Cellule staminali mesenchimali

Tra le cellule staminali regionali, le cellule staminali mesenchimali (MSC) occupano un posto speciale, i cui derivati costituiscono la matrice stromale di tutti gli organi e tessuti del corpo umano. La priorità nella ricerca di MSC appartiene ai rappresentanti della scienza biologica russa.

A metà del secolo scorso, una coltura omogenea di cellule staminali del midollo osseo stromale multipotente fu isolata per la prima volta nel laboratorio di A. Friedenshtein. Cellule staminali mesenchimali attaccato ad un substrato per lungo tempo mantenuto un alto tasso di proliferazione, e colture a bassa densità di semina dopo fissazione su un substrato formato di cloni cellulari di fibroblasti aventi attività fagocitaria. L'interruzione della proliferazione della MSC ha portato alla loro spontanea differenziazione in vitro in cellule di tessuto osseo, grasso, cartilagineo, muscolare o connettivo. Ulteriori studi hanno reso possibile stabilire il potenziale osteogenico di cellule simili ai fibroblasti dello stroma di midollo osseo di varie specie di mammiferi, nonché la loro attività di formazione di colonie. Esperimenti in vivo, è stato dimostrato che sia il trapianto etero- sia ortotopico di cellule simili ai fibroblasti che formano colonie è completato dalla formazione di tessuto osseo, cartilaginoso, fibroso e adiposo. Poiché le cellule staminali del midollo osseo hanno un'elevata capacità di auto-rinnovamento e una varietà di differenziazione all'interno di una singola linea cellulare, sono state definite cellule progenitrici mesenchimali multipotenti.

Va notato che per 45 anni di ricerca fondamentale di cellule staminali mesenchimali, sono state create condizioni reali per l'uso dei loro derivati nella pratica clinica.

Oggi, non c'è dubbio che tutti i tessuti del corpo umano sono formati dalle cellule staminali di diverse linee cellulari come risultato di processi di proliferazione, migrazione, differenziazione e maturazione. Tuttavia, più recentemente, si riteneva che le cellule staminali nel corpo adulto fossero specifiche per il tessuto, cioè in grado di produrre linee cellulari specializzate solo dei tessuti in cui si trovano. Questa situazione concettuale è stata confutata dai fatti di trasformazione delle cellule staminali ematopoietiche non solo negli elementi cellulari del sangue periferico, ma anche nelle cellule epatiche ovali. Inoltre, le cellule staminali neurali sono state in grado di dare origine sia a neuroni sia a elementi gliali, nonché a linee precoci impegnate di cellule progenitrici ematopoietiche. A loro volta, le cellule staminali mesenchimali, che producono in genere elementi cellulari dell'osso, della cartilagine e del tessuto adiposo, sono in grado di trasformarsi in cellule staminali neurali. Si presume che nel processo di crescita, rigenerazione del tessuto fisiologico e riparativo, le cellule progenitrici non impegnate siano generate da riserve staminali specifiche del tessuto. Ad esempio, la riparazione del tessuto muscolare può essere realizzata mediante cellule staminali mesenchimali che migrano dal midollo osseo ai muscoli scheletrici.

Anche se queste cellule staminali croce intercambiabilità riconoscere non tutti i ricercatori la possibilità di uso clinico delle cellule staminali mesenchimali come fonte per il trapianto di cellule e cellule vettore di informazioni genetiche non ha contestato come le cellule staminali multipotenti stromali del midollo osseo, che possono essere relativamente facili da isolare e propagare in cultura in vitro. Allo stesso tempo, nella letteratura scientifica continua ad apparire rapporti circa il potenziale delle cellule staminali pluripotenti dello stroma del midollo osseo. Come protocolli di ricerca prove presentate, che sotto l'influenza di induttori specifici di transdifferenziazione delle cellule staminali mesenchimali vengono convertiti in cellule nervose, cardiomiociti e epatociti. Tuttavia, alcuni scienziati l'opportunità di ri-attivazione e l'espressione del gene durante l'embriogenesi precoce in serio dubbio. Allo stesso tempo, ognuno capisca che se le condizioni sono trovati per espandere le cellule staminali mesenchimali multipotenti alla pluripotenza dei CES nella medicina rigenerativa e plastica risolto automaticamente molti problemi di natura etica, morale, religiosa e giuridica. Inoltre, poiché in questo caso la sorgente di stelo capacità rigenerativa del paziente sono cellule stromali autologhe è risolto e il problema del rigetto del trapianto di cellule. Quanto sono reali queste prospettive, mostrerà il prossimo futuro.

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Uso di cellule staminali mesenchimali in medicina

L'uso di derivati clinica di cellule staminali mesenchimali è associata soprattutto con la riduzione dei difetti del tessuto causate da estese e profonde lesioni termiche della pelle. Valutazione sperimentale preclinica dell'appropriatezza di cellule staminali mesenchimali allogeniche fibroblasti come per il trattamento di ustioni profonde stata condotta. Si dimostra che il midollo osseo cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili formano un monostrato di coltura, che rende possibile trapiantare per ottimizzare la rigenerazione di ustioni profonde. Gli autori fanno notare che le proprietà simili hanno fibroblasti embrionali, ma l'applicazione clinica di questi ultimi è limitato a problemi etici e giuridici esistenti. Una profonda bruciatura termica con danni a tutti gli strati della pelle è stata modellata sui ratti Wistar. L'area della bruciatura era del 18-20% della superficie totale della pelle. Nel primo gruppo sperimentale era costituito da ratti con profonda lesione termica e il trapianto di cellule staminali mesenchimali derivate fibroblasti allogeniche. Il secondo gruppo consisteva in animali con una profonda ustione termica e una transplantazione di fibroblasti allogenici embrionali. Il terzo gruppo era rappresentato da ratti di controllo con un'ustione termica profonda, che non effettuavano la terapia cellulare. Una sospensione di cellule staminali mesenchimali derivate fibroblasti e fibroblasti embrionali è stato applicato ad una superficie ustione ferita pipettati in una quantità di 2 × 10 ⁴ cellule al 2 ° giorno dopo l'asportazione di ustione modellazione e escara necrotica formata. Dopo il trapianto, cellule bruciano superficie coperta con una garza imbevuta di soluzione di cloruro di sodio isotonica con gentamicina. Cellule del midollo osseo recinzione per ottenere MSC con conseguente induzione di linea fibroblasti in cellule staminali mesenchimali prodotte in ratti Wistar adulti dai femori. I fibroblasti embrionali sono stati ottenuti dai polmoni di embrioni di 14-17 giorni. Fibroblasti embrionali e le cellule del midollo osseo per ottenere una pre-MSC sono state coltivate in piastre di Petri a 37 ° C in un iikubatore C02, in un'atmosfera con 5% CO2 a 95% di umidità. Fibroblasti embrionali sono coltivate per 4-6 giorni, mentre per la formazione monostrato MSC richiesto da 14 a 17 giorni. MSC successivamente mantenute da crioconservazione come materiale di partenza per le cellule staminali mesenchimali derivate fibroblasti che sono stati preparati da scongelamento e MSC di coltura per 4 giorni. Numero di cellule staminali mesenchimali fibroblasti generato è più di 3 volte il numero di fibroblasti embrionali derivanti durante lo stesso periodo di coltura. Per identificare cellule in transtslantirovannyh bruciano ferite nel passaggio coltura loro genoma virale all'etichetta vettore shuttle basato su un adenovirus ricombinante V tipo carrier 1come-2 gene codificante ß-galattosidasi di E. Coli. Cellule viventi in vari momenti dopo il trapianto rilevati immunohistochemically nelle criosezioni con substrato aggiunto X-Gal, dando il caratteristico colore blu-verde. Come risultato della dinamica visiva, planimetrica ed istologica condizioni la valutazione delle ferite da ustione, si è constatato che anche al 3 ° giorno dopo il trapianto delle cellule in gruppi isolati appaiono differenze significative durante processo di guarigione. Particolarmente distinta, questa differenza è diventata il 7 ° giorno dopo il trapianto di cellule. Gli animali del primo gruppo, che sono stati trapiantati cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili, ferita acquisiti colore intenso uniforme rosato, tessuto di granulazione è cresciuto su tutta la sua superficie al livello dell'epidermide, e bruciare la superficie è considerevolmente ridotta nelle dimensioni. Il film di collagene formato sulla superficie della ferita era un po 'diradandosi, ma continuava a coprire l'intera area di bruciatura. Gli animali del secondo gruppo, che sono stati trapiantati fibroblasti embrionali, tessuto di granulazione viene sollevato al livello dell'epidermide dei bordi della ferita, ma solo in alcuni punti, allo stesso plazmoreya tempo dalla ferita era più intensa che nel gruppo 1, e la pellicola collagene inizialmente formata praticamente scomparse. Negli animali che non hanno ricevuto terapia con cellule staminali, al 7 ° giorno bruciare ferita era una pallida, snocciolate, tessuto necrotico, rivestito con fibrina. La plasmorrea è stata notata in tutta la superficie della bruciatura. Istologicamente, gli animali del 1 ° e 2 ° gruppi hanno mostrato una diminuzione di infiltrazione e lo sviluppo del sistema vascolare cellulare, questi segni di processo rigeneratore incipiente sono stati più gravi nei ratti nel Gruppo 1. Nel gruppo di controllo ha mostrato segni di cellule ferita infiltrazione, il quadro istologico dei vasi sanguigni neoformati assenti. 15-30 ° giorno di osservazione degli animali del 1 ° superficie gruppo bruciare era significativamente inferiore a quello dei ratti di altri gruppi e di superficie di granulazione era più sviluppata. Negli animali della superficie ustione 2 ° gruppo è diminuito anche rispetto alle dimensioni di ustioni nel gruppo di controllo di ratti che era a causa di cicatrizzazione marginale. Nel controllo del gruppo siti superficiali ustionati sono rimasti granulazioni pallido con rara, in essi contenute vene varicose, isolotti erano placca fibrinoso continuato plazmoreya moderato su tutta la superficie ustione, qualcosa che è difficile crosta staccabile è rimasto. In generale, gli animali del terzo gruppo hanno anche ridotto le dimensioni della ferita, ma i bordi della ferita sono rimasti a valle.

Così, durante uno studio comparativo di guarigione della lesione utilizzando cellule staminali mesenchimali fibroblasti derivati da fibroblasti fetali, e senza l'uso della terapia cellulare marcata accelerazione della guarigione della superficie ustione a seguito di trapianto di cellule staminali mesenchimali fibroblasti derivati da fibroblasti embrionali. Tuttavia, nel caso di utilizzo di cellule staminali mesenchimali allogeniche di fibroblasti della ferita tasso di guarigione è stata più elevata rispetto al trapianto di fibroblasti embrionali. Questo si è manifestato per accelerare cambiamento di fasi di rigenerazione del processo - ridurre periodi infiltrazione cellulare, aumenta il tasso di proliferazione delle reti vascolari, così come la formazione di tessuto di granulazione.

I risultati della planimetria dinamica indicano che il tasso di guarigione spontanea della ferita da ustione (senza l'uso della terapia cellulare) era il più basso. Il 15 e il 30 ° giorno dopo il trapianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche di fibroblasti della ferita tasso di guarigione è stata più elevata rispetto al trapianto di fibroblasti embrionali. Metodo di istochimica per il rilevamento di beta-galattosidasi ha mostrato che dopo il trapianto di cellule staminali mesenchimali fibroblasti-simili e fibroblasti embrionali durante l'intero periodo di osservazione in superficie e in profondità rigenerazione delle cellule trapiantate ferite rimangono vitali. Gli autori suggeriscono che un più alto tasso di rigenerazione ustioni utilizzando cellule staminali mesenchimali di fibroblasti liberazione condizionata da queste cellule durante la maturazione rostostimuliruyushih fattori bioattivi.

Il trapianto di autologo o allogenico cheratinociti e fibroblasti allogenici per il trattamento delle ustioni e utilizzati in clinica. Va notato che il trattamento chirurgico dei bambini con ustioni estese in profondità è un compito complicato a causa della elevata molteplicità di traumi e chirurgiche interventi, significativa perdita di sangue, sulle diverse reazioni dei media utilizzati infusione. Le principali difficoltà di attuazione della pelle e la chirurgia plastica con ampie ustioni profonde, la zona superiore al 40% della superficie corporea, a causa della gravità della sua condizione e la mancanza di risorse di pelle donatore. L'uso di innesti maglia con elevato rapporto di perforazione non risolve il problema, in quanto l'immagine dopo la foratura cella epiteliziruyutsya è molto lenta, e spesso fanno innesti cutanei vengono lisati o secca. Tali rivestimenti bruciano ferite come ksenokozha, allotrapianti cadavere, rivestimenti pellicolari sintetici non sono sempre sufficientemente efficaci, quindi lo sviluppo di nuovi metodi per la chiusura degli strati superficiali ustione di cheratinociti coltivati e fibroblasti. In particolare, un metodo di chiusura superfici di combustione usando allofibroblastov coltivate fornire durante il trapianto pronunciato effetto stimolante sulla proliferazione epidermotsitov conservato nel bordo ferita a ustioni, e in cheratinociti innesti maglia strati. Nel Budkevich L. Et al (2000) mostra i risultati dell'applicazione di questo metodo per il trattamento delle ustioni nei bambini. 31 bambini con traumi termici di età compresa tra 1 e 14 anni erano sotto osservazione. A tre figli superficie totale bruciare ferite IIIA-B - IV grado è stata del 40%, 25 - 50-70%, anche a tre - 71-85% della superficie corporea. All'inizio necrectomy chirurgico combinato con il trapianto di allofibroblastov colta e autodermaplasty. Nel primo trattamento fase è stata condotta l'asportazione del tessuto necrotico, la seconda - sul trapianto di coltura foglio di supporto allofibroblastov, il terzo (48 ore dopo il trapianto di allofibroblastov coltura) - rimozione della matrice e della pelle lembi con rapporto di perforazione autodermoplasty di 1: 4. Tre pazienti ricoverati in ospedale con la malattia grave ustione, allofibroblasty coltivate sono stati trapiantati su granulazione ferite. Il trapianto di allofibroblastov colta eseguita una volta in 18 bambini, due volte - alle 11, tre - due pazienti. L'area della superficie della ferita coperta dalla coltura cellulare era compresa tra 30 e 3500 cm2. Efficacia di allofibroblastov colta valutate dalla percentuale totale di attecchimento dei lembi cutanei, tempo di guarigione delle ustioni e il numero di morti gravi lesioni termiche. L'attecchimento dei trapianti è stato completato nell'86% dei pazienti. Una parziale assenza di lembi cutanei è stata osservata nel 14% dei casi. Nonostante il trattamento in corso, sono morti sei bambini (19,3%). L'area totale della lesione cutanea in esse conteneva dal 40% al 70% della superficie corporea. Il trapianto di allo-fibroblasti in coltura non era correlato al risultato fatale di una lesione da ustione in nessun paziente.

