Cellule staminali neurali

La prova sperimentale della possibilità di rigenerazione delle cellule del sistema nervoso centrale è stata ottenuta molto prima della scoperta delle cellule staminali embrionali, in studi che hanno dimostrato la presenza di cellule nella neocorteccia, nell'ippocampo e nei bulbi olfattivi del cervello di ratti adulti che catturano la timidina 3H, ovvero cellule capaci di sintesi e divisione proteica. Già negli anni '60 del secolo scorso, si ipotizzava che queste cellule fossero precursori dei neuroni e fossero direttamente coinvolte nei processi di apprendimento e memoria. Poco dopo, è stata rivelata la presenza di sinapsi su neuroni formati de novo e sono comparsi i primi lavori sull'uso di cellule staminali embrionali per indurre la neurogenesi in vitro. Alla fine del XX secolo, esperimenti con la differenziazione diretta delle cellule staminali embrionali (ESC) in cellule progenitrici neurali, neuroni dopaminergici e serotoninergici hanno portato a una revisione delle idee classiche sulla capacità rigenerativa delle cellule nervose dei mammiferi. I risultati di numerosi studi hanno dimostrato in modo convincente sia la realtà della ristrutturazione delle reti neurali sia la presenza della neurogenesi durante l'intero periodo della vita postnatale dell'organismo mammifero.

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Fonti di cellule staminali neurali

Le cellule staminali neurali umane vengono isolate durante interventi chirurgici sulla regione subventricolare dei ventricoli laterali e sul giro dentato dell'ippocampo; le cellule di queste cellule formano neurosfere (sfere neurali) in coltura e, dopo la dispersione e la preformazione di queste ultime, tutti i principali tipi cellulari del sistema nervoso centrale o, in un mezzo speciale, nuove microsfere. Anche le colture in sospensione di tessuto dissociato isolato dalle regioni periventricolari del cervello embrionale generano neurosfere.

I marcatori delle cellule cerebrali immature includono nestina, beta-tubulina III (marcatore del lignaggio neuronale), vimentina, GFAP e NCAM, che vengono identificati immunocitochimicamente utilizzando anticorpi monoclonali. La nestina (proteina del neurofilamento intermedio di tipo IV) è espressa dalle cellule neuroectodermiche multipotenti. Questa proteina viene utilizzata per identificare e isolare cellule progenitrici neuroepiteliali multipotenti dal SNC utilizzando l'anticorpo monoclonale Rat-401, in grado di rilevare fino al 95% delle cellule del tubo neurale negli embrioni di ratto all'undicesimo giorno di gestazione. La nestina non è espressa sui discendenti differenziati delle cellule staminali neurali, ma è presente nelle cellule progenitrici neurali precoci, nei neuroni postmitotici e nei neuroblasti precoci. Questo marcatore è stato utilizzato per identificare le cellule progenitrici neuroepiteliali e per dimostrare l'esistenza di cellule staminali nel SNC. La vimentina (proteina del neurofilamento intermedio di tipo III) è espressa dalle cellule progenitrici neurali e gliali, così come da neuroni, fibroblasti e cellule muscolari lisce. Pertanto, entrambi i marcatori immunocitochimici non possiedono la specificità necessaria per identificare separatamente le cellule staminali neurali e le cellule progenitrici. La beta-tubulina III determina la direzione neuronale della differenziazione delle cellule staminali, mentre gli astrociti di tipo I sono identificati dall'espressione di GFAP e gli oligodendrociti esprimono specificamente il galattocerebroside (Ga!C).

FGF2 ed EGF fungono da mitogeni per le cellule progenitrici neurali, supportando la proliferazione di cellule progenitrici indifferenziate in coltura con la formazione di neurosfere. Il tasso di divisione delle cellule staminali neurali aumenta significativamente sotto l'influenza di FGF2, così come con l'uso di una combinazione di FGF2 + EGF. Gli effetti proliferativi di FGF2 sono mediati dai recettori FGF2-R1. L'eparina aumenta l'affinità di legame del recettore FGF2 e ne potenzia notevolmente l'effetto mitogeno sulle cellule neuroepiteliali. Nelle fasi precoci dell'embriogenesi, i recettori FGF2 sono espressi nel telencefalo di ratto, mentre nelle fasi successive la loro localizzazione è limitata alla zona ventricolare. Il picco di espressione di FGF2-R1 da parte delle cellule postmitotiche si osserva al completamento del periodo precoce di neurogenesi. Il periodo iniziale dello sviluppo del telencefalo è caratterizzato da un basso livello di espressione del recettore EGF, principalmente nelle cellule della regione ventrale. Nelle fasi successive dell'embriogenesi, l'espressione di EGF-R aumenta in direzione dorsale. Nel cervello dei roditori, l'EGF ha un'elevata affinità per il recettore del fattore di crescita trasformante beta (TGF-beta-R), a cui si lega preferenzialmente. Prove indirette del ruolo funzionale dell'EGF-R sono fornite da dati sulla disgenesia corticale del proencefalo che si verifica nel periodo tardivo dell'embriogenesi e dell'ontogenesi postnatale, sulla riduzione della funzione del proencefalo, sulla morte cellulare corticale e sull'ectopia ippocampale nei topi knockout per il gene del recettore dell'EGF. Inoltre, la presenza di TGF-α nel terreno nutritivo è assolutamente necessaria per la formazione delle neurosfere. Dopo la rimozione dei fattori di crescita dal terreno condizionato, le cellule smettono di dividersi e vanno incontro a differenziazione spontanea con la formazione di neuroni, astrociti e oligodendroblasti.

