midollo osseo. È noto che il coinvolgimento delle MSC nell'ematopoiesi è determinato dalla loro capacità di differenziarsi in cellule stromali che supportano l'ematopoiesi, e questo segnale istruttivo viene ricevuto dalle MSC direttamente dalle cellule staminali emopoietiche. Ecco perché in coltura la rete di cellule progenitrici stromali funge da base di alimentazione per lo sviluppo di tutti i cloni di cellule emopoietiche.

In un organismo maturo, l'intensità dell'emopoiesi e della linfopoiesi è in uno stato di equilibrio dinamico con il "consumo" di globuli rossi maturi e cellule del sistema immunitario alla periferia. Poiché le cellule stromali del midollo osseo e degli organi linfoidi vengono rinnovate estremamente raramente, non si verifica una significativa ristrutturazione delle strutture stromali in essi. Il sistema può essere sbilanciato dall'equilibrio dinamico a causa di un danno meccanico a uno qualsiasi degli organi dell'emopoiesi o della linfopoiesi, il che porta a cambiamenti sequenziali uniformi che riguardano non solo e non tanto gli elementi emopoietici o linfoidi quanto le strutture stromali dell'organo danneggiato. Nel processo di rigenerazione riparativa, si forma per prima la base stromale, che viene poi ripopolata da cellule emopoietiche o immunocompetenti. Questo fatto noto da tempo rende la rigenerazione post-traumatica un modello utile per lo studio del microambiente stromale degli organi emopoietici. In particolare, lo svuotamento meccanico della cavità midollare delle ossa tubulari viene utilizzato per studiare la rigenerazione riparativa del midollo osseo - il curettage - che consente la rimozione rapida ed efficace del tessuto emopoietico dallo stato di equilibrio dinamico. Studiando i processi di rigenerazione riparativa delle componenti emopoietiche e stromali del midollo osseo dopo lo svuotamento meccanico della cavità midollare della tibia di cavie, si è riscontrato che non esiste una correlazione diretta tra gli indici di rigenerazione delle cellule emopoietiche e stromali (numero di cellule emopoietiche, concentrazione e numero di cellule progenitrici stromali). Inoltre, è emerso che un aumento della popolazione di cellule progenitrici stromali si verifica in un momento più precoce dopo il curettage e che gli stessi fibroblasti stromali diventano fosfatasi-positivi, caratteristica tipica del tessuto osteogenico. È stato inoltre accertato che il curettage di 3-5 ossa tubulari porta alla crescita di questa popolazione cellulare nel midollo osseo delle ossa non operate e perfino nella milza, che nelle cavie è un organo esclusivamente linfopoietico.

Il quadro morfologico dei processi riparativi nel midollo osseo di tibie di cavia trattate con curettage corrisponde generalmente ai dati descritti in letteratura, ottenuti in esperimenti su animali di altre specie, e la dinamica dei cambiamenti che si verificano dopo la rimozione del tessuto emopoietico è la stessa per tutte le specie animali e la differenza riguarda solo i parametri temporali. Morfologicamente, l'ordine delle fasi del ripristino dell'ematopoiesi nella cavità midollare svuotata consiste in processi successivi di organizzazione del coagulo di sangue, formazione di tessuto osseo fibroso grossolano, suo riassorbimento, sviluppo di sinusoidi e formazione di stroma reticolare, che viene successivamente ripopolato da elementi emopoietici. In questo caso, il numero di cellule progenitrici emopoietiche nel processo di rigenerazione del tessuto midollare aumenta parallelamente all'aumento del contenuto di cellule staminali emopoietiche.

Yu. Gerasimov e coautori (2001) hanno confrontato le variazioni del numero di cellule emopoietiche e del numero di cellule progenitrici stromali nelle singole fasi del processo di rigenerazione. È emerso che le variazioni quantitative delle cellule del midollo osseo nell'osso sottoposto a curettage corrispondono alla dinamica delle caratteristiche morfologiche della rigenerazione. Gli autori associano la diminuzione del contenuto cellulare nel rigenerato durante i primi tre giorni alla morte delle cellule emopoietiche dovuta all'effetto sfavorevole del microambiente creato dal tessuto reticolare proliferante nel midollo osseo conservato nella regione dell'epifisi, nonché alla formazione di focolai di tessuto osteoide in quest'ultimo e al danno vascolare durante il curettage. Tra il 7° e il 12° giorno, un aumento del livello di cellule nucleate coincide con la comparsa di singoli focolai di emopoiesi mieloide nelle zone di proliferazione degli elementi stromali. Al 20° giorno, compaiono aree significative di midollo osseo rigenerato e seni paranasali ben sviluppati, accompagnati da un aumento significativo del numero totale di cellule. Tuttavia, il numero di elementi emopoietici durante questo periodo è pari al 68% del livello di controllo. Ciò è coerente con dati precedentemente pubblicati secondo cui il numero di cellule emopoietiche dopo il curettage raggiunge la normalità solo tra il 35° e il 40° giorno dopo l'intervento.