Analizzando i risultati del trattamento, gli autori notano che brucia precedenti incompatibili con la vita, per il trattamento profondo danno termico della zona di pelle del 35-40% della superficie corporea (per i bambini piccoli - fino a 3 anni - sono ustioni profonde critiche con una superficie pari al 30%, per i bambini più grandi età - oltre il 40% della superficie corporea). Quando il trapianto chirurgico di colta autodermaplasty necrectomy allofibroblastov e successiva pelle innesti con grandi ustioni, fattore di perforazione IIIB - IV grado rimangono critiche, ma al momento non ci sono prospettive in molti casi, per salvare la vita anche di tali vittime. Necrectomy chirurgico in combinazione con il trapianto di allofibroblastov colto e autodermaplasty nei bambini con ustioni profonde ha dimostrato di essere particolarmente efficace nei pazienti con lesioni avanzate della pelle con un deficit di siti donatori. Attivo tattica chirurgica e trapianto allofibroblastov colta promuovere una rapida stabilizzazione della condizione generale di questi pazienti, la riduzione del numero di complicanze infettive della malattia bruciare, creando condizioni favorevoli per l'attecchimento, ridurre il tempo necessario per ripristinare la pelle perduta e la durata del trattamento ospedaliero, riducendo l'incidenza dei decessi nei pazienti con ustioni estese. Così, il trapianto di allofibroblastov colta seguita lembi cutanei autodermaplasty raggiunge recupero nei bambini con ustioni gravi, che in precedenza erano considerati condannato.

È ampiamente riconosciuto che l'obiettivo primario del trattamento di una malattia da ustione è di massimizzare il recupero completo e rapido della pelle danneggiata per prevenire gli effetti tossici, le complicazioni infettive e la disidratazione del corpo. I risultati dell'applicazione di cellule coltivate dipendono in gran parte dalla preparazione per il trapianto della stessa ferita da ustione. In caso di trapianto di cheratinociti coltivati alla superficie della ferita dopo necrectomy chirurgica prizhivlyaetsya una media del 55% (in area) di cellule trapiantate, mentre le ferite granulazione tasso attecchimento è ridotta al 15%. Pertanto, il trattamento efficace di estese bruciature della pelle richiede, in primo luogo, tattiche chirurgiche attive. In presenza di ustioni IIIB-IV, la superficie della bruciatura viene immediatamente rilasciata dai tessuti necrotici al fine di ridurre gli effetti dell'intossicazione e ridurre il numero di complicanze della malattia da ustione. L'uso di tali tattiche è la chiave per ridurre il tempo dal momento in cui si brucia per chiudere le ferite e la durata della degenza dei pazienti con gravi ustioni in ospedale, e anche ridurre significativamente il numero di morti.

I primi rapporti sull'uso di successo dei cheratinociti coltivati per coprire la superficie dell'ustione apparvero all'inizio degli anni ottanta del secolo scorso. Successivamente, questa manipolazione è stata effettuata con l'aiuto di strati di cheratinociti coltivati, ottenuti più spesso da autocell, molto meno spesso da allococchi. Tuttavia, la tecnologia di autokeratinocytoplasty non consente la creazione di una banca cellulare, mentre il tempo necessario per produrre un innesto sufficiente dai cheratinociti è ampio e ammonta a 3-4 settimane. Durante questo periodo, il rischio di sviluppare complicazioni infettive e di altre complicanze della malattia da ustione aumenta notevolmente, il che prolunga significativamente la durata totale della permanenza dei pazienti in ospedale. Inoltre, gli autokeratinociti praticamente non sopravvivono durante il trapianto in ferite da granulatura, e l'alto costo dei mezzi di crescita speciali e degli stimolanti della crescita dei cheratinociti biologicamente attivi limita significativamente la loro applicazione clinica. Altri metodi biotecnologici, come la collagenoplastica, il trapianto di xenoidi crioconservati e l'uso di vari rivestimenti di biopolimeri aumentano l'efficacia del trattamento di estese bruciature superficiali ma non profonde. Il metodo di rivestimento della superficie della ferita con fibroblasti coltivati è fondamentalmente diverso in quanto il componente principale del pool di cellule in coltura non sono i cheratinociti ma i fibroblasti.

Un prerequisito per lo sviluppo del metodo servito come prova che periciti che circondano i piccoli vasi sono cellule pro genitornymi mesenchimali capaci di trasformare in fibroblasti, che producono molti fattori di crescita e forniscono la guarigione delle ferite a causa del forte effetto stimolante sulla proliferazione e l'adesione dei cheratinociti. Utilizzando colture di fibroblasti di chiusura superfici della ferita immediatamente identificato un certo numero di vantaggi significativi di questo metodo rispetto all'uso di cheratinociti coltivati. In particolare, la preparazione di fibroblasti in coltura non richiede l'uso di mezzi di coltura e di crescita promotori speciali, che riduce il costo del trapianto di più di 10 volte il costo di ottenere cheratinociti. I fibroblasti sono facilmente soggetti a passaging, durante il quale essi parzialmente perdono le loro antigeni di istocompatibilità superficie, che a sua volta rende possibile usare per la fabbricazione di trapianti allogenici di cellule e creare loro banche. Accorcia trapianti che ricevono, pronti per l'uso in una clinica, da 3 settimane (cheratinociti) 1-2 giorni (per i fibroblasti). Colture primarie di fibroblasti possono essere ottenute coltivando cellule da frammenti di cute prelevati a autodermoplasty e semina delle cellule densità su subcolture ricevuta di fibroblasti umani è solo 20 × 10 ³ a 1 centimetro ².

Per studiare l'effetto di fibroblasti e le loro proteine regolatrici della proliferazione e differenziazione di cheratinociti, un'analisi comparativa delle caratteristiche e morfologia della proliferazione dei cheratinociti su substrati di collagene di tipo I e III e fibronectina in co-coltura con fibroblasti umani. Cheratinociti umani sono stati isolati da frammenti di pelle di pazienti con ustioni, scattate durante il funzionamento autodermoplasty. La densità dei cheratinociti era di 50 x 103 cellule per cm2. L'efficacia clinica del trapianto di fibroblasti in coltura è stata valutata in 517 pazienti. Tutti i pazienti sono stati divisi in due gruppi: 1 ° - adulti affetti da ustioni IIA, B - IV grado; 2o - bambini con ustioni profonde di IIIB - IV grado. Valutazione delle dinamiche di organizzazione strutturale e funzionale della coltura monostrato di fibroblasti quanto riguarda il ruolo nel processo di rigenerazione di glicosaminoglicani, fibronectina, collagene, e ha permesso agli autori di determinare il terzo giorno come le condizioni più favorevoli di usando colture di fibroblasti per la produzione di trapianti. Indagine di impatto sulla proliferazione dei fibroblasti e differenziazione di cheratinociti mostrato che sotto fibroblasti in vitro hanno un effetto stimolante pronunciato, principalmente su processi di adesione cheratinociti, aumentando il numero di cellule aderenti e il tasso di fissare più di 2 volte. Processi stimolazione adesione accompagnate da un aumento dell'intensità della sintesi del DNA e del livello di proliferazione dei cheratinociti. Inoltre, si è riscontrato che la presenza di fibroblasti e matrice extracellulare formata da loro è un prerequisito per la formazione tonofibrillyarnogo apparato cheratinociti connessioni intercellulari e, in definitiva, per la differenziazione dei cheratinociti e formazione membrana basale. Nel trattamento dei bambini con ustioni profonde stabilito l'efficacia clinica della cultura del trapianto allofibroblastov, specialmente nei pazienti con lesioni estese dei siti donatori pelle in un deficit. Studio morfofunktcionalnoe complesso ha mostrato che innesto caratterizzato fibroblasti di sintesi attiva del DNA, così come il collagene, fibronectina e glicosaminoglicani, che sono generati nelle celle della matrice extracellulare. Gli autori suggeriscono un'alta percentuale di attecchimento dei fibroblasti trapiantati (al 96%), una forte riduzione in termini di preparazione (entro 2-3 ore invece di 24-48 settimane nel caso dei cheratinociti), un'importante accelerazione della cicatrizzazione della superficie ustione, ed una significativa riduzione di prezzo (a 10 tempi) della tecnologia di crescita dell'innesto da fibroblasti rispetto al trapianto di cheratinociti. L'uso di trapianto di allofibroblastov colta permette di salvare la vita dei bambini con ustioni critici - danno termico oltre il 50% della superficie corporea, che è stato pensato in precedenza incompatibile con la vita. È interessante notare che il trapianto allogenico di fibroblasti embrionali anche convincente dimostrato non solo più rapida rigenerazione di ferite e pazienti con vari convalescenza grado bruciare e zona, ma anche una sostanziale riduzione della mortalità.

Fibroblasti autologhi sono utilizzati in un complicato e chirurgia plastica come un danno correzione sostituzione delle corde vocali. Solitamente usato per questo scopo collagene bovino, durata di azione che è limitata dalla sua immunogenicità. Essendo una proteina estranea, collagene bovino, collagenasi sensibile al destinatario e può causare reazioni immunitarie, per ridurre il rischio che sono stati sviluppati la tecnologia delle preparazioni di collagene, reticolato con glutaraldeide. Il loro vantaggio è una maggiore stabilità e inferiore immunogenicità, che ha trovato applicazione pratica nella rimozione di difetti e atrofia corde vocali. Le iniezioni di collagene autologo sono state usate per la prima volta nel 1995. Metodi fornito conservazione della struttura primaria delle fibre di collagene autologo, tra reticolazioni intramolecolari enzimaticamente catalizzate. Il fatto che le fibre di collagene naturali sono più resistenti alla degradazione da parte di proteasi di telopeptide collagene ricostituito cui taglio. Integrità telopeptide importante per la struttura quaternaria delle fibre di collagene e la reticolazione tra molecole di collagene adiacenti. Diversamente preparazioni di collagene bovino, collagene autologo non provoca risposte immunitarie del destinatario, ma non è sufficientemente efficace come agente riempie. La correzione persistente può essere ottenuta mediante produzione locale di collagene mediante trapianto autologo di fibroblasti. Tuttavia, l'indagine di efficacia del trapianto di fibroblasti autologhi in clinica ha rivelato alcune difficoltà. Nel primo periodo dopo il trapianto di fibroblasti effetto clinico era più debole rispetto a quella dopo la somministrazione di collagene bovino. Quando coltivate fibroblasti autologhi non possono escludere la possibilità di trasformazione di fibroblasti normali anormale, i cosiddetti miofibroblasti, responsabili dello sviluppo della fibrosi e cicatrici, come evidenziato dalla riduzione gel di collagene, a causa della interazione specifica di fibroblasti e fibrille di collagene. Inoltre, dopo il passaggio in serie fibroblasti in vitro perdono la loro capacità di sintetizzare le proteine della matrice extracellulare.

Coltivazione Tuttavia, attualmente tecnica sperimentale perfezionato di fibroblasti autologhi umani, che elimini gli inconvenienti sopra citati e conduce alla trasformazione oncogenica di fibroblasti normali. I fibroblasti autologhi ottenuti con questo metodo vengono utilizzati per riempire i difetti dei tessuti molli del viso. In uno studio di G. Keller et al (2000) ha ricevuto il trattamento di 20 pazienti di età compresa tra 37 a 61 anni, con rughe e cicatrici atrofiche. Biopsie cutanee (4 mm) regione BTE abbiamo trasportato al laboratorio in provette sterili contenenti 10 ml di terreno di coltura (Dulbecco mikoseptikom antibiotico, piruvato e siero bovino fetale). Il materiale è stato posto all'interno di 3-5 piatti di coltura con un diametro di 60 mm e incubato in un termostato con un'atmosfera contenente il 5% di CO2. Dopo 1 settimana, le cellule sono state rimosse dalle piastre mediante tripsinizzazione e poste in fiale da 25 cm2. Le cellule sono somministrati a pazienti in una quantità di 4 x 107. L'effetto clinico significativo e duraturo è stata osservata in pazienti con correzione nasolabiali, e nei pazienti con cicatrici dopo 7 e 12 mesi dopo la terza trapianto di fibroblasti autologhi. Secondo la citometria a flusso, i fibroblasti coltivati producevano una grande quantità di collagene di tipo I. Studi in vitro mostrano la normale contrattilità dei fibroblasti iniettabili. Dopo 2 mesi dopo l'iniezione sottocutanea di fibroblasti coltivati in una dose di 4 x 107 cellule in topi nudi, sono stati rilevati tumori. I fibroblasti iniettabili non hanno causato formazione di cicatrici e fibrosi diffusa nei pazienti. Secondo l'autore, attecchimento dei fibroblasti autologhi sono in grado di produrre costantemente collagene che danno il ringiovanimento estetico. In questo caso, poiché le vite di cellule differenziate è limitata, fibroblasti, prelevati da un paziente giovane, sono più efficaci rispetto a quelli ottenuti negli anziani. In futuro, si ipotizza la possibilità di crioconservazione di colture di fibroblasti prelevati da donatore giovane per essere trapiantate in seguito un paziente anziano delle proprie cellule giovani. In conclusione, non è del tutto corretto conclusione che i fibroblasti autologhi, purché la loro sicurezza funzionale sono ideali per la correzione di difetti dei tessuti molli facciali. In questo caso, l'autore si fa notare che durante l'inchiesta sono emersi e alcune situazioni problematiche legate all'uso del sistema di collagene dei fibroblasti autologhi. L'effetto clinico era spesso più debole che con l'uso del collagene bovino, che causava delusioni nei pazienti.