Tenendo conto di ciò, la riaggregazione delle cellule staminali dissociate e la coltura delle neurosfere vengono effettuate in terreni nutritivi contenenti EGF e FGF basico o FGF2, ma senza aggiunta di siero. È stato dimostrato che l'EGF induce la proliferazione delle cellule staminali della zona subependimale dei ventricoli laterali, mentre l'FGF basico promuove la proliferazione delle cellule staminali dello striato, dell'ippocampo, della neocorteccia e del nervo ottico dell'encefalo maturo. La combinazione di EGF e FGF basico è assolutamente necessaria per la proliferazione attiva delle cellule staminali isolate dall'ependima del terzo e quarto ventricolo del proencefalo, nonché dal canale spinale del midollo spinale toracico e lombare.

Dopo la dissociazione, la sospensione di cellule staminali neurali viene coltivata in piastre di plastica o multipozzetto senza substrato adesivo per aumentare le dimensioni delle nuove neurosfere formate, operazione che di solito richiede circa 3 settimane. Il metodo di dispersione e riproduzione multipla delle neurosfere consente di ottenere un numero sufficiente di cloni lineari di cellule staminali multipotenti per il trapianto intracerebrale. Questo principio è anche alla base della creazione di una banca di cellule staminali isolate dal cervello embrionale umano. La loro clonazione a lungo termine (diversi anni) consente di ottenere linee stabili di cellule staminali neurali, da cui si formano neuroni catecolaminergici durante il differenziamento indotto.

Se le neurosfere non vengono disperse e coltivate su substrati adesivi in terreni privi di fattori di crescita, le cellule staminali proliferanti iniziano a differenziarsi spontaneamente per formare cellule precursori neuronali e gliali che esprimono marcatori di tutti i tipi di cellule nervose: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, beta-tubulina III (neuroni), GFAP (astrociti) e CalC, 04 (oligodendrociti). A differenza delle cellule di topo e ratto, i neuroni rappresentano oltre il 40% di tutte le cellule differenziate nelle colture di cellule staminali neurali umane (dall'1 al 5% nei roditori), ma si formano significativamente meno oligodendrociti, il che è molto importante dal punto di vista della terapia cellulare delle malattie demielinizzanti. Il problema viene risolto aggiungendo terreno di coltura B104, che stimola la formazione di cellule produttrici di mielina.

Coltivando cellule progenitrici neurali dal cervello di embrioni umani in un terreno contenente EGF, FGF basico e LIF, il numero di cellule precursori della linea neurale aumenta di 10 milioni di volte. Le cellule espanse in vitro mantengono la capacità di migrare e differenziarsi in elementi neurali e gliali dopo il trapianto nel cervello di ratti maturi. Tuttavia, in vivo il numero di divisioni delle cellule precursori multipotenti è limitato. È stato ripetutamente osservato che il limite di Hayflick per una cellula staminale neurale "adulta" (circa 50 mitosi) è ancora irraggiungibile anche in via sperimentale: le cellule sotto forma di neurosfere mantengono le loro proprietà solo per 7 mesi e solo dopo 8 passaggi. Si ritiene che ciò sia dovuto alle peculiarità dei loro metodi di dispersione durante il passaggio (tripsinizzazione o azione meccanica), che riducono drasticamente l'attività proliferativa delle cellule a causa dell'interruzione dei contatti intercellulari. Infatti, se invece della dispersione si utilizza il metodo di divisione delle neurosfere in 4 parti, la vitalità delle cellule durante il passaggio aumenta significativamente. Questo metodo consente di coltivare cellule staminali neurali umane per 300 giorni. Tuttavia, dopo questo periodo, le cellule perdono l'attività mitotica e vanno incontro a degenerazione o entrano nella fase di differenziazione spontanea con la formazione di neuroni e astrociti. Su questa base, l'autore ritiene che 30 mitosi rappresentino il numero massimo di divisioni per le cellule staminali neurali coltivate.

Quando le cellule staminali neurali umane vengono coltivate in vitro, si formano prevalentemente neuroni GABAergici. In assenza di condizioni particolari, le cellule progenitrici neurali danno origine a neuroni dopaminergici (necessari per la terapia cellulare del morbo di Parkinson) solo nei primi passaggi, dopodiché tutti i neuroni in coltura sono costituiti esclusivamente da cellule GABAergiche. Nei roditori, IL-1 e IL-11, così come frammenti di membrana delle cellule nervose, LIF e GDNF, causano l'induzione di neuroni dopaminergici in vitro. Tuttavia, questo approccio metodologico si è dimostrato inefficace nell'uomo. Ciononostante, quando i neuroni GABAergici vengono trapiantati intracerebralmente in vivo, sotto l'influenza di fattori microambientali, si formano cellule nervose con diversi fenotipi di mediatori.