Nel periodo post-traumatico precoce, la principale fonte per il ripristino dell'emopoiesi sono gli elementi cellulari locali preservati durante il curettage. Nelle fasi successive, la principale fonte di rigenerazione del tessuto emopoietico del midollo osseo sono le cellule staminali che ripopolano le zone stromali libere. Per quanto riguarda le singole categorie di cellule stromali (endoteliali, reticolari e osteogeniche), le fonti che ne assicurano la formazione durante la riorganizzazione della cavità midollare rimangono poco chiare. I risultati dello studio di Yu. V. Gerasimov e coautori (2001) indicano che nel midollo osseo preservato dopo il curettage, la concentrazione di cellule formanti colonie di fibroblasti è significativamente più elevata rispetto al midollo osseo normale. Gli autori ritengono che il curettage determini un lavaggio selettivo più intenso delle cellule emopoietiche rispetto alle cellule stromali formanti colonie, che partecipano alla formazione dello stroma e sono più fortemente associate alla sua sostanza principale rispetto alle cellule emopoietiche.

La dinamica della variazione del numero di cellule che formano colonie di fibroblasti è correlata all'intensità dei processi di osteogenesi, al successivo riassorbimento delle trabecole ossee e alla formazione di stroma reticolare, popolato da cellule emopoietiche. La maggior parte delle cellule progenitrici stromali, nei termini specificati di rigenerazione, forma tessuto osseo fibroso grossolano e stroma reticolare. In caso di fratture femorali in condizioni di osteosintesi prolungata, al 5° giorno nella zona di rigenerazione la concentrazione e il numero di cellule che formano colonie di fibroblasti aumentano e, durante il periodo di intensa formazione ossea, il loro numero aumenta di 6 volte. È noto che le cellule del midollo osseo che formano colonie di fibroblasti hanno proprietà osteogeniche. Il numero di cellule progenitrici stromali aumenta prima dell'insediamento delle cellule emopoietiche nel territorio midollare curettato. Ciò è in buon accordo con i dati secondo cui le cellule stromali contribuiscono alla formazione di un microambiente emopoietico. Apparentemente, la creazione di un microambiente emopoietico corrisponde a un certo livello di rigenerazione del tessuto stromale e il numero di cellule emopoietiche aumenta con l'espansione della piattaforma stromale adatta all'emopoiesi.

Di grande interesse sono i dati degli autori secondo cui, subito dopo il curettage, il numero di cellule progenitrici stromali nelle parti remote dello scheletro aumenta. A partire dalla sesta ora e fino al ventesimo giorno incluso, si osserva un aumento di oltre il doppio sia della concentrazione che del numero di cellule che formano colonie di fibroblasti nella tibia controlaterale. Il meccanismo di questo fenomeno è probabilmente associato al fatto che un danno midollare massivo porta alla formazione di un gran numero di coaguli di sangue con la contemporanea distruzione di un numero significativo di piastrine e il rilascio nel sangue del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF), che è noto per causare la proliferazione di cellule che formano colonie di fibroblasti situate nell'organismo al di fuori del pool proliferativo. Negli esperimenti sui conigli, la somministrazione locale di MSC promuove il ripristino del tessuto cartilagineo dell'articolazione del ginocchio chirurgicamente danneggiata, che può essere associato alla formazione di condrociti provenienti dalle MSC iniettate. Tuttavia, la rigenerazione riparativa dei difetti ossei nei ratti da laboratorio è significativamente migliorata dall'utilizzo di cellule staminali mesenchimali racchiuse in una struttura ceramica. Pertanto, si può supporre che, se non le cellule staminali mesenchimali (RBOC), un altro fattore originante dalle cellule stromali danneggiate eserciti un effetto stimolante a distanza sulla proliferazione delle cellule progenitrici mesenchimali nelle zone intatte del midollo osseo e ne stimoli la migrazione verso l'area del difetto midollare. A sua volta, ciò è contraddetto dai dati di letteratura degli anni precedenti che indicano che le cellule stromali responsabili del microambiente, a differenza delle cellule emopoietiche, non sono in grado di migrare e provengono da fonti locali.

Tuttavia, i risultati dello studio di Yu. Gerasimov e coautori (2001) indicano che il trauma meccanico causa non solo una netta ristrutturazione del tessuto stromale nell'osso sottoposto a curettage, ma anche cambiamenti significativi nello stroma di ossa intatte distanti, ovvero si verifica una risposta sistemica del tessuto stromale al trauma locale. Inoltre, quando viene inflitto un politrauma - curettage multiplo - questa reazione è amplificata e si osserva non solo nell'osso operato e nelle parti distanti dello scheletro, ma anche negli organi linfoidi, in particolare nella milza. Il meccanismo di tale risposta sistemica del tessuto stromale del midollo osseo e della milza al trauma locale e al politrauma rimane sconosciuto. Si presume che questo processo sia associato all'azione di un fattore umorale secreto dallo stroma mesenchimale della cavità midollare del midollo osseo. La possibilità che le cellule stromali del midollo osseo e della milza producano un fattore umorale organo-non specifico, responsabile della proliferazione delle cellule che formano colonie di fibroblasti, è dimostrata dai dati sulla loro attività stimolante le colonie in colture monostrato di midollo osseo.