In generale, i dati della letteratura sulle prospettive di utilizzo clinico delle cellule staminali mesenchimali appaiono piuttosto ottimistici. Si tenta di utilizzare cellule progenitrici mesenchimali multipotenti autologo di midollo osseo per il trattamento di lesioni articolari degenerative. Vengono condotti i primi studi clinici su cellule progenitrici mesenchimali coltivate nel trattamento delle fratture complesse dell'osso. Autologhi e cellule del midollo allogeniche mesenchimali stromali del midollo utilizzati per generare tessuto cartilagineo per il trapianto nella correzione dei difetti della cartilagine articolare dovute a traumi o lesioni autoimmuni. Sono in fase di sviluppo metodi di applicazione clinica di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti per l'eliminazione di difetti ossei in bambini con forma grave di osteogenesi incompleta causata da mutazioni del gene di tipo I. Dopo mieloabelyatsii bambini-destinatari del midollo osseo trapiantato da donatore sano compatibile con HLA come il midollo osseo non frazionata può contenere una quantità sufficiente di cellule staminali mesenchimali per ricostituire grave difetto osseo. Dopo il trapianto di midollo osseo allogenico, tali bambini presentavano cambiamenti istologici positivi nelle ossa trabecolari, un aumento del tasso di crescita e una diminuzione dell'incidenza delle fratture ossee. In alcuni casi, si ottiene un risultato clinico positivo trapiantando il midollo osseo allogenico strettamente correlato e gli osteoblasti. Per il trattamento della fragilità congenita delle ossa dovuta allo squilibrio degli osteoblasti e degli osteoclasti nel tessuto osseo, viene anche utilizzato il trapianto di MSK. Il ripristino della formazione ossea in questo caso è ottenuto a causa della chimerizzazione del pool di cellule staminali e progenitrici stromali nel tessuto osseo dei pazienti.

I metodi di modificazione genetica delle cellule staminali mesenchimali del donatore sono stati migliorati per correggere i difetti genetici dei tessuti stromali. Si suppone che le cellule progenitrici mesenchimali saranno presto utilizzati in neurologia per le cellule cerebrali chimerization direzionale e creare un pool di cellule sane, in grado di generare enzima carente o fattore responsabile delle manifestazioni cliniche della malattia. Il trapianto di cellule staminali mesenchimali può essere utilizzato per ripristinare lo stroma del midollo osseo nei pazienti oncologici dopo radioterapia e chemioterapia, e in combinazione con cellule del midollo osseo - per ripristinare l'emopoiesi. Sviluppo della terapia sostitutiva volta ad eliminare i difetti del sistema muscolo-scheletrico utilizzando MSC promuovere ingegneria nei biomateriali matrice disegno o biomimics formano scheletri abitano la progenie di cellule staminali mesenchimali.

Fonti di cellule staminali mesenchimali

La principale fonte di cellule staminali mesenchimali è cellule staminali ematopoietiche del midollo osseo, che nei mammiferi è costantemente si differenziano in cellule del sangue e del sistema immunitario, mentre le cellule staminali mesenchimali presentati piccole popolazioni di cellule stromali del midollo osseo fibroblasti-like e aiutano a mantenere lo stato indifferenziato delle cellule staminali ematopoietiche. In determinate condizioni, le cellule staminali mesenchimali si differenziano in cellule di tessuto cartilaginoso e osseo. Quando piastrate su un terreno di coltura in cellule mononucleate del midollo osseo stromali bassa densità di impianto formare colonie di cellule aderenti, che, di fatto, sono fibroblasti cellule precursori mesenchimali multipotenti. Alcuni autori hanno suggerito che il midollo osseo depositato cellule staminali mesenchimali non impegnati, che, grazie alla capacità di auto-rinnovano e potenziali elevata differenziazione, offrono tutti i tessuti del corpo predecessori cellule mesenchimali stromali tutta organismo mammifero vita.

Nel midollo osseo, gli elementi delle cellule stromali formano una rete che riempie lo spazio tra sinusoidi e tessuto osseo. Il contenuto di MSC dormiente nel midollo osseo di un adulto è paragonabile al numero di cellule staminali ematopoietiche e non supera lo 0,01-0,001%. Le cellule staminali mesenchimali isolate dal midollo osseo e non sottoposte a coltivazione sono prive di molecole adesive. Tali MSC non esprimono CD34, ICAM, VCAM, collagene di tipo I e III, CD44 e CD29. Pertanto, in vitro cellule staminali mesenchimali non sono fissati sul substrato coltura, e le cellule staminali mesenchimali progenitrici derivate più avanzati, si sono formati i componenti del citoscheletro ed apparecchi recettore di molecole di adesione cellulare. Le cellule stromali con il fenotipo CD34 si trovano anche nel sangue periferico, sebbene siano molto meno nel midollo osseo rispetto alle cellule mononucleate CD34-positive. Le cellule CD34 isolate dal sangue e trasferite nella coltura si attaccano al substrato e formano colonie di cellule simili ai fibroblasti.

È noto che nel periodo embrionale la base stromale di tutti gli organi e tessuti dei mammiferi e degli esseri umani proviene da un pool comune di cellule staminali mesenchimali prima e nella fase di organogenesi. Pertanto, si ritiene che in un organismo maturo, la maggior parte delle cellule staminali mesenchimali dovrebbe essere in tessuto connettivo e osseo. È stato stabilito che la maggior parte degli elementi cellulari dello stroma di tessuto connettivo e osseo sciolto sono rappresentati da cellule progenitrici impegnate, che, tuttavia, mantengono la capacità di proliferare e formare cloni in vitro. Con l'introduzione di tali cellule nel flusso sanguigno totale, oltre il 20% delle cellule progenitrici mesenchimali vengono impiantate tra gli elementi stromali del tessuto ematopoietico e degli organi parenchimali.

Una fonte potenziale di cellule staminali mesenchimali è tessuto adiposo, tra cui cellule staminali impegnati trovati in vari gradi di progenitori di adipociti. Elementi progenitrici almeno maturi del tessuto adiposo - cellule stromali-vascolare, che è lo stesso di multipotenti progenitori mesenchimali del midollo osseo possono differenziarsi in adipociti sotto l'azione di glucocorticoidi, il fattore di crescita insulino-simile e l'insulina. Nella coltura di cellule stromali vascolari differenziarsi in adipociti e condrociti e cellule derivate dal midollo adiposo tessuto osseo stanno formando adipociti e osteoblasti.

Nei muscoli sono state trovate anche fonti di radici stromali. Nella coltura primaria di cellule isolate da muscoli scheletrici umani, vengono rilevate cellule di forma stellare e miotubi multinucleati. In presenza di cellule stellate siero di cavallo proliferare in vitro senza segni di citodifferenziazione e dopo l'aggiunta di desametasone al mezzo di coltura di differenziazione è caratterizzata dalla comparsa di cellule elementi cellulari con il fenotipo del muscolo scheletrico e liscio, ossa, cartilagine e tessuto adiposo. Di conseguenza, entrambe le cellule progenitrici mesenchimali multipotenti impegnate e non impegnate sono presenti nel tessuto muscolare umano. Si dimostra che una popolazione di cellule progenitrici presenti nel muscolo scheletrico viene da cellule non impegnati multipotenti mesenchimali del midollo osseo progenitrici, e si differenzia da cellule satelliti miogeniche.

Nel miocardio di ratti neonati trovato anche cellule stellate adesive in base alla sua potenziale differenziazione delle cellule mesenchimali progenitrici multipotenti, come sotto l'influenza di desametasone si differenziano in adipociti, osteoblasti, condrociti, cellule muscolari lisce, miotubi del muscolo scheletrico e miociti cardiaci. E 'stato dimostrato che le cellule muscolari lisce vascolari (periciti) sono derivati multipotenti indifferenziata cellule precursori mesenchimali perivascolare. Nella coltura di cellule staminali mesenchimali perivascolari esprimere a-actina del muscolo liscio e derivato dalle piastrine recettore del fattore di crescita e sono in grado di differenziare le cellule muscolari lisce almeno.

Un posto speciale in termini di riserve staminali prende cartilagine, molto basso potenziale riparativo delle quali si ritiene sia dovuta a carenza di cellule mesenchimali progenitrici multipotenti o fattori di differenziazione e di crescita. Si presume che le cellule progenitrici mesenchimali multipotenti pre-donate alla condro- e osteogenesi entrino nel tessuto cartilagineo da altre fonti di tessuto.

Anche l'origine del tessuto e le condizioni per la commissione delle cellule progenitrici mesenchimali nei tendini non sono stabilite. Osservazioni Ekspermentalnye suggeriscono che nei primi mesi dopo la nascita le cellule del tendine di Achille di coniglio in colture primarie nel primo passaggio e mantenere l'espressione di collagene di tipo I e decorin, ma su ulteriore coltura perdono tenotsitov marcatori di differenziazione.

Va osservato che la risposta alla domanda se effettivamente localizzata in vari tessuti di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti sono sempre presenti nel loro stroma, o piscina tissutale di cellule staminali mesenchimali è compensata dalla migrazione di cellule staminali stromali del midollo osseo, che è ancora in attesa.

Oltre al midollo osseo e altre zone del tessuto mesenchimale di un organismo adulto, un'altra fonte di MSC può essere il sangue del cordone ombelicale. E 'stato dimostrato che il sangue del cordone ombelicale vena contiene cellule che hanno caratteristiche morfologiche e antigeniche simili con cellule progenitrici mesenchimali multipotenti sono capaci di adesione, e non inferiore multipotenti cellule mesenchimali progenitrici di origine midollare da potenziale differenziazione. In colture di cellule staminali mesenchimali del sangue del cordone ombelicale identificati dal 5 al 10% non impegnati progenitori mesenchimali multipotenti. Si è scoperto che il loro numero nel sangue del cordone è inversamente proporzionale all'età gestazionale, che è una prova indiretta della migrazione delle cellule progenitrici multipotenti mesenchimali in vari tessuti durante lo sviluppo fetale. C'erano prime informazioni circa l'applicazione clinica delle cellule staminali mesenchimali isolate da sangue di cordone ombelicale, nonché embrionale derivato biomateriale, che si basa sulla capacità noto di cellule staminali embrionali integrare e funzione prizhivlyatsya in organi e tessuti sistemi riceventi adulti.

La ricerca di nuove fonti di cellule staminali mesenchimali

L'uso di cellule staminali mesenchimali di origine embrionale, come altre cellule fetali, crea una serie di problemi etici, legali, legali e legislativi. Pertanto, la ricerca di materiale donatore cellulare extraembrionale continua. Tentativo non ebbe successo applicazione clinica di fibroblasti cutanei umani, è stato determinato non solo dalla elevata capacità finanziaria della tecnologia, ma anche una rapida differenziazione dei fibrociti in fibroblasti che hanno significativamente meno potenziale proliferazione e la produzione di un numero limitato di fattori di crescita. Ulteriori progressi nello studio della biologia della MSK e dei precursori del midollo osseo mesenchimale multipotente hanno permesso lo sviluppo di una strategia per l'uso clinico delle cellule staminali mesenchimali autologhe. La tecnologia del loro isolamento, coltivazione, riproduzione ex vivo e differenziazione diretta richiedevano, prima di tutto, lo studio dello spettro dei marcatori molecolari delle MSC. La loro analisi ha mostrato che nelle colture primarie del tessuto osseo umano esistono diversi tipi di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti. Il fenotipo pro-osteoblasto è stato trovato in cellule che esprimono un marcatore di cellule staminali stromali STRO-1, ma non recanti un marcatore di osteoblasti - fosfatasi alcalina. Tali cellule sono caratterizzate da una bassa capacità di formare una matrice ossea mineralizzata, nonché dall'assenza di espressione di osteopontina e del recettore dell'ormone paratiroideo. Derivati di cellule STRO-1-positive che non esprimono fosfatasi alcalina sono rappresentati da osteoblasti intermedi e completamente differenziati. È stabilito che gli elementi cellulari delle linee clonate di cellule STRO-1-positive delle ossa trabecolari umane sono in grado di differenziarsi in osteociti e adipociti maturi. La differenziazione direzione di queste cellule dipende dalla esposizione di acidi grassi polinsaturi, citochine proinfiammatorie - IL-1b e del fattore di necrosi tumorale a (TNF-a), così come anti-infiammatori e immunosoppressiva TGF-b.

Successivamente si è riscontrato che multipotenti cellule precursori mesenchimali mancano specifico solo a loro fenotipo intrinseca, ma esprimono marcatori complesse, caratteristici per mesenchimali, cellule endoteliali, cellule epiteliali e muscolari in assenza di espressione di cellule ematopoietiche antigeni immunofenotipiche - CD45, CD34 e CD14. Inoltre, le cellule staminali mesenchimali e costitutivamente inducibile producono ematopoietiche e fattori di crescita non emopoietici, interleuchine, e chemochine, ed in cellule precursori mesenchimali multipotenti espresse recettori per alcuni fattori di crescita e citochine. Tra le cellule stromali basi del corpo umano trovate cellule dormantnye o di riposo con immunofenotipo, quasi identico al profilo antigenico delle cellule mesenchimali progenitrici multipotenti 5-fluorouracile prime - quelli e di altre cellule esprimono CD117, la marcatura "adulto" cellule staminali.

Pertanto, un marcatore cellulare unico per le cellule staminali mesenchimali non è stato ancora stabilito. Si presume che cellule quiescenti sono popolazioni impegnate delle cellule precursori mesenchimali multipotenti poiché non esprimono marcatori di cellule di impegno a osteoartrite (CBFA-1) o adipogenesis (PPAR-y-2). L'esposizione prolungata delle cellule di riposo lentamente proliferanti al siero fetale del vitello porta alla formazione di precursori differenziati terminalmente, caratterizzati da una rapida crescita. La crescita clonale di tali cellule mesenchimali staminali è supportata da FGF2. Sembra che le cellule staminali stromali del genoma di derivazione "chiuso" abbastanza stretto è stata riportata per l'assenza di differenziazione spontanea in MSC -. Senza condizioni speciali per commettere il anche loro non sono convertiti in cellule mesenchimali della serie.