La ricerca di combinazioni di fattori neurotrofici ha mostrato che FGF2 e IL-1 inducono la formazione di neuroblasti dopaminergici, i quali, tuttavia, non sono in grado di produrre neuroni dopaminergici. La differenziazione delle cellule staminali ippocampali in neuroni glutammatergici eccitatori e GABA-ergici inibitori avviene sotto l'influenza delle neurotrofine, mentre EGF e IGF1 inducono la formazione di neuroni glutammatergici e GABA-ergici da cellule progenitrici neurali di embrioni umani. L'aggiunta sequenziale di acido retinoico e neurotrofina 3 (NT3) alla coltura aumenta significativamente la differenziazione delle cellule staminali ippocampali cerebrali mature in neuroni di varia natura, mentre una combinazione di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BNDF), NT3 e GDNF può produrre neuroni piramidali in colture ippocampali e neocorticali.

Pertanto, i risultati di numerosi studi indicano che, in primo luogo, le cellule staminali provenienti da diverse strutture cerebrali, sotto l'influenza di specifici fattori tissutali locali, sono in grado di differenziarsi in vivo nei fenotipi neuronali propri di queste strutture. In secondo luogo, la differenziazione indotta mirata di cellule staminali neurali in vitro mediante clonazione di cellule progenitrici consente di ottenere cellule nervose e gliali con caratteristiche fenotipiche specifiche per il trapianto intracerebrale in varie forme di patologia cerebrale.

Non vi è dubbio che le cellule staminali pluripotenti isolate da embrioni o dal sistema nervoso centrale adulto possano essere considerate una fonte di nuovi neuroni e utilizzate in clinica per il trattamento di patologie neurologiche. Tuttavia, il principale ostacolo allo sviluppo di un neurotrapianto cellulare pratico è il fatto che la maggior parte delle cellule staminali neurali non si differenzia in neuroni dopo l'impianto in zone non neurogeniche del sistema nervoso centrale maturo. Per aggirare questo ostacolo, viene proposto un metodo innovativo molto originale che consente di ottenere in vitro una popolazione pura di neuroni da cellule staminali neurali fetali umane dopo il trapianto nel sistema nervoso centrale di un ratto maturo. Gli autori dimostrano che il differenziamento delle cellule impiantate con questo metodo termina con la formazione di neuroni con fenotipo colinergico, dovuto all'influenza di fattori del microambiente circostante. La tecnologia proposta è interessante dal punto di vista dello sviluppo di nuovi tipi di terapia a base di cellule staminali e della sostituzione di neuroni danneggiati da lesioni o malattie neurodegenerative, poiché i neuroni colinergici svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo delle funzioni motorie, mnemoniche e di apprendimento. In particolare, i neuroni colinergici isolati da cellule staminali umane possono essere utilizzati per sostituire i motoneuroni persi nella sclerosi laterale amiotrofica o nelle lesioni del midollo spinale. Attualmente, non sono disponibili informazioni su metodi per produrre un numero significativo di neuroni colinergici da una popolazione di cellule staminali preformate con mitogeni. Gli autori propongono un metodo piuttosto semplice ma efficace per stimolare le cellule staminali neurali embrionali umane primarie preformate con mitogeni a svilupparsi in neuroni praticamente puri dopo l'impianto in zone sia non neurogeniche che neurogeniche del SNC di un ratto maturo. Il risultato più importante del loro lavoro è la conversione di un numero sufficientemente elevato di cellule trapiantate in neuroni colinergici una volta impiantate nella membrana mediana e nel midollo spinale.