A questo proposito, vale la pena notare che con la somministrazione sistemica di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti, i loro derivati ripopolano non solo il midollo osseo, ma anche altri tessuti, il che viene utilizzato, in particolare, per la terapia genica. È stato dimostrato che con la somministrazione endovenosa di grandi quantità di MSC con genoma wild-type a topi con una mutazione nel gene del collagene I, le cellule del donatore sostituiscono fino al 30% delle cellule nel tessuto osseo e cartilagineo dei riceventi, e le cellule staminali mesenchimali murine transfettate secernenti IL-3 umana supportano efficacemente l'ematopoiesi per 9 mesi in caso di somministrazione simultanea con cellule staminali ematopoietiche umane a topi immunodeficienti.

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Modificazione genetica delle cellule staminali mesenchimali

Tra i successi della modifica genetica sperimentale delle MSC, vale la pena sottolineare la trasfezione del gene del fattore IX in MSC umane con successivo trasferimento di cellule transfettanti a topi immunodeficienti, che porta alla comparsa del fattore B antiemofilico nel sangue per 8 settimane dopo il trapianto. In questo esperimento, è stata effettuata una modificazione post-traduzionale del fattore IX mediante γ-glutamil carbossilasi nelle cellule transfettate. La trasduzione di MSC con un vettore retrovirale codificante per il fattore IX umano ha avuto meno successo: la successiva somministrazione di queste cellule a un cane con emofilia B ha fornito un livello terapeutico di fattore IX, mantenendo una normale intensità di coagulazione emostatica, per soli 12 giorni.

Il trapianto di cellule staminali mesenchimali nel parenchima cerebrale di animali ha dimostrato che le cellule immature del donatore vengono trasformate in popolazioni sia neuronali che gliali. L'attecchimento di derivati neuronali di tessuto mesenchimale sano di donatore consente teoricamente di correggere anomalie genetiche del metabolismo cerebrale in pazienti con malattia di Gaucher e altri disturbi del metabolismo lipidico, gangliosidico o glucidico.

È in corso la ricerca sperimentale di condizioni per la transdifferenziazione delle cellule staminali stromali del midollo osseo in cellule progenitrici del tessuto nervoso ed epatico. L'attenzione dei ricercatori è focalizzata sulla combinazione di induttori di differenziazione e terreni di coltura speciali. In particolare, per isolare la coltura primaria di cellule stromali, le cellule del midollo osseo lavate e risospese in terreno di coltura DMEM/F12 (1/1) con siero fetale di vitello al 10% vengono seminate a una densità di 200.000/cm². Dopo 24 ore, le cellule non aderenti vengono rimosse e le cellule fibroblasto-simili adese alla plastica vengono coltivate per una settimana. Per la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo in neuroblasti, viene utilizzato un terreno condizionato ottenuto dalla coltura per tre giorni della coltura primaria di fibroblasti embrionali di topo, nonché terreno DMEM/F12 (1/1) con il 2% di siero fetale di vitello e l'aggiunta di 20 ng/ml di NF o 10-6 M di acido retinoico (neuroinduttori utilizzati per la differenziazione neurale delle cellule staminali embrionali di topo e umane). La differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo in cellule precursori degli epatociti viene indotta in un terreno condizionato creato a seguito della coltura per tre giorni della coltura primaria di cellule epatiche embrionali di topo in terreno DMEM/F12 (1/1) con l'aggiunta di siero fetale di vitello al 10%.