Per studiare la struttura della popolazione derivata mesenchimali staminali vengono cercati proteine marker di differenziazione delle linee cellulari stromali e colture primarie. Nelle cellule di midollo osseo di saggio colonia clonali in vitro trovato che quando sottoposto a colture primarie di EGF aumenta la dimensione media delle colonie e riduce espressione clonale di fosfatasi alcalina, mentre l'aggiunta di idrocortisone attiva espressione di fosfatasi alcalina che è un marker di differenziazione osteogenico dell'orientamento MSC. Anticorpi monoclonali contro STRO-1 hanno consentito di separare e popolazioni di studio di cellule aderenti STRO-1-positivi in un sistema eterogeneo culture Dexter. Lo spettro di citochine non regolare solo la proliferazione e differenziazione delle cellule ematopoietiche e linfoidi, ma anche partecipare alla formazione, la formazione e il riassorbimento del tessuto scheletrico da para, automatica e meccanismi endocrini. Rilascio mediata dal recettore di messaggeri secondari come cAMP, diacilglicerolo, inositolo trifosfato e Ca2 + vengono utilizzati anche per l'analisi marcatore di diverse categorie di tessuti stromali di cellule esprimenti i recettori pertinenti. L'uso di anticorpi monoclonali come marcatori permesso di stabilire stromali organi linfoidi appartenenti cellule reticolari per T e le zone B-dipendenti.

Per un po 'di tempo le dispute scientifiche continuarono intorno alla questione della possibilità di origine della MSC dalla cellula staminale ematopoietica. Infatti, con l'espianto della sospensione delle cellule del midollo osseo in colture monostrato, crescono in essi colonie discrete di fibroblasti. Tuttavia, è stato dimostrato che la presenza di precursori di colonie di fibroblasti e vari germi differenziazione di tessuto emopoietico come parte del midollo osseo non è la prova della comune origine delle cellule staminali ematopoietiche. Utilizzando l'analisi discriminante di cellule staminali del midollo osseo trovato che il microambiente a trapianto eterotopico, cellule ematopoietiche del midollo osseo viene trasferito, che dimostra l'esistenza, nel midollo osseo indipendente della popolazione MSC istogenetico di cellule ematopoietiche.

Inoltre, il metodo di clonazione selettiva rivelato in colture monostrato di cellule stromali del midollo osseo di una nuova categoria di cellule precursori per determinare il loro numero, per studiare le loro proprietà, potenziale proliferativo e differenziazione. Si è scoperto che le cellule stromali fibroblastiche in vitro proliferano e formano colonie diploidi, che, con il ritorno del trapianto nel corpo, forniscono la formazione di nuovi organi ematopoietici. I risultati degli studi dei singoli cloni indicano che v'è una popolazione di cellule nella loro proliferazione e differenziazione potenziale in grado di rivendicare il ruolo delle cellule staminali del tessuto stromale, Gistogeneticheskaja indipendenti di cellule staminali ematopoietiche nelle cellule stromali progenitrici. Le cellule di questa popolazione sono caratterizzate da crescita autosufficiente e si differenziano in cellule progenitrici di tessuto osseo, cartilagineo e reticolare del midollo osseo.

Di grande interesse sono i risultati di studi Chailakhyan R. Et al (1997-2001), che erano osso coltivate derivate dal midollo stromale cellule progenitrici conigli, cavie, topi e di a-MEM terreno di coltura addizionato con siero fetale di vitello. Gli autori hanno effettuato l'espianto con una densità iniziale di 2-4 x 103 cellule del midollo osseo per 1 cm2. Come alimentatore, sono state utilizzate cellule del midollo osseo inattivate omogenee o eterologhe in una dose che manteneva l'azione dell'alimentatore ma bloccava completamente la loro proliferazione. Colonie discrete primarie di due settimane di fibroblasti furono tripsinizzate per produrre ceppi monoclonali. Evidence colonie di origine clonale sono stati ottenuti utilizzando marcatori cromosomiche in colture miste di midollo osseo di maschile e femminile d'India suini, colture vive di ripresa time-lapse, così come in colture miste di midollo osseo di topi singenici e CBA SVAT6T6. Trapianto sospensione di cellule del midollo osseo appena isolate coltivate in vitro fibroblasti o stromali sotto la capsula renale è stata condotta in ivalonovyh scaffold porosi o gelatina, nonché matrice spongiosa inattivato coniglio. Cloni Trapianto nel coperchio osso porcellino d'India cosce puliti da tessuti molli e periostio, tagliare l'epifisi e completamente lavando loro midollo osseo. L'osso è stato tagliato in frammenti (3-5 mm), essiccato e irradiato ad una dose di 60 Gy. Nelle coperture ossee, singole colonie di fibroblasti sono state collocate e impiantate per via intramuscolare. Per il trapianto intraperitoneale dei fibroblasti stromali, coltivate in vitro, abbiamo usato tipi Una camera di diffusione (V = 0015 centimetri 3, h = 0, l mm) e D (V = 0,15 cm 3, h = 2 mm).

Quando si studiano le dinamiche di crescita di ceppi clonali Chailakhyan R. Et al (2001) hanno trovato che le singole celle, formanti colonie fibroblasti, così come i loro discendenti hanno un grande potenziale proliferativo. Con il decimo passaggio, il numero di fibroblasti in alcuni ceppi era di 1,2-7,2 x 10 ⁹ cellule. Nel processo del loro sviluppo, hanno eseguito fino a 31-34 duplicazioni di celle. Trapianto eterotopico quindi di ceppi derivate dal midollo osseo formate da precursori stromali diverse decine di cloni hanno portato al trasferimento del microambiente midollare e istruzione nei nuovi trapianto ematopoietico zona. Gli autori hanno sollevato la questione se i singoli cloni possono tollerare le cellule stromali del midollo osseo microambiente, o richiede la collaborazione di molti diversi progenitore stromale clonogenica? E se i singoli cloni saranno in grado di trasferire il microambiente, se è pieno di tutti e tre di sangue germe, o diversi cloni di fornire la formazione del microambiente ematopoietico per i diversi germi? Per affrontare questi problemi è stata sviluppata la tecnologia delle cellule progenitrici coltivazione stromali nel gel di collagene che permette di scattare dalla superficie dei fibroblasti colonie ad essere trapiantate eterotopico coltivate. Cloni individuali fibroblasti stromali, cellule del midollo osseo derivate da topi CBA e porcellini d'India, tagliati con un frammento del gel coat e eterotopico trapiantato - sotto la capsula renale di topi singenici o autologhi cavie ventre muscolare. Durante il trapianto nel muscolo, le colonie sul gel sono state collocate nelle coperture ossee.

Abbiamo scoperto che per 50-90 giorni dopo il trapianto di midollo osseo fibroblasti colonia nel 20% dei casi sono stati osservati nello sviluppo di osso o di osso e tessuto emopoietico zona trapianto. In 5% degli animali riceventi tasche di osso avente una cavità riempita di midollo osseo formato. All'interno dei cilindri ossei tali focolai hanno una forma arrotondata e una capsula costruita del tessuto osseo, con osteociti e strato osteoblastica ben sviluppato. Cavità del midollo osseo contiene tessuto reticolare con cellule mieloidi e eritroidi, le proporzioni dei quali non differiscono da quella del midollo osseo normale. Il rigetto di rene è un organo midollare tipico formato da trapianto di midollo osseo nativo, dove capsula osso copre soltanto la cavità midollare dalla capsula renale. Il tessuto incappucciato includeva elementi mieloidi, eritroidi e megacariocitici. Lo stroma della cavità midollare aveva un sistema sinusoidale ben sviluppato e conteneva cellule grasse tipiche. Allo stesso tempo, nella zona di trapianto di alcune colonie di ossa senza segni di emopoiesi è stato trovato sotto la capsula renale. Studio della proliferativa e differenziazione potenza dei singoli cloni sono stati proseguiti su ceppi midollo coniglio osso monoclonali, le cellule sono risospese in terreno di coltura e in una spugna ivalonovoy separato pesatura 1-2 mg infilato sotto la capsula renale del donatore di midollo osseo coniglio. Tale autotrapianto è stato sottoposto alle cellule di 21 ceppi monoclonali. I risultati sono stati presi in considerazione in 2-3 mesi. Gli autori hanno trovato che il 14% del midollo osseo ceppi monoclonali trapiantate corpo formato composto della cavità dell'osso e del midollo osseo riempito di cellule ematopoietiche. Nel 33% dei casi ceppi trapiantati formate osso compatto con cavità diverse dimensioni ostootsitami murate osteoblastica e strato sviluppata. In alcuni casi, spugne trapiantati cloni sviluppati reticolo senza osso o di cellule ematopoietiche. Talvolta formazione stroma reticolare è verificato con una ben sviluppata rete di sinusoidi, ma non popolato le cellule ematopoietiche. Pertanto, i risultati ottenuti erano simili a quelli ottenuti nel trapianto di cloni su un gel di collagene. Tuttavia, se il trapianto cloni cresciuto sul substrato portato alla formazione di tessuto osseo è 5% del midollo - 15% e il tessuto reticolare - nel 80% dei casi, il monoclonale trapianto ceppi formazione di cellule del midollo osseo è stata osservata nel 14% dei casi di osso - nel 53% e reticolare - nel 53% dei casi. Secondo gli autori, questo indica che le condizioni per l'attuazione dei potenziali proliferative e differenziazione dei fibroblasti stromali quando trapiantate scaffold porosi erano più ottimale che con i loro trapianti di midollo e copre il substrato collagene. Non è escluso che l'uso di metodi più avanzati di coltivazione e il trapianto di feedback cloni in grado di migliorare le condizioni per l'attuazione dei suoi cloni potenzialità di differenziazione e modificare questi rapporti. Un modo o nell'altro, ma il valore principale della ricerca sta nel fatto che alcuni dei cloni cellule stromali capaci di formare tessuto osseo garantendo stromale microambiente ematopoietico immediatamente per tre germogli di sangue midollo osseo: eritroide, mieloide e megacariocitica, creando un grande abbastanza appigli tessuti ematopoietici e un po 'di massa ossea.

Inoltre, gli autori hanno risolto il problema della capacità di questi tipi di differenziazione cellulare delle cellule progenitrici stromali clonali individuali in condizioni di un sistema chiuso di camere di diffusione. Inoltre, è stato necessario determinare se i singoli cloni di mostre pluripotenti o visualizzazione per potenziale differenziare richiede l'interazione cooperativa di diversi cloni con un segno citodifferenziazione fissa, rapporto differente che determina la formazione preferenziale di osso, cartilagine o reticolare. Combinando due approcci metodologici - monoclonale isolare cellule progenitrici stromali del midollo osseo e trapiantare nelle camere di diffusione, Chailakhyan R. Et al (2001) ha ottenuto risultati che hanno permesso di avvicinarsi alla comprensione dell'organizzazione strutturale dello stroma del midollo osseo. Trapianto ceppi monoclonali cellule progenitrici in cellule stromali tipo O portato alla formazione sia tessuto osseo e la cartilagine, dimostrando la capacità di progenie di uno cellule stromali formanti colonie formano simultaneamente osso e cartilagine. L'ipotesi che il tessuto osseo e cartilagineo provenga dalla comune cellula progenitrice stromale è stata ripetutamente espressa ripetutamente. Tuttavia, questa ipotesi non ha avuto una conferma sperimentale corretta. Formazione delle ossa e cartilagine in camere di diffusione sia necessario provare l'esistenza di cellule staminali includono cellule stromali del midollo precursori ossei comuni a questi due tipi di tessuto.

Quindi, 29 ceppi clonali del secondo e terzo passaggio ottenuti dalle colture primarie del midollo del coniglio sono stati collocati in camere di diffusione e impiantati per via intraperitoneale con animali omologhi. Gli studi hanno dimostrato che il 45% dei ceppi monoclonali del midollo osseo hanno potenze osteogeniche. Eccezionalmente, il tessuto reticolare conteneva 9 camere, ma insieme a tessuto osseo e cartilagineo era presente in altre 13 camere, che rappresentavano il 76% di tutti i ceppi. In camere di tipo O, dove era possibile differenziare sia il tessuto osseo che cartilagineo, sono stati studiati 16 ceppi. In quattro camere (25%), si formavano sia tessuto osseo che cartilagineo. Va ancora notato che gli studi Chailakhyan R. Et al (2001) singole cellule progenitrici sottoposti ceppo cellulare comprendono da 31 a 34 raddoppi, e la loro progenie era 0.9-2.0 x 10 ⁹ cellule. Il numero di mitosi a cui erano esposte le cellule precursori dei ceppi policlonali era praticamente uguale a quello delle cellule dei ceppi monoclonali. Allo stesso tempo, il tasso di sviluppo dei ceppi policlonali, specialmente nella prima fase della loro formazione, dipendeva in misura considerevole dal numero di colonie utilizzate per l'iniziazione dei ceppi. I ceppi diploidi di fibroblasti embrionali umani (WI-38) quando riformati a 12-15 livelli di duplicazione formano anche colonie che differiscono per diametro e contenuto di cellule in esse. Le grandi colonie contenenti più di 103 cellule erano solo del 5-10%. Con l'aumento del numero di divisioni, la percentuale di grandi colonie è diminuita. I ceppi di fibroblasti stromali del midollo osseo mono- e policlonali mantenuto un cromosoma diploide set dopo 20 o più raddoppi, e la tendenza di sviluppo era paragonabile alla dinamica dei ceppi diploidi fibroblasti embrionali. L'analisi del potenziale di differenziazione delle singole cellule progenitrici stromali del midollo osseo, effettuata trapiantando ceppi monoclonali in camere di diffusione, ha mostrato che metà di esse sono osteogeniche. Le grandi colonie rappresentavano il 10% del loro numero totale. Di conseguenza, il numero di cellule osteogeniche che formano le colonie corrispondeva a circa il 5% della loro popolazione totale. Nella massa totale delle cellule progenitrici osteogeniche identificate dagli autori, c'erano cellule capaci di formare contemporaneamente tessuto osseo e cartilagineo. Per la prima volta ha trovato che per questi due tipi di tessuti dell'organismo adulto è la cellula precursore comune: il 25% dei cloni testati sono stati creati da cellule simili, e il loro numero nella popolazione generale di cellule progenitrici non era inferiore al 2,5%.