Inoltre, per la preformazione in vitro di cellule staminali neurali dalla corteccia cerebrale embrionale umana di 8 settimane in neuroni colinergici, si propone di utilizzare varie combinazioni dei seguenti fattori trofici ed elementi chimici: FGF basico ricombinante, EGF, LIF, peptide amino-terminale del suono murino (Shh-N), acido trans-retinoico, NGF, BDNF, NT3, NT4, laminina naturale ed eparina murina. La linea originale di cellule staminali neurali umane (K048) è stata mantenuta in vitro per due anni e ha resistito a 85 passaggi senza alterazioni nelle proprietà proliferative e differenziative, mantenendo un cariotipo diploide normale. Neurosfere non disperse dei passaggi 19-55 (settimane 38-52) sono state piastrate su poli-D-lisina e laminina e quindi trattate con i fattori sopra menzionati in diverse concentrazioni, combinazioni e sequenze. La combinazione di FGF basico, eparina e laminina (abbreviata in FHL) ha prodotto un effetto unico. Dopo un giorno di coltura di cellule staminali neurali embrionali in terreno FHL con o senza Shh-N (la combinazione di Shh-N + FHL nell'abbreviazione SFHL), è stata osservata una rapida proliferazione di grandi cellule planari. Tutti gli altri protocolli di un giorno (come FGF basico + laminina), al contrario, hanno portato a una limitata diffusione radiale di cellule fusiformi, che non hanno abbandonato il nucleo delle neurosfere. Dopo 6 giorni di attivazione e successivi 10 giorni di differenziazione in terreno contenente B27, sono state rilevate grandi cellule multipolari simili a neuroni ai margini delle sfere attivate con FHL. In altri gruppi di protocolli, la maggior parte delle cellule simili a neuroni è rimasta piccola e bipolare o unipolare. L'analisi immunocitochimica ha mostrato che le piccole cellule bipolari o unipolari (< 20 μm) erano GABAergiche o glutamatergiche, mentre la maggior parte delle grandi cellule multipolari localizzate al margine delle neurosfere attivate da FHL erano colinergiche, esprimendo marcatori caratteristici dei neuroni colinergici (Islet-1 e ChAT). Alcuni di questi neuroni esprimevano simultaneamente sinapsina 1. Come risultato di cinque serie di esperimenti indipendenti, gli autori hanno scoperto che la popolazione totale di cellule nelle zone monostrato si differenziava in neuroni TuJ1+ del 45,5%, mentre i neuroni colinergici (ChAT^) costituivano solo il 27,8% delle cellule della stessa popolazione. Dopo 10 giorni di ulteriore differenziazione in vitro, oltre ai neuroni colinergici, è stato riscontrato un numero significativo di piccoli neuroni nelle neurosfere attivate da FHL: glutammatergici (6,3%), GABA-ergici (11,3%), nonché astrociti (35,2%) e cellule nestina-positive (18,9%). Utilizzando altre combinazioni di fattori di crescita, i neuroni colinergici erano assenti e le cellule marginali delle neurosfere formavano astrociti o piccoli neuroni glutammatergici e GABA-ergici. Il monitoraggio dei potenziali di riserva e attivi mediante la tecnica del patch clamp a cellula intera ha mostrato che dopo sette giorni di attivazione di FHL, la maggior parte delle grandi cellule polipolari presentava un potenziale di riposo di -29,0±2,0 mV in assenza di potenziale d'azione. Dopo 2 settimane, il potenziale di riposo è aumentato a -63.Sono stati osservati potenziali d'azione pari a 6±3,0 mV al momento dell'induzione delle correnti depolarizzanti, bloccati da 1 M di tetrodotossina, a indicare l'attività funzionale dei neuroni colinergici immaturi.

Gli autori hanno inoltre stabilito che l'attivazione di FHL o SFHL in vitro di per sé non determina la formazione di neuroni maturi e hanno tentato di stabilire se le cellule staminali preformate da FHL o SFHL siano in grado di differenziarsi in neuroni colinergici una volta trapiantate nel SNC di ratti maturi. A tale scopo, le cellule attivate sono state iniettate nella zona neurogena (ippocampo) e in diverse zone non neurogene, tra cui la corteccia prefrontale, la membrana mediana e il midollo spinale di ratti adulti. Le cellule impiantate sono state tracciate utilizzando il vettore CAO-^^p. È noto che l'OCP marca sia l'ultrastruttura cellulare che i processi cellulari (a livello molecolare) senza perdite e può essere visualizzato direttamente. Inoltre, le cellule staminali neurali marcate con OCP mantengono un profilo di differenziamento neuronale e gliale identico a quello delle cellule staminali non trasformate del cervello embrionale.

Da una a due settimane dopo l'impianto di 5 x 10 ⁴ cellule staminali neurali attivate e marcate, queste sono state trovate nel midollo spinale o nel cervello di ratti, con cellule OCD+ localizzate principalmente in prossimità del sito di iniezione. I processi di migrazione e integrazione sono stati osservati già un mese dopo il trapianto. I limiti di migrazione variavano a seconda del sito di iniezione: quando iniettate nella corteccia prefrontale, le cellule OCD+ si trovavano a 0,4-2 mm dal sito di iniezione, mentre nel caso di impianto nella membrana mediale, nell'ippocampo o nel midollo spinale, le cellule migravano per distanze molto maggiori, fino a 1-2 cm. Le cellule trapiantate erano localizzate in strutture altamente organizzate del SNC, tra cui la corteccia frontale, la membrana mediale, l'ippocampo e il midollo spinale. Gli elementi neuronali marcati con OCD erano visibili già dalla prima settimana dopo il trapianto, con un numero in significativo aumento un mese dopo l'operazione. L'analisi stereologica ha mostrato un tasso di sopravvivenza più elevato delle cellule impiantate in varie strutture del cervello, rispetto al midollo spinale.