Qui va notato ancora una volta che le cellule formanti colonie dello stroma del midollo osseo sono eteromorfe e possono essere divise in due tipi. Il primo tipo include cellule fibroblastiche che formano filopodi con nuclei grandi e uno o due nucleoli. Il secondo tipo è rappresentato da piccole cellule fusiformi. Quando si coltivano cellule di entrambi i tipi in un terreno condizionato ottenuto su uno strato di fibroblasti embrionali primari di topo, cellule simili ai neuroblasti compaiono in coltura tra il 3° e il 4° giorno. In questa fase, hanno più spesso una forma fusiforme con uno o due lunghi processi che terminano in filopodi. Meno comuni sono le cellule piramidali o stellate con dendriti corti. I dendriti di alcuni neuroblasti presentano espansioni caratteristiche (gemme di crescita) e ramificazioni nella loro parte distale, mentre altri presentano coni di crescita distinti con filopodi, attraverso i quali crescono i dendriti. Caratteristiche morfologiche simili (gemme e coni di crescita con filopodi) inerenti ai neuroblasti in fase di differenziazione in neuroni sono state descritte in dettaglio in studi sulla neurogenesi. Sulla base di ciò, alcuni autori concludono che le cellule trovate in coltura siano neuroblasti. In particolare, E. Shchegelskaya e coautori (2002), dopo aver coltivato una coltura primaria di cellule stromali per due settimane in un mezzo condizionato cambiato ogni 3-4 giorni, hanno osservato che alcune cellule proliferavano pur mantenendo uno stato indifferenziato. Esternamente, tali cellule assomigliavano ai fibroblasti e sono state rilevate in coltura insieme ai neuroblasti in fase di differenziazione. La maggior parte delle cellule (circa l'80%) si trovava in diversi stadi di differenziazione in cellule del tessuto nervoso, principalmente in neuroni. I processi dendritici di queste cellule erano in stretto contatto tra loro, cosicché le cellule formavano gradualmente sezioni della rete nervosa sul substrato sotto forma di lunghi filamenti multicellulari. I processi dendritici dei neuroblasti si sono allungati significativamente, alcuni di essi hanno superato la lunghezza del corpo neuronale stesso di 8-10 volte. La proporzione di cellule piramidali e stellate è gradualmente aumentata. I dendriti delle cellule stellate si sono ramificati. Secondo gli autori, la differenziazione tardiva delle cellule piramidali e stellate rispetto alle cellule fusiformi corrisponde alla sequenza di fasi della neurogenesi normale negli animali. Di conseguenza, gli autori concludono che le cellule staminali stromali del midollo osseo subiscono una neurogenesi indotta, durante la quale tutti e tre i principali tipi di neuroni si formano dai neuroblasti in vitro. Precursori delle cellule nervose sono stati rilevati anche durante la coltura di cellule stromali del midollo osseo per 3-4 giorni in un terreno con il 2% di siero fetale e 20 ng/ml di LIF. Tuttavia, in questo caso, le cellule staminali si sono divise molto lentamente, la differenziazione dei neuroblasti si è verificata solo nel 30% dei casi e non hanno formato reti neuronali. Utilizzando l'acido retinoico come uno degli induttori della differenziazione delle cellule nervose, gli autori hanno ottenuto fino al 25-30% di cellule nervose nella coltura,con elementi gliali predominanti: astrociti e oligodendrociti. I neuroni costituivano solo un terzo di tutte le cellule nervose, sebbene fossero rappresentati da tutti e tre i tipi: cellule fusiformi, piramidali e stellate. Al sesto giorno di coltura delle cellule stromali in un terreno con acido retinoico, le cellule nervose si sono differenziate maggiormente e sono stati trovati assoni in singoli neuroni piramidali, che nella normale neuroontogenesi compaiono più tardi rispetto alla formazione dei processi dendritici. Secondo gli autori, nonostante la bassa resa di cellule nervose, il metodo di induzione con acido retinoico presenta i suoi vantaggi: oligodendrociti e astrociti svolgono funzioni mielinizzanti e nutrizionali durante la crescita di dendriti e assoni e sono necessari per la normale formazione del tessuto nervoso. Pertanto, per la riparazione in vivo delle aree danneggiate, è preferibile utilizzare una sospensione di neuroni arricchita con cellule gliali.

Nella seconda serie di esperimenti, gli autori hanno tentato di indurre la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo in cellule epatiche. Dopo tre giorni di coltura di cellule staminali stromali del midollo osseo in un terreno condizionato ottenuto incubando epatociti embrionali di topo, sono state riscontrate cellule di grandi dimensioni e di forma sferica, spesso binucleari, con inclusioni citoplasmatiche di varie dimensioni. Queste cellule si trovavano in diversi stadi di differenziazione e differivano per dimensioni, numero di nuclei e inclusioni nel citoplasma. Nella maggior parte di queste cellule è stato rilevato glicogeno, sulla base del quale gli autori le hanno identificate come cellule precursori degli epatociti. Poiché nella coltura non sono state trovate cellule simili ai neuroblasti, si è concluso che il terreno condizionato ottenuto dalla coltura di epatociti embrionali fosse privo di fattori di differenziazione delle cellule nervose e, al contrario, contenesse fattori che inducevano la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo in cellule precursori degli epatociti. In conclusione, gli autori suggeriscono la presenza di pluripotenza nelle cellule stromali del midollo osseo, poiché esse si differenziano in vitro in cellule nervose o epatiche a seconda dei mezzi condizionati specifici e degli induttori utilizzati.

Alcuni studi hanno infatti dimostrato correttamente la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo in cardiomiociti, cartilagine, cellule ossee e cellule del tessuto nervoso. Vi sono evidenze che tra le cellule del midollo osseo esistano popolazioni di cellule staminali capaci di differenziarsi in epatociti. Alla luce di questi dati, i risultati degli esperimenti sui topi sopra citati possono ancora essere considerati un'ulteriore conferma della presenza nel midollo osseo di cellule staminali mesenchimali pluripotenti capaci di differenziarsi in cellule di vari tessuti di un organismo adulto.