Pertanto, il trapianto eterotopico di singoli cloni di fibroblasti del midollo osseo ha aperto nuovi aspetti dell'organizzazione strutturale della popolazione delle cellule progenitrici mesenchimali. Cellule stromali progenitrici trovati in grado di trasferire microambiente specifico immediatamente per tutti staminali emopoietiche quale numero tra i cloni indagati grandi su diversi modelli è dal 5 al 15% (0,5-1,5% del numero totale di cellule progenitrici rilevato). Insieme con i cloni, trasferimento completo microambiente midollare, ci sono cellule progenitrici, deterministici solo per la formazione ossea, che si formano quando trasferito ad un sistema aperto, l'osso che non supporta lo sviluppo di ematopoiesi. Il loro numero dal numero totale di cellule progenitrici è 1,5-3%. Alcune di queste cellule possono formare tessuto osseo con un periodo limitato di auto-manutenzione. Di conseguenza, la popolazione delle cellule progenitrici stromali è eterogenea nel suo potenziale di differenziazione. Tra questi v'è una categoria cellulare, rivendicando il ruolo delle cellule staminali stromali capaci di differenziarsi in tre dimensioni insite nel tessuto stromali del midollo osseo, formando osso, cartilagine e tessuto reticolare. Questi dati ci permettono di sperare che con l'aiuto di vari marcatori di cellule sarà possibile determinare il contributo di ciascun tipo di cellule stromali nel microambiente della specifica organizzazione e sostenere emopoiesi nelle culture Dexter.

Caratteristiche delle cellule staminali mesenchimali

Negli ultimi anni, si trovò che nelle culture stazionari di midollo osseo mesenchimali cellule progenitrici multipotenti presentato una popolazione limitata di piccole cellule agranular cellule (RS-1), caratterizzato da una bassa capacità di colonizzazione e l'assenza di Ki-67 espressione antigene specifico per cellule proliferanti. Parametri antigeniche dormantnyh cellule RS-1 sono differente dallo spettro di antigeni commessi rapida proliferazione delle cellule stromali progenitrici. Si è riscontrato che un alto tasso di proliferazione di cellule progenitrici impegnate è stato osservato solo in presenza di cellule RS-1. A loro volta, le cellule RS-1 aumenta il tasso di crescita sotto l'influenza di fattori secreti dalle cellule progenitrici multipotenti mesenchimali derivate più maturi. Sembra che le celle RS-1 siano una sottoclasse di MSC non compatibili che sono in grado di riciclare. In resistenti al 5-fluorouracile cellule stromali progenitrici del midollo osseo caratterizzata da un basso contenuto di RNA e alti livelli di espressione di gene decarbossilasi vitro - marcatore cellule non proliferanti.

La riproduzione intensiva delle cellule progenitrici stromali inizia dopo la fissazione sul substrato. Quando questo profilo è espressa marcatore di cellule scarsamente differenziate: SH2 (TGF- recettore (3), SH3 (proteina di segnalazione dominio), collagene di tipo I e III, fibronectina, recettore di adesione VCAM-1 (CD106) e ICAM (CD54), caderina-11 , CD44, CD71 (recettore della transferrina), CD90, CD120a e CD124, ma senza espressione di marcatori caratteristici di cellule staminali ematopoietiche (CD34, CD14, CD45). Crescita clonale consente ripetutamente diversi passaggi cellule staminali mesenchimali per produrre una cultura di molti geneticamente omogenea pluripotenti stromale progenitore le cellule. Cerea 2-3 passaggio del loro numero raggiunge 50-300 milione. Nella cultura sufficiente densità dopo l'arresto della proliferazione delle cellule stromali progenitrici, a differenza fibroblasti tissutali ematopoietiche si differenziano in adipociti, miociti, cellule della cartilagine e tessuto osseo. La combinazione dei segnali regolatori tre differenziazione comprendente 1-metil-izobutilksantin (induttore di formazione cAMP intracellulare), desametasone (un inibitore di fosfolipasi a e C) e indometacina (un inibitore della cicloossigenasi, trombossano attività abbassamento e) si trasforma in adipociti e cellule mesenchimali progenitrici del 95%. Formazione degli adipociti da cellule stromali immature confermato espressione del gene lipoproteina lipasi, identificazione istochimiche delle apolipoproteine e recettori peroxysomal. Le cellule dello stesso clone influenzato dal TGF-b in mezzo privo di siero crea una popolazione omogenea di condrociti. La coltura cellulare multistrato di matrice extracellulare cartilaginea è caratterizzato sviluppata che consiste di proteoglicani e collagene di tipo II. Il mezzo nutritivo con complesso di 10% di siero fetale segnali effetto di differenziazione costituito da b-glicerofosfato (donatore di fosfato inorganico), acido ascorbico e desametasone, nelle stesse cellule progenitrici progenitrici coltura stromali porta alla formazione di aggregati di cellule. In tali cellule, v'è un progressivo aumento nell'attività di livelli di fosfatasi alcalina e osteopontina, indicando la formazione di mineralizzazione dell'osso che le cellule hanno confermato un progressivo aumento del calcio intracellulare.

Secondo alcuni, la capacità delle cellule staminali mesenchimali per dividere indefinitamente e riproduzione di vari tipi di cellule della linea mesenchimali in combinazione con un elevato grado di plasticità. Quando somministrato nei ventricoli, o le cellule staminali mesenchimali della sostanza bianca migrare nel parenchima del tessuto nervoso e differenziarsi in neuronale o gliale derivato linea cellulare. Inoltre, vi sono informazioni sul MSC transdifferenziazione in cellule staminali ematopoietiche sia in vitro e in vivo. Un'analisi più approfondita in alcuni studi determinate eccezionalmente elevata duttilità delle MSC, che si manifesta nella loro capacità di differenziarsi in astrociti, oligodendrociti, neuroni, cardiomiociti, cellule muscolari lisce e cellule muscolari scheletriche. In un certo numero di studi transdifferentsirovochnogo potenziale delle MSC in vitro e in vivo trovato che multipotenti cellule mesenchimali precursori di origine midollare terminalmente differenziarsi in linee cellulari che formano osso, cartilagine, muscolo, nervi e tessuto adiposo, nonché tendini e lo stroma che supporta ematopoiesi .

Tuttavia, in altri studi, segni di restrizione pluripotenza genoma di cellule staminali mesenchimali e potrebbero non essere rilevati popolazioni di cellule stromali progenitrici, ma per verificare eventuali cellule pluripotenti stromali stato studiato più di 200 cloni MSC isolate da una coltura primaria. La stragrande maggioranza dei cloni vitro in manteneva la capacità di differenziarsi in osteogenico, condrogenica e direzioni adipogenici. Escludendo la probabilità di migrazione delle cellule riceventi da trapianto di cellule staminali mesenchimali sotto la capsula renale o in camere di diffusione sembrava che le cellule stromali progenitrici in situ mantengono fenotipo eterogeneo, che indica l'assenza di un trapianto zona fattori di restrizione o l'assenza dei soli MSC pluripotenti. Allo stesso tempo, ha permesso l'esistenza di un raro tipo di cellule staminali pluripotenti somatiche, che sono precursori comuni di cellule staminali adulte.

Sulle cellule staminali mesenchimali pluripotenti multi, ma non vero costituiscono una piccola frazione di cellule di midollo osseo e sono in grado, in determinate circostanze, quando coltivate in vitro proliferare senza entrare in differenziazione, come dimostra il loro impegno lignaggio indotta di cellule in osso, cartilagine, grasso, tessuto muscolare , così come nei tenociti e negli elementi stromali che supportano l'emopoiesi. Tipicamente, l'esposizione continua in terreno di coltura con siero fetale di vitello provoca MSC uscita in stromali di cellule progenitrici impegnati, la progenie di differenziazione che subisce finale spontanea. In vitro possibile ottenere la formazione di osteoblasti direzionale aggiungendo all'acido condizionata desametasone medio, ß-glicerofosfato e ascorbico, mentre la combinazione di differenziazione segnali desametasone e insulina induce la formazione di adipociti.

Stabilito che prima di entrare nella fase di differenziazione terminale di midollo osseo MSC creare determinate condizioni di coltura inizialmente differenziarsi in cellule staminali mesenchimali fibroblasto-simili. I derivati di queste cellule in vivo sono coinvolti nella formazione di osso, cartilagine, tendini, grasso e il tessuto muscolare così come il supporto stromale emopoiesi. Molti autori comprendere il termine "cellule progenitrici mesenchimali multipotenti", come in realtà MSC, e le cellule stromali progenitrici impegnati e tessuti mesenchimali del midollo osseo. Analisi clonale delle cellule progenitrici mesenchimali multipotenti di origine midollare mostrato che poco più di un terzo dei cloni differenziati in osteo, hondro- e adipociti, mentre le cellule altri cloni hanno osteogenico potenziale e un modulo solo hondro- e osteociti. Questo clone di cellule precursori mesenchimali multipotenti come IUD-9, in condizioni appropriate microambiente differenziate in cellule con fenotipo e funzionali caratteristiche non solo di osteoblasti, condrociti e potsitov adic ma cellule stromali che supportano ematopoiesi. Isolate dalle cellule del midollo osseo di ratto fetale clone RCJ3.1 differenziate cellule mesenchimali di diversi fenotipi. Con l'azione combinata di acido ascorbico, b-glicerofosfato, desametasone e da elementi cellulari di questo clone viene dapprima formata miociti multinucleate e quindi, successivamente, adipociti, condrociti e isolotti osso mineralizzato. La popolazione di cellule granulari del periostio di feti di ratto corrisponde alle cellule progenitrici mesenchimali multipotenti non impegnati, come caratterizzato da un basso tasso di proliferazione, non esprime marcatori di differenziazione e differenziate in condizioni di coltura per formare hondro-, osteo e adipociti e le cellule muscolari lisce.

Pertanto, si dovrebbe riconoscere che la questione del genoma plyuri- o multipotenza delle cellule staminali mesenchimali è ancora aperta, che colpisce conseguentemente la presentazione del potenziale di differenziazione di cellule progenitrici stromali, che è anche non completamente installato.

Sperimentalmente provata e importante caratteristica delle cellule staminali mesenchimali è la loro capacità di lasciare la nicchia tissutale e far circolare nella circolazione generale. Per attivare il programma genetico di differenziazione, tali cellule staminali circolanti dovrebbero cadere nel microambiente appropriato. E 'dimostrato che, quando somministrato per via sistemica al flusso sanguigno animali recipienti MSC immaturi cellule impiantate in diversi organi e tessuti, poi differenziato in sangue cellule, miociti, adipociti, condrociti e fibroblasti. Di conseguenza, nelle zone locali tissutali verifica interazione segnale regolamentazione di cellule stromali progenitrici committed e non, nonché tra loro e le circostanti cellule mature. Si presume che l'induzione differenziazione avviene fattori paracrini regolatori di origine mesenchimale e nemezenhimalnogo (fattori di crescita, eicosanoidi, molecole della matrice extracellulare) che prevedono le relazioni spaziali e temporali nel microambiente di progenitori mesenchimali multipotenti. Pertanto, danno locale del tessuto mesenchimale dovrebbe portare alla formazione di un microambiente zone multipotenti cellule precursori mesenchimali si differenziano qualitativamente dai segnali regolatori complessi tessuti intatti in cui i processi fisiologici avvengono invece di rigenerazione riparativa. Questa differenza è estremamente importante in termini di specializzazione del fenotipo cellulare in un microambiente normale e dannoso.

Secondo le idee, è qui che vengono posti i meccanismi della differenza fondamentale di due processi noti - la rigenerazione fisiologica e la proliferazione infiammatoria. Il primo termina con il ripristino della composizione specialistica del tessuto cellulare e la sua funzione, mentre il risultato del processo di proliferazione è la formazione di elementi del tessuto connettivo maturo e la perdita della funzione della zona del tessuto danneggiata. Pertanto, per lo sviluppo di programmi ottimali per l'uso di cellule progenitrici mesenchimali multipotenti in medicina rigenerativa-plastica, è necessario un attento studio delle caratteristiche dell'influenza dei fattori microambiente sulla differenziazione delle MSC.

Dipendenza della struttura del compartimento delle cellule staminali sui regolatori cellulari para- e autocrini, la cui espressione è modulata da segnali esterni, nessuno dubita. Tra le funzioni dei fattori regolatori, le più importanti sono il controllo della divisione asimmetrica delle MSC e l'espressione dei geni che determinano le fasi della commissione e il numero di divisioni cellulari. I segnali esterni, da cui dipende l'ulteriore sviluppo della MSC, sono forniti dal loro microambiente. In MSC immaturi a proliferare tempo sufficientemente lungo, pur mantenendo la capacità di differenziarsi in linea adipociti, miofibroblasti, tessuto stromale ematogena, cellule della cartilagine e dell'osso. Si è constatato che una popolazione limitata di elementi di cella stromali SB34-negativi circola dalla circolazione generale viene restituito al tessuto stroma del midollo osseo, si trasforma in una linea in cui le cellule staminali ematopoietiche CD34-positive. Queste osservazioni suggeriscono che le cellule mesenchimali ricircolo progenitrici nel sangue del tessuto fornisce il supporto per l'equilibrio delle cellule staminali stromali in diversi organi mobilitando pool comune di cellule stromali del midollo osseo immaturo. La differenziazione delle cellule staminali mesenchimali in cellule con più fenotipi mesenchimali e la loro partecipazione alla riparazione o rigenerazione di ossa, cartilagine, tendini e tessuto adiposo in vivo dimostrato da modelli di trasferimento adottivi negli animali da esperimento. Secondo altri autori, migrazione lontano del letto vascolare MSC è combinato con uno spostamento locale o cellule mesenchimali precursori multipotenti korotkodistantnym all'interno del tessuto alla riparazione della cartilagine, rigenerazione muscolare, e altre reazioni di riduzione.

Riserve locali derivano fondamenta tessuto stromale giocano una fonte ruolo delle cellule in un fisiologici processi di rigenerazione dei tessuti e sono alimentati dalla MSC trasporto lontane come la spesa stromali risorse staminali dei tessuti. Tuttavia, ha bisogno di mobilitazione di emergenza di capacità riparativa cellulare, ad esempio traumi multipli, nei processi riparativi di rigenerazione partecipa MSC intero convoglio, e la periferia attraverso la circolazione sanguigna assunto cellule precursori mesenchimali del midollo osseo.