È noto che nella maggior parte dei tessuti dell'organismo adulto dei mammiferi è conservata una popolazione di cellule staminali regionali, la cui trasformazione in cellule mature è regolata da specifici fattori tissutali. La proliferazione delle cellule staminali, la differenziazione delle cellule progenitrici e la formazione di fenotipi neuronali specifici per una data struttura cerebrale in vivo sono espressi in misura molto maggiore nel cervello embrionale, il che è determinato dalla presenza di elevate concentrazioni di fattori morfogenetici del microambiente locale: neurotrofine BDNF, NGF, NT3, NT4/5 e fattori di crescita FGF2, TGF-α, IGF1, GNDF, PDGF.

Dove si trovano le cellule staminali neurali?

È stato dimostrato che le cellule staminali neurali esprimono la proteina fibrillare acida gliale, che tra le cellule mature della linea neurale è presente solo sugli astrociti. Pertanto, le cellule astrocitarie potrebbero rappresentare la riserva di cellule staminali nel SNC maturo. Infatti, neuroni originati da precursori GFAP-positivi sono stati identificati nei bulbi olfattivi e nel giro dentato, contraddicendo le idee tradizionali sul ruolo progenitore della glia radiale, che non esprime GFAP nel giro dentato in età adulta. È possibile che nel SNC esistano due popolazioni di cellule staminali.

Anche la questione della localizzazione delle cellule staminali nella zona subventricolare rimane poco chiara. Secondo alcuni autori, le cellule ependimali formano cloni sferici in coltura che non sono vere neurosfere (come i cloni delle cellule subependimali), poiché sono in grado di differenziarsi solo in astrociti. D'altra parte, dopo marcatura fluorescente o virale delle cellule ependimali, il marcatore viene rilevato nelle cellule dello strato subependimale e nei bulbi olfattivi. Tali cellule marcate in vitro formano neurosfere e si differenziano in neuroni, astrociti e oligodendrociti. Inoltre, è stato dimostrato che circa il 5% delle cellule dell'ependima esprime marcatori staminali: nestina, Notch-1 e Mussashi-1. Si presume che il meccanismo della mitosi asimmetrica sia associato alla distribuzione irregolare del recettore di membrana Notch-1, per cui quest'ultimo rimane sulla membrana della cellula figlia localizzata nella zona ependimale, mentre la cellula madre che migra verso lo strato subependimale viene privata di questo recettore. Da questo punto di vista, la zona subependimale può essere considerata un collettore di precursori progenitori di neuroni e glia formati da cellule staminali dello strato ependimale. Secondo altri autori, solo cellule gliali si formano nelle porzioni caudali della zona subventricolare e la fonte della neurogenesi sono le cellule della porzione rostro-laterale. Nella terza variante, le porzioni anteriore e posteriore della zona subventricolare dei ventricoli laterali ricevono un potenziale neurogenico equivalente.

La quarta variante dell'organizzazione della riserva staminale nel sistema nervoso centrale sembra preferibile, secondo la quale si distinguono tre tipi principali di cellule progenitrici neurali nella zona subventricolare: A, B e C. Le cellule A esprimono marcatori neuronali precoci (PSA-NCAM, TuJl) e sono circondate da cellule B, che vengono identificate come astrociti dall'espressione di antigeni. Le cellule C, non avendo caratteristiche antigeniche di neuroni o glia, hanno un'elevata attività proliferativa. L'autore ha dimostrato in modo convincente che le cellule B sono precursori delle cellule A e dei neuroni de novo dei bulbi olfattivi. Durante la migrazione, le cellule A sono circondate da filamenti di cellule progenitrici neurali, il che differisce significativamente dal meccanismo di migrazione dei neuroblasti postmitotici lungo la glia radiale nel cervello embrionale. La migrazione termina nei bulbi olfattivi con la divisione mitotica delle cellule A e B, i cui derivati vengono incorporati negli strati delle cellule granulari e nello strato glomerulare della zona olfattiva del cervello.

Il cervello embrionale in via di sviluppo è privo di cellule ependimali differenziate e le pareti ventricolari contengono cellule staminali proliferanti delle zone germinali e subventricolari ventricolari, dove migrano neuroblasti e glioblasti primari. Sulla base di ciò, alcuni autori ritengono che la regione subependimale del cervello maturo contenga una riduzione del tessuto neurale germinale embrionale costituito da astrociti, neuroblasti e cellule non identificate. Le vere cellule staminali neurali costituiscono meno dell'1% delle cellule nella zona germinale della parete ventricolare laterale. In parte per questo motivo, e anche in relazione ai dati che dimostrano che gli astrociti della zona subependimale sono precursori delle cellule staminali neurali, non si esclude la possibilità di transdifferenziazione degli elementi gliali astrocitari con l'acquisizione di caratteristiche fenotipiche neuronali.

Il principale ostacolo alla soluzione definitiva del problema della localizzazione delle cellule staminali neurali in vivo è la mancanza di marcatori specifici per queste cellule. Tuttavia, molto interessanti dal punto di vista pratico sono i risultati di studi sull'isolamento di cellule staminali neurali da regioni del SNC prive di zone subependimali: il terzo e il quarto ventricolo del proencefalo, il canale spinale delle regioni toracica e lombare del midollo spinale. Di particolare importanza è il fatto che la lesione del midollo spinale aumenta la proliferazione delle cellule staminali ependimali del canale centrale, con la formazione di cellule progenitrici che migrano e si differenziano in astrociti della cicatrice gliomesodermica. Inoltre, cellule precursori di astro- e oligodendrociti sono state trovate anche nel midollo spinale non lesionato di ratti adulti.