Trapianto di cellule staminali mesenchimali

In trapiantologia clinica, le cellule staminali mesenchimali umane possono essere utilizzate per garantire l'espansione delle cellule staminali emopoietiche, così come dei loro discendenti pre-commissionati. In particolare, l'introduzione di cellule staminali emopoietiche autologhe e MSC in pazienti oncologici dopo chemioterapia ad alte dosi accelera il ripristino del numero di neutrofili e piastrine nel sangue periferico. I trapianti allo- e autologhi di cellule staminali mesenchimali sono utilizzati per il trattamento del mieloma multiplo, dell'anemia aplastica e della trombocitopenia spontanea, patologie associate a un difetto primario nello stroma del tessuto emopoietico. L'efficacia della terapia cellulare nella patologia oncoematologica è in molti casi maggiore con l'introduzione simultanea di cellule staminali stromali ed emopoietiche, il che si manifesta in una riduzione del periodo postoperatorio di ripristino dell'emopoiesi e in una diminuzione del numero di esiti fatali dovuti alla distruzione non selettiva delle cellule tumorali regionali e circolanti, in cui muoiono anche le cellule progenitrici emopoietiche del paziente stesso. Le prospettive di utilizzo delle MSC e di altre cellule progenitrici mesenchimali multipotenti nella pratica clinica sono dovute alla relativa facilità di ottenimento da aspirati midollari, all'espansione in coltura e alla trasfezione di geni terapeutici. Allo stesso tempo, l'impianto locale di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti può essere utilizzato per compensare difetti tissutali locali e, in caso di disfunzioni sistemiche dei tessuti di origine mesenchimale, non è esclusa la loro introduzione nel flusso sanguigno generale.

Gli autori di lavori in cui le prospettive di utilizzo delle MSC per il trapianto locale, sistemico e la terapia genica vengono analizzate dal punto di vista della biologia delle cellule stromali, sono più cauti nel loro ragionamento. Il midollo osseo postnatale è tradizionalmente considerato un organo costituito da due sistemi principali di linee cellulari chiaramente definite: il tessuto emopoietico vero e proprio e lo stroma di supporto ad esso associato. Pertanto, le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo sono state inizialmente considerate esclusivamente come una fonte di base stromale per la produzione di fattori regolatori del microambiente emopoietico. Successivamente, l'attenzione dei ricercatori si è spostata sullo studio del ruolo delle MSC come fonte di cellule staminali per i tessuti scheletrici. I dati più recenti indicano un potenziale inaspettato per la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo con la formazione di tessuto nervoso o muscolare. In altre parole, le cellule staminali mesenchimali mostrano plasticità transgermale, ovvero la capacità di differenziarsi in tipi cellulari fenotipicamente estranei alle cellule del tessuto originale. Allo stesso tempo, alcuni aspetti della biologia delle cellule stromali del midollo osseo rimangono poco chiari e irrisolti, sia in termini biologici generali che nei singoli dettagli, tra cui l'identificazione, la natura, l'origine, lo sviluppo e la funzione in vivo delle cellule stromali del midollo osseo, nonché il potenziale di differenziazione ammissibile ex vivo e le possibilità di uso terapeutico in vivo. I dati ottenuti sul potenziale delle MSC, così come i risultati degli studi sul potenziale rigenerativo di altre cellule staminali, sono in netta contraddizione con i dogmi stabiliti in biologia.

Coltivate a bassa densità, le cellule staminali stromali del midollo osseo formano colonie distinte, ciascuna derivata da una singola cellula progenitrice. La percentuale di cellule progenitrici stromali nelle cellule nucleate del midollo osseo, determinata dalla capacità di formare colonie, dipende fortemente sia dalle condizioni di coltura che dalla specie di MSC. Ad esempio, nei roditori, la presenza di cellule nutrici del midollo osseo irradiate e di siero nella coltura è assolutamente necessaria per ottenere il massimo numero di cellule progenitrici stromali, mentre nell'uomo l'efficienza di formazione di colonie delle cellule staminali mesenchimali è indipendente sia dal mezzo di coltura che da quello di coltura. Il numero di fattori mitogeni noti che stimolano la proliferazione delle cellule progenitrici stromali è limitato. Tra questi, PDGF, EGF, FGF, TGF-β e IGF-1. In condizioni di coltura ottimali, le linee MSC policlonali possono resistere a più di 50 divisioni cellulari in vitro, rendendo possibile ottenere miliardi di cellule stromali del midollo osseo da 1 ml del loro aspirato.

Tuttavia, la popolazione di cellule stromali del midollo osseo è eterogenea, il che si manifesta sia nella variabilità delle dimensioni delle colonie, sia nella diversa velocità di formazione, e in una varietà di morfologia cellulare, che spazia da cellule fusiformi simili a quelle dei fibroblasti a grandi cellule piatte. Durante lo sviluppo di tali colture, si nota anche un'eterogeneità fenotipica dopo 20 giorni. Alcune colonie sono caratterizzate da un'elevata espressione di fosfatasi alcalina, altre non la esprimono affatto, e le colonie del terzo tipo sono fosfatasi-positive nella regione centrale e fosfatasi-negative in periferia. Le singole colonie formano noduli di tessuto osseo (l'inizio della mineralizzazione della matrice è evidenziato dalla colorazione con rosso di alizarina o per il calcio secondo Van Koss). In altre colonie si verifica un accumulo di grasso, identificato dalla colorazione G con rosso olio. Meno frequentemente, le colonie di cellule staminali mesenchimali formano cartilagini colorate con blu Alcian).

Dopo il trapianto ectopico in animali da esperimento, le linee policlonali di MGK formano osso ectopico con uno stroma reticolare associato a mielopoiesi e adipociti e, meno comunemente, a tessuto cartilagineo. Quando vengono trapiantate linee monoclonali di cellule stromali del midollo osseo, in alcuni casi si osserva chimerismo, in cui l'osso de novo è costituito da cellule del tessuto osseo, contiene stroma e adipociti di origine donatrice, mentre le cellule della linea emopoietica e del sistema vascolare derivano dal ricevente.