Trapianto di cellule staminali mesenchimali

Vi sono alcuni paralleli tra i processi di rigenerazione fisiologica dei tessuti e la loro formazione durante il periodo di sviluppo intrauterino. L'embriogenesi degli esseri umani e mammiferi, la formazione di vari tipi di cellule specializzate derivate da ecto, meso e germe endodermico strati piscina, ma con la partecipazione obbligatoria del mesenchima. La rete cellulare libera di tessuto mesenchimale embrionale svolge numerose funzioni regolatorie, metaboliche, scheletriche e morfogenetiche. Organismi provvisori segnalibro è realizzata solo dopo mesenchima condensazione a scapito delle cellule progenitrici crescita clonogenica che generano segnali morfogenetici primario organogenesi. I derivati stromali del mesenchima embrionale creano una struttura cellulare di organi provvisori e formano la base per il loro approvvigionamento energetico futuro attraverso la crescita dei vasi sanguigni e linfatici primari. In altre parole, gli elementi stromali dell'unità microcircolatoria degli organi fetali appaiono prima della formazione delle loro unità strutturali-funzionali. Inoltre, la migrazione attiva delle cellule mesenchimali durante l'organogenesi fornisce l'orientamento spaziale degli organi in via di sviluppo a causa della marcatura dei loro limiti di volume mediante la limitazione dei Noch-Teps omeotici. Sull'impalcatura stromale c'è anche un insieme di unità strutturali e funzionali di organi parenchimatosi, che spesso contengono cellule morfogeneticamente e funzionalmente completamente diverse. Di conseguenza, nell'embriogenesi, le funzioni mesenchimali sono primarie e si realizzano generando segnali regolatori che attivano la proliferazione regionale e la differenziazione delle cellule epiteliali progenitrici. Le cellule mesenchimali embrionali producono fattori di crescita come LEG, HGF-b, CSF, per le quali le cellule progenitrici parenchimali hanno recettori corrispondenti. Nel tessuto maturo differenziato di un organismo adulto, la rete cellulare stromale genera anche segnali per mantenere la vitalità e la proliferazione di cellule progenitrici di origine non mesenchimale. Tuttavia, i spettro stromali segnali regolatori a postnatale ontogenesi altro (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, ecc.) E ha lo scopo di fornire la rigenerazione fisiologica o la riparazione delle zone del tessuto danneggiate. Inoltre, le caratteristiche spettrali dei fattori regolativi stromali in ogni tipo di tessuto e persino all'interno dello stesso organo sono differenti. In particolare, ematopoiesi e linfopoiesi alla moltiplicazione e la differenziazione delle cellule immunocompetenti ematopoietiche e si verifica solo in alcuni organi, all'interno del quale agisce stromale microambiente fornire condizioni per la maturazione delle cellule ematopoietiche e linfoidi. È dai fattori regolatori del microambiente che dipende la capacità delle cellule ematopoietiche e linfoidi di ripopolare questo organo, proliferare e maturare nelle sue nicchie microstrutturali.

Tra i componenti della matrice extracellulare, che producono le cellule mesenchimali precursori multipotenti, va notato fibronectina, laminina, collagene e proteoglicani, così come CD44 (ialuronano e recettore osteopontina) che riceve la parte principale nell'organizzazione dell'interazione intercellulare e la formazione di matrice extracellulare nel midollo osseo e l'osso . E 'dimostrato che il midollo osseo mesenchimali, cellule multipotenti creare redshestvenniki microambiente stromale, fornendo i segnali induttivi e regolatori non solo il MSC, ma anche precursori emopoietici e cellule staminali del midollo nemezenhimalnye ossee. È noto che le MSC implicate nella ematopoiesi misurata dalla loro capacità di differenziarsi in cellule stromali che supportano ematopoiesi, in cui il segnale guida MSK attivo ottenuto direttamente dalle cellule staminali ematopoietiche. Ecco perché la coltura di cellule stromali progenitrici di rete è la base per l'alimentazione di tutti i cloni di cellule ematopoietiche.

In un'intensità organismo maturo di emodialisi e linfopoiesi in uno stato di equilibrio dinamico con la "spesa" di cellule mature del sangue e le cellule del sistema immunitario in periferia. Dato che le cellule stromali del midollo osseo e negli organi linfoidi raramente aggiornati, importanti strutture ristrutturazione stromali non si verifica in loro. Portare il sistema di equilibrio dinamico è possibile con l'aiuto di danneggiamento meccanico eventuali organi Hemo o linfopoiesi, che porta allo stesso tipo di cambiamenti sequenziali che interessano non solo e non tanto di cellule ematopoietiche o linfoidi, come strutture stromali danneggiati organo. Nel processo di rigenerazione riparativo quadro stromale principalmente formato, che poi ripopolare ematopoietiche o cellule immunitarie. Questo fatto rende noto lungo rigenerazione post-traumatica conveniente modello per studiare il microambiente stromale di organi emopoietici. In particolare, per le indagini di rigenerazione riparativa di midollo osseo viene utilizzato meccanica svuotamento cavità midollare delle ossa lunghe - curettage, permettendo di portare rapidamente ed efficacemente il tessuto ematopoietico da uno stato di equilibrio dinamico. Quando si studia il processo di rigenerazione riparativa componenti ematopoietiche e stromali del midollo osseo dopo svuotamento meccanica della cavità midollare cavie tibia trovato che tra gli indicatori rigenerazione delle cellule ematopoietiche e stromali (il numero di cellule ematopoietiche, la concentrazione e la quantità di cellule stromali progenitrici) non v'è alcuna correlazione diretta. Inoltre, si è riscontrato che l'aumento della popolazione di cellule progenitrici stromali si verifica in una data precedente dopo il raschiamento, e stessi fibroblasti stromali sono fosfatazopolozhitelnymi, che è caratteristica del tessuto osteogenico. È stato inoltre stabilito che le curettage 3-5 ossa lunghe porta alla crescita della popolazione di cellule nel midollo osseo e l'osso non operato anche nella milza, che nelle cavie è unico organo linfopoietico.

Morfologiche processi picture riparativi nel midollo osseo kyuretirovannyh tibiali cavie generalmente corrisponde ai dati della letteratura ottenuti in esperimenti su animali di altre specie, la dinamica dei cambiamenti avvenuti dopo la rimozione del tessuto ematopoietico è la stessa per tutte le specie e la differenza riguarda solo i parametri temporali . Morfologicamente procedura fase di ripristino ematopoiesi in cavità midollare viene svuotato in processi successivi organizzazione formazione del coagulo fibra grossolana osso, il suo riassorbimento, di sinusoidi e reticolare stroma formazione, che ulteriormente ripopolamento elementi ematopoietici. Il numero di cellule progenitrici ematopoietiche del midollo osseo processo di rigenerazione tissutale aumenti in parallelo aumento nel contenuto di cellule staminali ematopoietiche.

Gerasimov Yu et al (2001) hanno confrontato le variazioni nel numero di cellule ematopoietiche e la quantità di precursori delle cellule stromali nelle singole fasi del processo di rigenerazione. Si è riscontrato che variazioni quantitative cellule del midollo osseo in kyuretirovannoy osso partite dinamica delle caratteristiche morfologiche rigenerazione. Riduzione durante i primi tre giorni del contenuto delle celle in autori rigenerano attribuiscono la perdita di cellule ematopoietiche causa degli effetti negativi del microambiente, che crea tessuto reticolare cresce nel restante midollo osseo nella epifisi e in quest'ultimo per formare foci osteoide e danno vascolare con curettage. 7-12 ° giorno alzando cellule yaderosoderzhaschih coincide con la comparsa dell'individuo foci di cellule stromali zone proliferazione ematopoietiche mieloidi. Al 20 ° giorno ci sono parti significative del midollo osseo rigenerato e dei seni ben sviluppati, che è accompagnata da un significativo aumento del numero totale di cellule. Tuttavia, il numero di cellule ematopoietiche in questo periodo è stata del 68% dei livelli di controllo. Questo è coerente con i dati precedentemente pubblicati mostrano che il numero di cellule che formano il sangue dopo curettage raggiunge standard soli 35-40 giorni dopo l'operazione.

Nel periodo di fonte primaria post-traumatico presto per la ricostituzione ematopoietiche servire locale conservato elementi cellulari con raschiamento. In termini successivi, la principale fonte di rigenerazione del tessuto emopoietico del midollo osseo sono le cellule staminali, che ripopolano le zone stromali libere. Con riferimento a categorie di cellule stromali (endoteliali, reticolari e osteogenico), le fonti per la loro formazione nella ristrutturazione della cavità midollare, rimangono poco chiari. I risultati di Yu.V. Gerasimova et al (2001) mostrano che nel restante midollo osseo dopo concentrazione cellulare curettage formano colonie fibroblasti significativamente più alto di quello normale midollo osseo. Gli autori ritengono che con curettage è più intenso eluizione selettiva delle cellule ematopoietiche rispetto stromali formanti colonia cellule implicate nella formazione di stroma e più saldamente connessi con la sostanza di base di cellule ematopoietiche.

La dinamica di variazione del numero di cellule formanti colonie fibroblasti correla con l'intensità dei processi osteogenesi successiva trabecolare riassorbimento osseo e formazione reticolare stroma che popolano cellule ematopoietiche. La maggior parte delle cellule progenitrici stromali formano un tessuto osseo a fibre grosse e uno stroma reticolare ai tempi di rigenerazione indicati. Per le fratture di femore in condizioni di osteosintesi prolungata al 5 ° giorno nella zona di rigenerazione aumenta la concentrazione di cellule e il numero di formano colonie fibroblasti, e la formazione di osso in intensiva loro numero è aumentato di 6 volte. È noto che le cellule del midollo osseo che formano colonie di fibroblasti possiedono proprietà osteogeniche. Il numero di cellule progenitrici stromali aumenta prima della colonizzazione dell'area del midollo osseo cortecciato da parte di cellule ematopoietiche. Questo è in buon accordo con l'evidenza che le cellule stromali forniscono la formazione di un microambiente emopoietico. Ovviamente, la creazione di microambiente ematopoietico corrisponde ad un certo livello di rigenerazione di tessuto stromale, e aumenta il numero di cellule ematopoietiche su stromali espansione ponte adatto per ematopoiesi.

Di maggiore interesse sono i dati degli autori che immediatamente dopo il curettage aumenta il numero di cellule progenitrici stromali nelle parti remote dello scheletro. A partire dalla sesta ora, e il ventesimo giorno comprensivo di tibia controlaterale si osserva in più di duplice aumento delle concentrazioni e del numero di cellule che formano colonie di fibroblasti. Il meccanismo di questo fenomeno è probabilmente legato al fatto che una massiccia lesione del midollo osseo con conseguente formazione di un gran numero di coaguli di sangue, mentre contemporaneamente distruggendo un numero significativo di piastrine ed il rilascio nel fattore derivato dalle piastrine del sangue crescita (SADCD), che è noto per provocare la proliferazione di cellule formanti colonie fibroblasti situati nel corpo al di fuori del pool proliferativo. In esperimenti sui conigli somministrazione locale MSC promuove il restauro di cartilagine danneggiata chirurgicamente del ginocchio, che può essere associata con la formazione di condrociti derivati da MSC introdotte. Tuttavia, la rigenerazione riparativa dei difetti ossei nei ratti di laboratorio è notevolmente migliorata dall'uso di cellule staminali mesenchimali racchiuse in una struttura in ceramica. Pertanto, si può supporre che se non RBOK, allora qualsiasi altro fattore, derivato dalle cellule stromali danneggiate, ha un effetto stimolante distante sulla proliferazione delle cellule progenitrici mesenchimali nelle aree intatte del midollo osseo e stimola la loro migrazione nella zona del tessuto osseo difetto osseo. A sua volta, questo contrariamente a dati di letteratura di anni precedenti, indicando che le cellule stromali sono responsabili del microambiente, a differenza delle cellule ematopoietiche non sono in grado di migrare e provenire da fonti locali.

Tuttavia, i risultati dello studio Gerasimov Yu ed altri (2001) suggeriscono che l'applicazione di trauma meccanico provoca non solo un forte ristrutturazione del tessuto stromale nelle ossa kyuretirovannoy, ma anche cambiamenti significativi nelle ossa remote stroma intatto, cioè, non v'è una risposta sistemica tessuto stromale per traumi locali. E quando applicato politraumatizzati - curettage multipla - questa reazione viene amplificato e osservato non solo nel midollo gestito e parti distanti dello scheletro, ma anche negli organi linfoidi, in particolare la milza. Il meccanismo di una tale risposta sistemica del tessuto stromale del midollo osseo e della milza al trauma locale e al politrauma rimane sconosciuto. Si presume che questo processo sia associato all'effetto del fattore umorale rilasciato dallo stroma mesenchimale della cavità midollare del midollo osseo. Possibilità di rendere le cellule stromali del midollo osseo e milza organonespetsificheskogo fattore umorale responsabile della proliferazione cellulare, formanti colonie fibroblasti indicano dati sulle loro attività stimolante le colonie in colture monostrato di midollo osseo.

A questo proposito, è opportuno notare che, quando somministrata cellule mesenchimali precursori multipotenti sistemica ripopolamento loro derivati non solo il midollo osseo, ma anche altri tessuti, che viene utilizzato, in particolare per la terapia genica. E 'dimostrato che dopo somministrazione endovenosa di grandi quantità di cellule staminali mesenchimali con il genoma di topi wild-type con le cellule di collagene gene mutante I donatori sostituire fino al 30% delle cellule di osso e cartilagine tessuti del ricevente, e le cellule staminali di topo mesenchimali trasfettate secernenti IL-3 umana, per 9 mesi sostenere efficacemente ematopoiesi in caso di loro somministrazione simultanea di cellule staminali ematopoietiche umane in topi immunodeficienti.