Pertanto, i dati della letteratura dimostrano in modo convincente la presenza nel SNC dei mammiferi adulti, incluso l'uomo, di una riserva regionale di staminali, la cui capacità rigenerativo-plastica, purtroppo, è in grado di garantire solo i processi di rigenerazione fisiologica con la formazione di nuove reti neuronali, ma non soddisfa le esigenze di rigenerazione riparativa. Ciò pone il compito di ricercare opportunità per aumentare le risorse staminali del SNC con mezzi esogeni, compito irrisolvibile senza una chiara comprensione dei meccanismi di formazione del SNC nel periodo embrionale.

Oggi sappiamo che durante lo sviluppo embrionale, le cellule staminali del tubo neurale sono la fonte di tre tipi cellulari: neuroni, astrociti e oligodendrociti, ovvero neuroni e neuroglia originano da un'unica cellula precursore. Il differenziamento dell'ectoderma in gruppi di cellule progenitrici neurali inizia sotto l'influenza dei prodotti dei geni proneurali della famiglia bHLH ed è bloccato dall'espressione di derivati proteici transmembrana recettoriali dei geni della famiglia Notch, che limitano la determinazione e il differenziamento precoce delle cellule precursori neurali. A loro volta, i ligandi dei recettori Notch sono le proteine transmembrana Delta delle cellule adiacenti, grazie al cui dominio extracellulare si realizzano contatti intercellulari diretti con interazione induttiva tra cellule staminali.

L'ulteriore implementazione del programma di neurogenesi embrionale non è meno complessa e, a quanto pare, dovrebbe essere specie-specifica. Tuttavia, i risultati degli studi sul neuroxenotrapianto indicano che le cellule staminali presentano un marcato conservatorismo evolutivo, grazie al quale le cellule staminali neurali umane sono in grado di migrare e svilupparsi quando trapiantate nel cervello di ratto.

È noto che il sistema nervoso centrale dei mammiferi ha una capacità estremamente bassa di rigenerazione riparativa, caratterizzata dall'assenza di qualsiasi segno di comparsa di nuovi elementi cellulari nel cervello maturo per sostituire i neuroni morti a causa di lesioni. Tuttavia, nel caso del trapianto di neuroblasti, questi ultimi non solo si innestano, proliferano e differenziano, ma sono anche in grado di integrarsi nelle strutture cerebrali e sostituire funzionalmente i neuroni persi. Nel trapianto di cellule progenitrici neuronali assegnate, l'effetto terapeutico è risultato significativamente più debole. È stato dimostrato che tali cellule hanno una bassa capacità di migrazione. Inoltre, le cellule progenitrici neuronali non riproducono l'architettura delle reti neurali e non sono funzionalmente integrate nel cervello del ricevente. A questo proposito, si stanno studiando attivamente le problematiche della rigenerazione plastica-riparativa durante il trapianto di cellule staminali neurali multipotenti non preformate.

Nello studio di M. Aleksandrova et al. (2001), nella prima versione degli esperimenti, i riceventi erano ratti femmine sessualmente mature e i donatori erano embrioni di 15 giorni. Una sezione della corteccia occipitale del cervello è stata prelevata dai riceventi e tessuto meccanicamente sospeso della presunta corteccia embrionale contenente cellule staminali multipotenti delle regioni ventricolare e subventricolare è stato trapiantato nella cavità. Nella seconda versione degli esperimenti, le cellule staminali neurali di un embrione umano di 9 settimane sono state trapiantate nel cervello di ratti sessualmente maturi. Gli autori hanno isolato frammenti di tessuto dalla regione periventricolare del cervello embrionale, li hanno posti in un terreno nutritivo F-12 e hanno ottenuto una sospensione cellulare mediante ripetute pipettate, quindi li hanno coltivati in uno speciale terreno NPBM con l'aggiunta di fattori di crescita: FGF, EGF e NGF. Le cellule sono state coltivate in una coltura in sospensione fino alla formazione di neurosfere, che sono state disperse e reimpiantate nella coltura. Dopo 4 passaggi con un periodo di coltivazione totale di 12-16 giorni, le cellule sono state utilizzate per il trapianto. I riceventi erano cuccioli di ratto di dieci giorni e ratti Wistar sessualmente maturi di due mesi, ai quali sono stati iniettati 4 μl della sospensione di cellule staminali neurali umane nel ventricolo laterale del cervello senza immunosoppressione. I risultati del lavoro hanno mostrato che le cellule dissociate della zona ventricolare e subventricolare dell'anlage embrionale della corteccia cerebrale di ratto hanno continuato il loro sviluppo durante l'allotrapianto nel cervello maturo, ovvero i fattori del microambiente del cervello ricevente differenziato non hanno bloccato la crescita e la differenziazione delle cellule staminali neurali dell'embrione. Nelle fasi iniziali dopo il trapianto, le cellule multipotenti hanno continuato la divisione mitotica e sono migrate attivamente dall'area del trapianto al tessuto cerebrale del ricevente. Cellule embrionali trapiantate con un enorme potenziale di migrazione sono state trovate in quasi tutti gli strati della corteccia cerebrale del ricevente lungo il percorso del trapianto e nella sostanza bianca. La lunghezza del tratto di migrazione delle cellule nervose era sempre significativamente inferiore (fino a 680 μm) rispetto a quella degli elementi gliali (fino a 3 mm). I vasi sanguigni e le strutture fibrose del cervello fungevano da vettori strutturali per la migrazione degli astrociti, come osservato anche in altri studi.