I risultati di questi studi confermano la natura staminale delle cellule progenitrici stromali del midollo osseo da cui è stata derivata la linea clonale. Indicano inoltre che non tutte le cellule clonogeniche in coltura sono realmente cellule staminali multipotenti. Alcuni ricercatori ritengono, e noi condividiamo la loro opinione, che le informazioni più affidabili sul reale potenziale di differenziazione dei singoli cloni possano essere ottenute solo in vivo dopo il trapianto, e non determinando il fenotipo dei loro derivati in vitro. L'espressione in coltura di marcatori fenotipici di osteo-, condro- o adipogenesi (determinati da mRNA o da tecniche istochimiche) e persino la produzione di matrice mineralizzata non riflettono il grado di pluripotenza di un singolo clone in vivo. Pertanto, l'identificazione di cellule staminali in un gruppo di cellule stromali è possibile solo a posteriori, nelle appropriate condizioni di un test di trapianto biologico. In particolare, la condrogenesi è molto raramente osservata nei sistemi di trapianto aperti, mentre la formazione di cartilagine è tutt'altro che rara in sistemi chiusi come camere di diffusione o colture in vitro di micromassa di cellule stromali, dove si raggiunge una bassa tensione di ossigeno locale, che promuove la formazione di tessuto cartilagineo. Pertanto, anche la tecnica di trapianto, così come le condizioni di coltura in vitro non specifiche, influenzano significativamente l'intervallo di differenziazione delle MSC.

Il trapianto sperimentale in condizioni sperimentali specifiche rappresenta il gold standard per determinare il potenziale di differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e un elemento chiave per la loro identificazione. Storicamente, gli studi sul trapianto di cellule stromali del midollo osseo sono associati al problema generale del trapianto di midollo osseo. È stato dimostrato che il microambiente emopoietico viene creato trapiantando linee cellulari stromali del midollo osseo e favorisce lo sviluppo ectopico di tessuto emopoietico nella zona di trapianto. L'origine del microambiente dal donatore e del tessuto emopoietico dall'ospite ci consente di considerare l'osso ectopico come un vero e proprio trapianto di midollo osseo "invertito". Il trapianto locale di cellule stromali del midollo osseo promuove un'efficace correzione dei difetti ossei, più pronunciata rispetto alla rigenerazione riparativa spontanea. Diversi studi preclinici su modelli sperimentali hanno dimostrato in modo convincente la possibilità di utilizzare i trapianti di cellule stromali del midollo osseo in ortopedia, sebbene siano necessari un lavoro e un'analisi più accurati per ottimizzare questi metodi, anche nei casi più semplici. In particolare, non sono ancora state stabilite le condizioni ottimali per l'espansione delle cellule stromali osteogeniche ex vivo, la struttura e la composizione del vettore ideale, così come il numero di cellule necessarie per la rigenerazione ossea volumetrica, restano poco sviluppate.

Oltre all'utilizzo di cellule stromali midollari espanse ex vivo per la rigenerazione di tessuti di origine mesenchimale, la plasticità non ortodossa delle MSC apre potenziali applicazioni per la rigenerazione di cellule neurali o per il rilascio di prodotti genici nel sistema nervoso centrale. In linea di principio, questo semplifica la terapia cellulare per il danno al sistema nervoso, poiché non è necessario ottenere cellule staminali neurali umane autologhe. Sono state segnalate potenziali applicazioni delle cellule midollari per la generazione di cardiomiociti e cellule progenitrici miogeniche sia di origine stromale che extrastromale.

Sono in corso esperimenti sul trapianto sistemico di cellule stromali del midollo osseo per il trattamento di comuni patologie scheletriche. Non vi è dubbio che le cellule stromali del midollo osseo siano la popolazione responsabile delle patologie genetiche nelle patologie scheletriche, come ben dimostrato dal trasferimento vettoriale di informazioni genetiche tramite queste cellule, che porta alla formazione di tessuto osseo patologico negli animali da esperimento. Tuttavia, la capacità delle cellule stromali di impiantarsi, attecchire, proliferare e differenziarsi nelle ossa scheletriche dopo l'introduzione nel flusso sanguigno generale non è stata ancora dimostrata.

Ciò è in parte dovuto al fatto che nel trapianto standard di midollo osseo lo stroma non viene trapiantato insieme al tessuto emopoietico, pertanto non sono ancora stati sviluppati criteri rigorosi per valutare il successo dell'attecchimento delle cellule stromali somministrate per via sistemica. È importante ricordare che la presenza di geni marcatori negli estratti tissutali o l'isolamento di cellule di origine donatrice in coltura non indicano l'attecchimento delle cellule, ma solo la loro sopravvivenza. Anche l'iniezione intra-arteriosa di cellule stromali del midollo osseo in un arto di topo può portare praticamente a zero attecchimento, nonostante il fatto che le cellule di origine donatrice siano presenti in gran numero all'interno della microvascolatura del midollo osseo. Sfortunatamente, tali cellule vengono solitamente descritte come "attecchite" semplicemente sulla base del rilevamento di geni marcatori per le cellule donatrici in coltura ex vivo. Inoltre, è necessario fornire prove convincenti dell'integrazione a lungo termine di cellule di origine donatrice differenziate e funzionalmente attive nei tessuti in studio. In molti articoli pubblicati sull'attecchimento delle cellule stromali del midollo osseo nello scheletro, l'assenza di dati chiari di questo tipo è sorprendente. Tuttavia, va notato che alcuni esperimenti animali corretti hanno effettivamente dimostrato un attecchimento limitato ma reale delle cellule progenitrici stromali dopo la loro somministrazione sistemica.