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Modifica genetica delle cellule staminali mesenchimali

Ulteriori successo sperimentale della modificazione genetica va notato MSC trasfezione fattore IX genica in cellule staminali mesenchimali umane seguita da trasferimento di cellule transfettanti topi immunodeficienti, che porta alla comparsa di sangue Antihemophilic Fattore B oltre 8 settimane dopo il trapianto. In questo esperimento, la modifica post-traduzionale del fattore IX con γ-glutamil carbossilasi è stata eseguita in cellule transfettate. Trasduzione di cellule staminali mesenchimali con una codifica vettore retrovirale fattore IX umano, ha avuto meno successo - successiva introduzione di queste cellule con il cane emofilia in un livello terapeutico di fattore IX, che supporta normale emostasi intensità di coagulazione, solo per 12 giorni.

Il trapianto di cellule staminali mesenchimali nel cervello del parenchima di animali ha dimostrato che le cellule immature del donatore vengono trasformate sia nella popolazione di neuroni e glia. Attecchimento derivati neuronali donatore sano tessuto mesenchimale rende teoricamente possibile la correzione delle anomalie genetiche del metabolismo cerebrale in pazienti con malattia di Gaucher e altri disturbi del metabolismo lipidico, carboidrati o gangliosidi.

Continuando sperimentale condizioni di ricerca transdifferenziazione di cellule staminali in cellule stromali del midollo osseo precursori nel tessuto nervoso e del fegato. L'attenzione dei ricercatori si concentra sulle combinazioni di induttori di differenziazione e mezzi di condizionamento speciali. In particolare, per isolare la coltura primaria con 10% di siero di vitello fetale, cellule stromali del midollo osseo lavate e risospese in mezzo di coltura / F12 DMEM (1/1) vengono seminate ad una densità di 200.000 / cm2. Dopo 24 ore, le cellule non aderenti vengono rimosse e cellule fibroblastiche attaccate alla plastica vengono coltivate per una settimana. Per la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo di neuroblasti utilizzati terreno condizionato ottenuto coltivando cultura tre giorni di topo primaria fibroblasti embrionali, così come tra DMEM / F12 (1/1) con 2% di siero di vitello fetale e supplementato con 20 ng / ml o 10-6 M LiF acido retinoico (neuroinduttori, che sono utilizzati per la differenziazione neurale di topo e cellule staminali embrionali umane). La differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo in cellule progenitrici in epatociti stata indotta ambiente condizionato creata come risultato di tre giorni in coltura una coltura primaria di cellule di fegato di topo embrionali in DMEM / F12 (1/1) medium supplementato con 10% siero di vitello fetale.

Qui si dovrebbe notare ancora che le cellule che formano le colonie dello stroma del midollo osseo sono eteromorfe e possono essere divise in due tipi. Il primo tipo comprende cellule simili ai fibroblasti che formano cellule filopodi con nuclei grandi e uno o due nucleoli. Il secondo tipo è rappresentato da piccole celle a forma di fuso. Nella coltivazione di cellule di entrambi i tipi nel mezzo condizionato ottenuto sullo strato di alimentazione di fibroblasti embrionali di topo primario, cellule simili a neuroblasti compaiono nel terzo e quarto giorno in coltura. A questo stadio hanno spesso una forma a fuso con uno o due processi lunghi che terminano con filopodia. Le cellule piramidali o stellate con dendriti corti sono meno comuni. Dendriti uno neuroblasti hanno espansione tipico (crescita rene) e la ramificazione nella sua porzione distale, l'altro - con una distinta coni di crescita filopodia, attraverso il quale avviene la crescita di dendriti. Simili segni morfologici (reni e coni di crescita con filopodia), inerenti ai neuroblasti, che si differenziano nei neuroni, sono descritti in dettaglio nei lavori sulla neurogenesi. Su questa base, alcuni autori concludono che le cellule che rilevano in coltura sono neuroblasti. In particolare, Schegelskaya E. Et al (2002), dopo una coltura primaria di cellule stromali in coltura per due settimane in un sostituibile ad ogni mezzo Z-and-4 ° giorno condizionata trovato che una parte delle cellule proliferanti, mantenendo lo stato indifferenziato. Esteriormente, tali cellule assomigliavano ai fibroblasti e venivano identificate in coltura insieme ai neuroblasti differenzianti. La maggior parte delle cellule (circa l'80%) erano in diversi stadi di differenziazione in cellule del tessuto nervoso, principalmente nei neuroni. I processi dendritici di queste cellule si contattarono a vicenda, così che gradualmente le cellule si formarono sulle sezioni di substrato della rete nervosa sotto forma di lunghi fili multicellulari. I processi dendritici dei neuroblasti sono cresciuti molto più a lungo, alcuni dei quali 8-10 volte più alti della lunghezza del corpo del neurone stesso. Gradualmente aumentò la proporzione delle cellule piramidali e stellate. Dendriti di cellule stellate ramificate. Secondo gli autori, la successiva differenziazione di cellule piramidali e stellate rispetto a quelle a forma di fuso corrisponde alla sequenza di stadi della normale neurogenesi negli animali. Come risultato, gli autori concludono che le cellule staminali dello stroma del midollo osseo subiscono la neurogenesi indotta, durante la quale in vitro da neuroblasti si formano tutti e tre i principali tipi di neuroni. I predecessori delle cellule nervose sono stati anche rilevati durante la coltivazione di cellule di stroma del midollo osseo per 3-4 giorni in mezzo con siero fetale al 2% e LIF LIF di 20 ng / ml. Ma in questo caso le cellule staminali sono state divise molto lentamente, la differenziazione dei neuroblasti si è verificata solo nel 30% dei casi e non hanno formato reti neurali. Usando come una cellula nervosa induttori del differenziamento acido retinoico, gli autori ottenuti in coltura per 25-30% delle cellule nervose con una predominanza di cellule gliali - astrociti e oligodendrociti. I neuroni rappresentavano solo un terzo di tutte le cellule nervose, sebbene fossero rappresentati da tutti e tre i tipi: cellule fusiformi, piramidali e stellate. Al 6 ° giorno di cellule stromali di coltura in cellule nervose ambiente acido retinoico diventato più differenziato, mentre i singoli assoni dei neuroni piramidali trovato che nel normale neuroontogenesis apparire successiva formazione dei processi dendritiche. Secondo gli autori, nonostante la bassa resa di cellule nervose, il metodo di induzione acido retinoico ha vantaggi: astrociti e oligodendrociti e mielinizzanti operare funzioni di alimentazione durante la crescita di assoni e dendriti e sono necessari per la normale formazione del tessuto nervoso. Pertanto, per riparare i suoi siti danneggiati in vivo, è meglio usare una sospensione di neuroni arricchita con cellule gliali.

Nella seconda serie di esperimenti, gli autori hanno tentato di indurre la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo nelle cellule epatiche. Dopo tre giorni di coltura delle cellule staminali stromali del midollo osseo nel terreno condizionato ottenuto incubando topo epatociti embrionali, grandi cellule di forma sferica sono stati trovati, spesso, inclusioni citoplasmatiche due nucleari con dimensioni diverse. Queste cellule erano in diversi stadi di differenziazione e differivano per dimensioni, numero di nuclei e inclusioni nel citoplasma. Nella maggior parte di queste cellule è stato rilevato il glicogeno, sulla base del quale gli autori li hanno identificati come cellule progenitrici di epatociti. Poiché la coltura non le cellule sono state rilevate simili neuroblasti, seguita da una conclusione che nel terreno condizionato ottenuto coltivando epatociti embrionali, ci sono fattori di differenziazione delle cellule nervose e, viceversa, ci sono fattori che inducono la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo in cellule progenitrici di epatociti . Gli autori suggeriscono la presenza di cellule pluripotenti da stroma del midollo osseo, mentre differenziano in vitro in cellule di tessuto epatico o neurale seconda delle specifiche condizionata media e induttori.

In alcuni lavori, la differenziazione delle cellule dello stroma del midollo osseo in cardiomiociti, cartilagine, ossa e cellule del tessuto nervoso è effettivamente indicata correttamente. Vi sono informazioni che tra le cellule del midollo osseo ci sono popolazioni di cellule staminali che possono differenziarsi in epatociti. Alla luce di questi risultati sopra sperimentazione in topi può ancora essere considerato come un'altra conferma della presenza nelle cellule staminali pluripotenti mesenchimali midollari aventi una capacità di differenziarsi in cellule di vari tessuti dell'organismo adulto.

Trapianto di cellule staminali mesenchimali

Nel trapianto clinico di cellule staminali mesenchimali umane possono essere utilizzati per l'espansione di cellule staminali ematopoietiche e loro primi discendenti prekommitirovannyh. In particolare, l'introduzione di cellule staminali ematopoietiche autologhe e pazienti oncologici MSC dopo chemioterapia ad alta accelera il recupero dei neutrofili e delle piastrine nel sangue periferico. Autologo trapianto allogenico di cellule staminali mesenchimali utilizzate nel trattamento del mieloma multiplo, anemia aplastica, trombocitopenia spontanea - malattie associate con difetto primario tessuto emopoietico stromale. L'efficienza di terapia cellulare nelle patologie ematologiche in molti casi sopra, mentre l'introduzione di stromali e cellule staminali emopoietiche, che manifesta una riduzione del periodo di recupero postoperatorio, sangue, diminuzione del numero di decessi dovuti alle cellule tumorali regionali e circolanti non selettivi distruzione in cui il dado ei suoi paziente cellule ematopoietiche proprio progenitrici. MSC promettenti applicazioni e altri cellule precursori mesenchimali multipotenti nella pratica clinica a causa della loro relativa facilità di ottenere aspirati di midollo osseo, l'espansione in coltura e trasfezione del gene terapeutico. Così per compensare difetti del tessuto locali possono utilizzare un impianto locale di cellule precursori mesenchimali multipotenti e nella disfunzione sistemica di tessuti di origine mesenchimale non è esclusa la loro introduzione nella circolazione generale.

Più cauti nelle loro argomentazioni gli autori delle opere in cui le prospettive di MSC per locali, il trapianto sistemica e la terapia genica sono analizzati dal punto di vista della biologia delle cellule stromali. Il midollo osseo postnatale è tradizionalmente considerato come un organo costituito da due sistemi principali di linee cellulari chiaramente espresse - il tessuto ematopoietico reale e lo stroma di supporto associato. Pertanto, le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo erano inizialmente considerate esclusivamente come una fonte di base stromale per la produzione di fattori regolatori nel microambiente emopoietico. Quindi l'attenzione dei ricercatori passò allo studio del ruolo della MSC come fonte di origine dei tessuti scheletrici. Gli ultimi dati indicano un potenziale inatteso di differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo con la formazione di un tessuto neurale o muscolare. In altre parole, le cellule staminali mesenchimali mostrano plasticità transgermica - la capacità di differenziare in tipi cellulari che sono fenotipicamente estranei alle cellule del tessuto originale. Tuttavia, alcuni aspetti della biologia delle cellule stromali del midollo osseo rimangono poco chiari e irrisolto in pianta biologica generale, e in qualche dettaglio, compresa l'identificazione, la natura, l'origine e lo sviluppo e la funzione delle cellule stromali del midollo osseo vivo così come il potenziale di differenziazione ammissibile ex vivo e la possibilità uso terapeutico in vivo. I dati ottenuti sulle potenziali capacità delle MSC, così come i risultati della ricerca sul potenziale rigenerativo di altre cellule staminali, sono in netto contrasto con i dogmi stabiliti in biologia.

Quando coltivate in condizioni di bassa densità, le cellule stromali del midollo osseo formano colonie distinte, ognuna delle quali è un derivato di una singola cellula precursore. La percentuale di cellule progenitrici stromali nelle cellule del midollo osseo nucleate, determinata dalla capacità di formare colonie, dipende in modo significativo sia dalle condizioni di coltivazione che dalle specie appartenenti alla MSC. Ad esempio, nei roditori per ottenere la massima quantità di cellule progenitrici stromali assolutamente necessaria la presenza di cultura alimentatore irradiata cellule del midollo osseo e siero, mentre la formazione di colonie efficienza delle cellule staminali mesenchimali umane è indipendente dell'alimentatore, o dal terreno di coltura. Il numero di fattori mitogeni noti che stimolano la proliferazione delle cellule progenitrici stromali è limitato. Questi includono PDGF, EGF, FGF, TGF-b e anche IGF1. In condizioni di coltura ottimali, le linee policlonali di MSC sopravvivono in vitro a più di 50 divisioni cellulari, il che consente di ottenere miliardi di cellule stromali di midollo osseo da 1 ml del suo aspirato.

Tuttavia, la popolazione di cellule stromali del midollo osseo è eterogeneo, che si manifesta come variabilità nelle dimensioni delle colonie, diverso tasso della loro formazione e una varietà di morfologia cellulare, che comprende una serie di mandrini fibroblasti simile a grandi cellule piatte. Con lo sviluppo di tali colture dopo 20 giorni, si nota anche l'eterogeneità fenotipica. Alcune colonie sono altamente espresse dalla fosfatasi alcalina, altre non lo esprimono affatto e il terzo tipo di colonie è positivo alla fosfatasi nella regione centrale e negativo alla fosfatasi alla periferia. Colonie separate formano noduli di tessuto osseo (l'inizio della mineralizzazione della matrice è marcato se colorato con alizarina rossa o sul calcio da Van-Koss). In altre colonie si verifica l'accumulo di grasso, identificato dalla colorazione G con olio rosso. Meno spesso le colonie delle cellule staminali mesenchimali formano cartilagini che sono colorate con blu alcionico).

Dopo il trapianto ectopica negli animali da esperimento linee MGK policlonali formano stroma del midollo ectopica con setchatoobraznoy associato con mielopoiesi e adipociti, così, ma raramente, con tessuto cartilagineo. Nelle linee monoclonale trapianto di cellule stromali del midollo osseo in alcuni casi ci chimerismo, in cui il de novo tessuto osseo formato è composto di cellule ossee, adipociti comprende origine stroma e donatore, mentre le linee cellulari di ematopoietiche e sistema vascolare sono derivati dal destinatario.