In precedenza, si riteneva che l'accumulo di astrociti marcati nell'area di danno alla corteccia cerebrale del ricevente potesse essere associato alla formazione di una barriera gliale tra i tessuti del trapianto e del ricevente. Tuttavia, uno studio sulla struttura di trapianti cellulari in posizione compatta ha mostrato che la loro citoarchitettura è caratterizzata da caos, senza alcuna distribuzione stratificata delle cellule trapiantate. Il grado di ordine dei neuroni trapiantati si avvicinava a quello delle cellule della corteccia cerebrale normale solo in assenza di una barriera gliale tra i tessuti del donatore e del ricevente. Altrimenti, la struttura delle cellule trapiantate era atipica e i neuroni stessi erano soggetti a ipertrofia. Utilizzando la tipizzazione neuroimmunochimica delle cellule trapiantate, sono stati riscontrati neuroni GABAergici inibitori nei trapianti ed è stata rilevata l'espressione delle proteine PARV, CALB e NPY. Di conseguenza, il cervello maturo conserva fattori microambientali in grado di supportare la proliferazione, la migrazione e la differenziazione specifica delle cellule neurali multipotenti.

Nella coltura di cellule staminali umane isolate dalla regione periventricolare del cervello di embrioni di 9 settimane, M. Aleksandrova et al. (2001) hanno riscontrato un gran numero di cellule multipotenti nestina-positive al quarto passaggio, alcune delle quali avevano già subito differenziazione in vitro e si stavano sviluppando secondo il tipo neuronale, il che corrispondeva ai risultati di studi di altri autori. Dopo il trapianto nel cervello di ratti adulti, le cellule staminali umane coltivate si sono divise mitoticamente e sono migrate nel tessuto del cervello ricevente xenogenico. Nei trapianti cellulari, gli autori hanno osservato due popolazioni di cellule: piccole e grandi. Queste ultime migravano sia nel parenchima che lungo le strutture fibrose del cervello ricevente su distanze insignificanti, entro 300 μm. La maggiore estensione del percorso di migrazione (fino a 3 mm) era caratteristica delle cellule piccole, alcune delle quali si differenziavano in astrociti, e ciò è stato stabilito utilizzando anticorpi monoclonali anti-GFAP. Entrambi i tipi cellulari sono stati trovati nella parete del ventricolo laterale, a indicare che le cellule trapiantate sono entrate nel tratto di migrazione rostrale. I derivati astrocitari delle cellule staminali neurali, sia umane che di ratto, sono migrati prevalentemente attraverso i capillari sanguigni e le strutture fibrose del cervello ricevente, il che coincide con i dati di altri autori.

L'analisi del differenziamento delle cellule staminali umane in vivo utilizzando anticorpi monoclonali diretti contro GFAP, CALB e VIM ha rivelato la formazione sia di astrociti che di neuroni. A differenza delle cellule trapiantate nei ratti, molte cellule staminali umane erano positive alla vimentina. Di conseguenza, alcune delle cellule multipotenti umane non hanno subito differenziamento. Gli stessi autori hanno successivamente dimostrato che le cellule staminali neurali umane trapiantate senza immunosoppressione sopravvivono nel cervello di ratto per 20 giorni dopo il trapianto, senza segni di aggressione immunitaria da parte degli elementi gliali del cervello maturo.

È stato dimostrato che anche le cellule staminali neurali di Drosophila attecchiscono e si differenziano nel cervello di un taxon distante dagli insetti come il ratto. La correttezza dell'esperimento degli autori è indubitabile: linee transgeniche di Drosophila contenevano geni per i fattori neurotrofici umani NGF, GDNF e BDNF, inseriti nel vettore CaSper sotto il promotore dello shock termico di Drosophila, in modo che la temperatura corporea dei mammiferi ne evocasse automaticamente l'espressione. Gli autori hanno identificato le cellule di Drosophila tramite il prodotto del gene della galattosidasi batterica utilizzando la colorazione istochimica X-Gal. Inoltre, è emerso che le cellule staminali neurali di Drosophila rispondono specificamente ai fattori neurotrofici codificati dai geni umani: xenotrapiantando cellule di una linea transgenica di Drosophila contenente il gene gdnf, la sintesi di tirosina idrossilasi nelle sue cellule staminali neurali in fase di differenziazione è aumentata notevolmente, e le cellule con il gene ngf hanno prodotto attivamente acetilcolinesterasi. Lo xenotrapianto ha indotto reazioni gene-dipendenti simili nell'allotrapianto di tessuto neurale embrionale trapiantato insieme ad esso.