Questi dati sono coerenti con i risultati di studi sulla possibilità di veicolare cellule progenitrici miogeniche del midollo osseo al muscolo attraverso il sistema vascolare. Tuttavia, non bisogna dimenticare che sia il tessuto scheletrico che quello muscolare si formano durante lo sviluppo e la crescita sulla base di movimenti cellulari extravascolari che utilizzano processi di migrazione che non coinvolgono la circolazione sanguigna. Se esiste una via circolatoria indipendente per il veicolamento delle cellule progenitrici ai tessuti in fase solida, è possibile ipotizzare l'esistenza di cellule progenitrici mesenchimali circolanti fisiologicamente? Qual è l'origine di queste cellule sia nell'organismo in via di sviluppo che in quello postnatale e come penetrano la parete vascolare? La soluzione di questi quesiti sembra assolutamente necessaria e richiede la più attenta analisi preclinica. Anche dopo aver trovato risposta a questi quesiti, gli aspetti cinetici problematici associati alla crescita scheletrica e al rimodellamento del tessuto connettivo rimarranno irrisolti. Allo stesso tempo, il trattamento dei disturbi dell'osteogenesi mediante la sostituzione dell'intera popolazione di cellule progenitrici scheletriche mutate con elementi stromali sani sembra essere una reale prospettiva clinica. In questo caso, le zone di frattura locali o le deformazioni dovute a osteogenesi patologica, così come le alterazioni distruttive del tessuto osseo, possono essere corrette utilizzando cellule staminali stromali coltivate in vitro. Pertanto, è consigliabile concentrare la ricerca futura sui problemi della trasformazione o della correzione genetica di cellule progenitrici osteogeniche autologhe mutate ex vivo.

L'ingegneria genetica cellulare, a breve o lungo termine, è diventata la base della biologia cellulare e molecolare, fonte di numerose scoperte scientifiche riguardanti il ruolo delle singole proteine nel metabolismo cellulare in vitro e in vivo. L'uso delle tecnologie molecolari per la correzione di patologie ereditarie e malattie umane è molto promettente per la medicina pratica, poiché le proprietà delle cellule staminali stromali del midollo osseo consentono di sviluppare schemi di trapianto unici per la correzione di malattie genetiche dello scheletro. Allo stesso tempo, le cellule staminali mesenchimali possono essere facilmente ottenute dal futuro ricevente, sono suscettibili di manipolazione genetica e sono in grado di moltiplicarsi in grandi quantità in un breve periodo di tempo. L'uso di cellule staminali mesenchimali consente di evitare le limitazioni e i rischi associati alla somministrazione di materiale informativo genetico direttamente al paziente tramite costrutti vettoriali intravascolari. Una strategia simile è applicabile alle cellule staminali embrionali, ma le cellule stromali autologhe del midollo osseo postnatali sono un materiale più preferibile, poiché la loro introduzione esclude possibili complicazioni immunologiche post-trapianto. Per ottenere un effetto a breve termine, ad esempio accelerando la rigenerazione ossea, il metodo più ottimale è la modifica genetica delle cellule staminali mesenchimali mediante elettroporazione, fusione chimica, lipofezione, plasmidi e costrutti adenovirali. In particolare, la trasfezione virale in cellule stromali del midollo osseo BMP-2 si è dimostrata efficace nell'accelerare la rigenerazione ossea in pazienti con politrauma sperimentale. La creazione di costrutti vettoriali adenovirali è preferibile per l'assenza di tossicità. Tuttavia, la modifica genetica delle cellule stromali del midollo osseo in questo caso è caratterizzata da una stabilità estremamente bassa. Inoltre, le cellule stromali del midollo osseo trasformate normali richiedono l'uso di vettori portatori di informazioni genetiche 10 volte più infettive rispetto ad altri tipi cellulari, il che aumenta significativamente la percentuale di morte delle cellule trasfettate.