I risultati di questi studi confermano la natura staminale del precursore stromale del midollo osseo, da cui è stata ottenuta la linea clonale. Mostrano anche che non tutte le clonazioni nelle cellule di coltura sono in realtà cellule staminali multipotenti. Alcuni ricercatori ritengono, e condividiamo il loro parere, che le informazioni più accurate sulla reale potenziale di differenziazione dei singoli cloni può essere ottenuto solo in vivo dopo il trapianto, piuttosto che attraverso la determinazione del fenotipo dei loro derivati in vitro. Espressione dei marcatori fenotipici cultura osteo hondro- o adipogenesis (determinato da mRNA o mediante tecniche istochimiche), e anche la produzione di matrice mineralizzata non riflette il grado di pluripotenza singolo clone in vivo. Pertanto, l'identificazione delle cellule staminali nel gruppo di cellule stromali è possibile solo a posteriori, nelle condizioni appropriate di un test di trapianto biologico. In particolare, Condrogenesi molto raramente osservata nei sistemi aperti di trapianto, mentre la formazione di cartilagine non è raro in sistemi chiusi, come camere di diffusione o in colture mikromassnyh di cellule stromali in vitro, in cui raggiunge la tensione localmente bassa ossigeno, contribuire alla formazione della cartilagine. Pertanto, anche la tecnica del trapianto e le condizioni di coltivazione in vitro non specifiche influenzano in modo significativo il range di differenziazione delle MSC.

Il trapianto sperimentale con l'osservanza di determinate condizioni sperimentali è lo standard d'oro per determinare il potenziale di differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e l'elemento chiave della loro corretta identificazione. Storicamente, gli studi sul trapianto di midollo osseo stromale del midollo osseo sono associati a un problema comune di trapianto di midollo osseo. È stato stabilito che il microambiente emopoietico è creato dal trapianto di cellule stromali del midollo osseo e fornisce uno sviluppo ectopico del tessuto emopoietico nella zona di trapianto. L'origine del microambiente dal donatore e il tessuto ematopoietico - dall'ospite ci permette di trattare l'osso ectopico come un vero trapianto di midollo osseo "invertito". Il trapianto locale di cellule stromali del midollo osseo promuove una correzione efficace dei difetti ossei, più pronunciata rispetto alla rigenerazione riparativa spontanea. In diversi studi preclinici in modelli animali in modo convincente dimostrato la possibilità di trapianti di cellule stromali del midollo osseo in ortopedia, anche se per ottimizzare questi metodi, anche nei casi più semplici, richiedono il lavoro e analisi più attenta. In particolare, le condizioni ottimali per l'espansione delle cellule stromali osteogeniche ex vivo non sono state ancora stabilite, la struttura e la composizione del veicolo ideale rimangono inutilizzate, così come il numero di cellule necessarie per la rigenerazione delle ossa alla rinfusa.

Oltre ad applicare ex vivo cellule stromali del midollo osso propagate per la rigenerazione tissutale di origine mesenchimale non ortodossa duttilità MSC apre l'uso potenziale per la rigenerazione delle cellule neurali, o la consegna di prodotti genici nel SNC. In linea di principio, questo semplifica la terapia cellulare nella sconfitta del sistema nervoso, poiché non è necessario ottenere cellule staminali autologhe dall'uomo. Viene riportato sulle possibilità di utilizzare cellule del midollo osseo per la generazione di cardiomiociti e cellule miogeniche precursori come origine veramente stromale ed estrinseca.

Sono in corso esperimenti sul trapianto sistemico di cellule stromali del midollo osseo per il trattamento delle comuni patologie scheletriche. Senza dubbio che le cellule stromali del midollo osseo sono una popolazione responsabili di malattie genetiche in malattie dello scheletro, che è ben illustrato dal vettore di trasferimento utilizzando l'informazione genetica delle cellule, che porta alla formazione di tessuto osseo patologico in animali da esperimento. Tuttavia, la capacità delle cellule stromali di impiantarsi, crescere, moltiplicarsi e differenziarsi nelle ossa dello scheletro dopo l'introduzione nel flusso sanguigno generale non è stata ancora dimostrata.

Ciò è in parte dovuto al fatto che nella procedura standard del trapianto di midollo osseo lo stroma non viene trapiantato insieme al tessuto ematopoietico, pertanto, devono ancora essere sviluppati criteri rigorosi per valutare l'attecchimento riuscito di cellule stromali somministrate sistemicamente. Va ricordato che la presenza di geni marcatori negli estratti di tessuto o l'isolamento nella coltura di cellule di origine donatrice non indica l'attecchimento delle cellule, ma solo la loro sopravvivenza. Anche l'iniezione intra-arteriosa di cellule stromali del midollo osseo nell'arto del topo può portare a un risultato praticamente nullo di attecchimento, nonostante il fatto che cellule di origine donatrice si trovano in gran numero all'interno della rete microvascolare del midollo osseo. Sfortunatamente, tali cellule vengono solitamente descritte come "innestate" solo sulla base dei risultati della determinazione dei geni dei donatori marcatori in condizioni di coltura ex vivo. Inoltre, è necessario fornire prove convincenti dell'integrazione a lungo termine nei tessuti di cellule differenziate e funzionalmente attive di origine donatrice. In molti lavori pubblicati, dove è riportato l'attecchimento delle cellule stromali del midollo osseo nello scheletro, la mancanza di dati chiari di questo tipo è sorprendente. Tuttavia, va notato che in alcuni esperimenti corretti sugli animali, tuttavia, è stata stabilita una limitata ma reale attecchimento di cellule progenitrici stromali dopo la loro somministrazione sistemica.

Questi dati sono coerenti con i risultati dello studio della possibilità di fornire cellule muscolari precancerose del midollo osseo ai muscoli attraverso il sistema vascolare. Tuttavia, non va dimenticato che sia i muscoli scheletrici che quelli muscolari si formano durante lo sviluppo e la crescita sulla base di movimenti cellulari extravascolari che utilizzano processi di migrazione che non implicano circolazione nel sangue. Se esiste realmente un percorso circolatorio indipendente per la consegna delle cellule precursori ai tessuti in fase solida, è possibile consentire l'esistenza di cellule progenitrici mesenchimali che circolano fisiologicamente? Qual è l'origine di queste cellule sia nell'organismo in via di sviluppo che in quello postnatale e come penetrano nella parete vascolare? La soluzione di questi problemi è assolutamente necessaria e richiede l'analisi preclinica più completa. Anche dopo aver trovato le risposte a queste domande, gli aspetti cinetici problematici associati alla crescita scheletrica e al rimodellamento del tessuto connettivo rimangono irrisolti. Allo stesso tempo, il trattamento dei disturbi dell'osteogenesi sostituendo l'intera popolazione di cellule progenitrici scheletriche mutate con cellule stromali sane sembra essere una vera prospettiva clinica. In questo caso, le zone locali di frattura o deformazione dovute a osteogenesi patologica, così come i cambiamenti distruttivi nel tessuto osseo, possono essere corretti da cellule staminali stromali coltivate in vitro. Pertanto, la direzione della ricerca futura dovrebbe essere focalizzata sui problemi di trasformazione o correzione genetica delle cellule progenitrici osteogeniche mutate autologhe ex vivo.

L'ingegneria genetica delle cellule, a breve termine o permanente, è diventata la base della biologia cellulare e molecolare, la fonte di molte scoperte scientifiche riguardanti il ruolo delle singole proteine nel metabolismo cellulare in vitro e in vivo. L'uso di tecniche molecolari per correggere malattie ereditarie e malattie umane è molto promettente per medicina pratica, poiché le proprietà delle cellule staminali stromali del midollo osseo permesso di sviluppare trapianto unico circuiti per la correzione delle malattie genetiche dello scheletro. Allo stesso tempo, le cellule progenitrici mesenchimali possono essere facilmente ottenute dal futuro destinatario, sono suscettibili di manipolazione genetica e sono in grado di moltiplicarsi in grandi numeri in un breve periodo di tempo. L'uso di cellule staminali mesenchimali evita i limiti e i rischi associati alla consegna di materiale informativo genetico direttamente al paziente attraverso strutture vtruviali di vettori. Tale strategia è applicabile per le cellule staminali embrionali, tuttavia le cellule stromali del midollo osseo autologo sono il materiale più preferito, in quanto la loro somministrazione esclude possibili complicanze immunologiche post-trapianto. Per realizzare l'effetto a breve termine, per esempio al fine di accelerare la rigenerazione ossea, il metodo ottimale è la modificazione genetica di cellule mesenchimali staminali utilizzando elektroporatsrsh, fusione chimica, lipofezione, plasmidi e costrutti adenovirali. In particolare, la trasfezione virale nelle cellule BMP-2 stromali del midollo osseo era efficace nell'accelerare la rigenerazione delle ossa nel politrauma sperimentale. La creazione di strutture vettoriali adenovirali è preferibile a causa dell'assenza di tossicità. Tuttavia, la modificazione genetica delle cellule stromali del midollo osseo in questo caso è caratterizzata da una stabilità estremamente bassa. Inoltre, le cellule stromali midollari trasformate normali richiedono l'utilizzo di vettori di vettori di informazioni genetiche 10 volte più infettive di altri tipi di cellule, il che aumenta significativamente la percentuale di morte delle cellule trasfettate.

Per trattare malattie recessive causate da attività basso o nullo biologica di alcuni geni necessari modifica prolungata o permanente di cellule staminali mesenchimali, che richiede l'uso di virus adeno-associati, retrovirus, lentivirus e chimera adeno-retrovirale. I siti di trasporto di questi virus sono in grado di trasportare grandi trasfetti di DNA (fino a 8 kb). La letteratura scientifica è già apparso informazioni sulla attività biologica delle cellule esogene stromali del midollo osseo transfettate con costrutti retrovirali che codifica la sintesi di molecole regolatrici, e marcatori - IL-3, CD2, il fattore VIII, e gli enzimi coinvolti nella sintesi di L-dopa. Ma in questi lavori gli autori sottolineano alcune limitazioni che devono essere superate prima che inizi l'applicazione pratica di questa tecnologia. Il primo problema è ottimizzare il processo di modifica ex vivo MCK. È noto che una proliferazione prolungata (3-4 settimane) delle cellule stromali del midollo osseo in vitro riduce la loro trasfezione. Allo stesso tempo, sono necessari diversi cicli di trasfusione per raggiungere un alto livello di modificazione genetica delle MSC. Il secondo problema è legato alla durata dell'espressione del gene terapeutico, che non supera ancora i quattro mesi. Una diminuzione naturale nell'espressione genica efficace è dovuta all'inattivazione dei promotori e alla morte delle cellule modificate. Nel trasferimento generale, le prospettive dell'informazione genetica utilizzando cellule staminali mesenchimali risultati degli studi preliminari indicano la necessità di un'ulteriore ottimizzazione dei metodi di trasfezione ex vivo, la selezione di un promotore adeguata regolare l'attività biologica nella giusta direzione, e migliorare la capacità delle cellule stromali del midollo osseo modificati per auto-rinnovano in vivo dopo il trapianto. Va notato che l'uso di disegni retrovirali per modificare le cellule stromali del midollo osseo nella giusta direzione non richiede sempre il loro attecchimento obbligatorio. Le cellule staminali mesenchimali trasfettate possono svolgere una funzione correttiva su uno sfondo di residenza stabile e senza incorporazione fisica attiva obbligatoria e funzionamento nel tessuto connettivo. In questo caso, dovrebbero essere considerati come una mini-pompa biologica, producendo un fattore in vivo, il cui deficit determina la manifestazione della patologia genetica.

Uso di cellule stromali del midollo osseo trasformate per il trattamento di malattia genetica dominante che si caratterizza per l'espressione del gene o anormale attività biologica patologica, è molto più problematico perché in questo caso è necessario bloccare il trasferimento o vendita delle informazioni genetiche distorta. Uno dei metodi di ingegneria genetica è la ricombinazione omologa delle cellule staminali embrionali al fine di creare animali transgenici. Tuttavia, il livello estremamente basso di ricombinante omologo, combinata con i problemi di identificazione, separazione e l'espansione di tali ricombinanti è improbabile che promuovere l'uso diffuso di questa tecnica nel prossimo futuro, anche se lo sviluppo di nuovi metodi tecnologici. Il secondo approccio alla terapia genica si basa sulla dominante patologia correzione automatica di DNA danneggiato come mutazioni genetiche possono essere corretti mediante introduzione di DNA esogeno con la sequenza desiderata (oligonucleotidi breve DNA, o chimerici oligonucleotidi RNA / DNA) che si legano al omologhi nel genoma danneggiato. La terza forma di realizzazione fornisce bloccaggio di trasmissione informazioni patologica che si ottiene attraverso l'uso di oligonucleotidi specificamente progettati che si legano ad un particolare gene per formare struttura ad elica ternaria, che esclude la possibilità di trascrizione.

Sebbene la correzione delle malattie genetiche nel genoma livello ottimale e metodo terapeutico preferito, mRNA è anche un vettore promettente (forse ancora più accessibile) per bloccare un gene dominante negativo. Al fine di inibire la traduzione e / o degradazione dell'mRNA crescente sono da tempo utilizzati con molecole proteiche antisenso sequenze oligonucleotidiche o il blocco di legame dell'mRNA apparato biosintetico della cella. Inoltre, l'RNA a doppio filamento induce una rapida degradazione dell'mRNA, il cui meccanismo rimane poco chiaro. Tuttavia, è improbabile che la semplice rimozione del mRNA trascritto da un allele mutante con mutazione brevi o singoli promuoverà espressione di mRNA del allele normale. Un'alternativa è il martello ribozinov uso e tornanti, hanno la capacità di legarsi a siti altamente specifici di mRNA con conseguente induzione di loro scissione e l'inattivazione durante la traduzione. Attualmente è in fase di studio la possibilità di utilizzare questo metodo nel trattamento dell'osteogenesi patologica. Indipendentemente da ciò che è esattamente la porta - elementi genomici o citoplasmatici successo della nuova tecnologia terapia genica sarà determinata dalla efficienza di inclusione dei reagenti nelle ossa cellule stromali del midollo ex vivo, la scelta ottimale di un particolare vettore e capacità stabile di cellule staminali mesenchimali che esprimono i fattori desiderati in vivo.

Pertanto, la scoperta di cellule staminali mesenchimali con le loro proprietà inaspettate crea un nuovo schema concettuale per lo sviluppo di linee cellulari. Ma per comprendere il ruolo biologico di cellule staminali stromali, della loro natura, la capacità di transdifferenziamento o de-differenziazione, la loro importanza fisiologica nel processo di sviluppo embrionale, postnatale crescita, la maturazione e l'invecchiamento, così come nelle malattie umane richiedono ulteriori ricerche interdisciplinari.