Il trattamento di malattie recessive causate da un'attività biologica bassa o nulla di alcuni geni richiede la modifica a lungo termine o permanente delle cellule staminali mesenchimali, che richiede l'uso di virus adeno-associati, retrovirus, lentivirus o chimere adeno-retrovirali. Le regioni di trasporto di questi virus sono in grado di trasferire grandi quantità di DNA trasfettate (fino a 8 kb). La letteratura scientifica ha già riportato l'attività biologica esogena delle cellule stromali del midollo osseo trasfettate con costrutti retrovirali che codificano per la sintesi di molecole regolatrici e marcatrici - IL-3, CD2, fattore VIII, nonché enzimi coinvolti nella sintesi di L-DOPA. Tuttavia, anche in questi studi, gli autori evidenziano una serie di limitazioni che devono essere superate prima dell'applicazione pratica di questa tecnologia. Il primo problema è ottimizzare il processo di modifica delle MSC ex vivo. È noto che la proliferazione a lungo termine (3-4 settimane) delle cellule stromali del midollo osseo in vitro ne riduce la trasfezione. Allo stesso tempo, per ottenere un elevato livello di modificazione genetica delle MSC, è necessario effettuare diversi cicli di trasfezione. Il secondo problema è legato alla durata dell'espressione genica terapeutica, che non supera ancora i quattro mesi. Una naturale diminuzione dell'espressione genica effettiva è dovuta all'inattivazione del promotore e alla morte delle cellule modificate. Con le prospettive generali di trasferimento dell'informazione genetica mediante cellule staminali mesenchimali, i risultati di studi preliminari indicano la necessità di un'ulteriore ottimizzazione dei metodi di trasfezione ex vivo, della scelta di un promotore adeguato che regoli l'attività biologica nella direzione desiderata e di un aumento della capacità delle cellule stromali del midollo osseo modificate di automantenersi in vivo dopo il trapianto. È opportuno notare che l'uso di costrutti retrovirali per modificare le cellule stromali del midollo osseo nella direzione desiderata non richiede sempre il loro attecchimento obbligatorio. Le cellule staminali mesenchimali trasfettate possono svolgere una funzione correttiva in un contesto di residenza stabile e senza l'obbligo di incorporazione fisica attiva e di funzionamento nel tessuto connettivo. In questo caso vanno considerati come una mini-pompa biologica che produce in vivo un fattore la cui carenza determina la manifestazione della patologia genetica.

L'uso di cellule stromali del midollo osseo trasformate per il trattamento della patologia genetica dominante, caratterizzata dall'espressione di un gene con attività biologica patologica o anomala, è molto più problematico, poiché in questo caso è necessario bloccare il trasferimento o l'implementazione di informazioni genetiche distorte. Uno dei metodi di ingegneria genetica è la ricombinazione omologa di cellule staminali embrionali per creare animali transgenici. Tuttavia, il grado estremamente basso di ricombinazione omologa, combinato con i problemi di identificazione, separazione ed espansione di tali ricombinanti, difficilmente contribuirà all'uso diffuso di questo metodo nel prossimo futuro, anche se verranno sviluppati nuovi metodi tecnologici. Il secondo approccio nella terapia genica della patologia dominante si basa sulla correzione automatica del DNA danneggiato, poiché le mutazioni genetiche possono essere corrette introducendo DNA esogeno con la sequenza desiderata (oligonucleotidi di DNA corti o oligonucleotidi chimerici RNA/DNA), che si lega agli omologhi nel genoma danneggiato. La terza opzione prevede il blocco della trasmissione delle informazioni patologiche, obiettivo che si ottiene mediante l'uso di oligonucleotidi appositamente progettati che si legano a un gene specifico per formare una struttura elicoidale ternaria che elimina la possibilità di trascrizione.

Sebbene la correzione di una malattia genetica a livello del genoma rimanga il metodo terapeutico più ottimale e preferito, l'mRNA è anche un vettore promettente (forse anche più accessibile) per bloccare un gene dominante negativo. Molecole proteiche con oligonucleotidi antisenso o sequenze complete che bloccano il legame dell'mRNA all'apparato biosintetico cellulare sono state a lungo utilizzate per inibire la traduzione e/o aumentarne la degradazione. Inoltre, l'RNA a doppio filamento induce una rapida degradazione dell'mRNA, il cui meccanismo rimane poco chiaro. Tuttavia, è improbabile che la semplice eliminazione degli mRNA trascritti da un allele mutante con mutazioni brevi o singole promuova l'espressione dell'mRNA dell'allele normale. Un'alternativa è l'uso di ribosintesi a testa di martello e a forcina, che hanno la capacità di legarsi a regioni altamente specifiche dell'mRNA con successiva induzione della loro scissione e inattivazione durante la traduzione. La possibilità di utilizzare questo metodo nella terapia dell'osteogenesi patologica è attualmente in fase di studio. Indipendentemente da quale sia esattamente l'obiettivo (elementi genomici o citoplasmatici), il successo delle nuove tecnologie di terapia genica sarà determinato dall'efficienza dell'inclusione dei reagenti nelle cellule stromali del midollo osseo ex vivo, dalla scelta ottimale di un vettore specifico e dalla capacità stabile delle cellule staminali mesenchimali di esprimere i fattori necessari in vivo.

Pertanto, la scoperta delle cellule staminali mesenchimali con le loro proprietà inaspettate apre un nuovo schema concettuale per lo sviluppo di linee cellulari. Tuttavia, sono necessarie ulteriori ricerche interdisciplinari per comprendere il ruolo biologico delle cellule staminali stromali, la loro natura, la loro capacità di transdifferenziarsi o dedifferenziarsi, il loro significato fisiologico durante lo sviluppo embrionale, la crescita postnatale, la maturazione e l'invecchiamento, nonché nelle patologie umane.