Ciò significa che la differenziazione specifica delle cellule staminali neurali è indotta da fattori neurotrofici specie-specifici? Secondo i risultati degli autori, lo xenotrapianto che produceva fattori neurotrofici ha avuto un effetto specifico sul destino degli allotrapianti, che in questo caso si sono sviluppati più intensamente e presentavano dimensioni 2-3 volte maggiori rispetto agli allotrapianti introdotti nel cervello senza l'aggiunta di xenotrapianti. Di conseguenza, le cellule di xenotrapianto contenenti geni per le neurotrofine, in particolare il gene che codifica per il fattore neurotrofico derivato dalle cellule gliali umane (GDNF), hanno un effetto specie-specifico sullo sviluppo dell'allotrapianto, simile all'azione della corrispondente neurotrofina. È noto che il GDNF aumenta la sopravvivenza dei neuroni dopaminergici nel mesencefalo embrionale di ratto e migliora il metabolismo della dopamina da parte di queste cellule, inducendo inoltre la differenziazione delle cellule tirosina idrossilasi-positive, favorendo la crescita assonale e aumentando le dimensioni del corpo cellulare neuronale. Effetti simili si osservano anche nei neuroni dopaminergici del mesencefalo di ratto in coltura.

La migrazione attiva delle cellule staminali neurali umane è osservata dopo xenotrapianto nel cervello di ratti maturi. È noto che il processo di migrazione e differenziazione delle cellule staminali neurali è controllato da un insieme di geni specifici. Il segnale di inizio della migrazione alla cellula precursore per iniziare il differenziamento è dato dal prodotto proteico del protooncogene c-ret insieme al GDNF. Il segnale successivo proviene dal gene mash-1, che controlla la scelta del percorso di sviluppo cellulare. Inoltre, la reazione specifica delle cellule in differenziazione dipende anche dal recettore α del fattore neurotrofico ciliare. Pertanto, data la costituzione genetica completamente diversa delle cellule staminali neurali umane xenogeniche e delle cellule cerebrali di ratto riceventi, è necessario riconoscere non solo la specie-aspecificità dei fattori neurotrofici, ma anche il più elevato conservatorismo evolutivo dei geni responsabili del differenziamento specifico degli elementi staminali neurali.

Il futuro dimostrerà se lo xenotrapianto di neuromateriale embrionale sarà possibile nella pratica neurochirurgica per il trattamento di processi patologici neurodegenerativi causati dall'interruzione della sintesi di mielina da parte degli oligodendrociti. Nel frattempo, le problematiche più affrontate nell'ambito del neurotrapianto sono quelle relative all'ottenimento di cellule staminali neurali allogeniche da cervello embrionale o maturo in coltura, con successiva differenziazione mirata in neuroblasti o neuroni specializzati.

Trapianto di cellule staminali neurali

Per stimolare la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali neurali di un organismo adulto, è possibile trapiantare tessuto nervoso embrionale. È possibile che le cellule staminali del tessuto nervoso embrionale introdotte con l'allotrapianto possano a loro volta proliferare e differenziarsi. È noto che dopo una lesione spinale, la rigenerazione dei conduttori nervosi avviene attraverso l'allungamento degli assoni danneggiati e la germinazione collaterale degli assoni dei processi non danneggiati dei motoneuroni. I principali fattori che impediscono la rigenerazione del midollo spinale sono la formazione di una cicatrice del tessuto connettivo nell'area del danno, alterazioni distrofiche e degenerative nei neuroni centrali, la carenza di NGF e la presenza di prodotti di degradazione della mielina nell'area del danno. È stato dimostrato che il trapianto di diversi tipi di cellule nel midollo spinale danneggiato - frammenti del nervo sciatico di animali adulti, corteccia occipitale embrionale, ippocampo, midollo spinale, cellule di Schwann, astrociti, microglia, macrofagi, fibroblasti - promuove la rigenerazione degli assoni danneggiati mediante germinazione e consente agli assoni di nuova formazione di crescere attraverso la zona di lesione del midollo spinale. È stato sperimentalmente dimostrato che il trapianto di tessuto nervoso embrionale nella zona di lesione del midollo spinale, attraverso l'azione di fattori neurotrofici, accelera la crescita degli assoni danneggiati, previene la formazione di cicatrici gliali e lo sviluppo di processi distrofici e degenerativi nei neuroni centrali, mentre le cellule del tessuto nervoso embrionale trapiantato sopravvivono nel midollo spinale, si integrano con i tessuti adiacenti e promuovono la crescita assonale attraverso la zona di lesione con la formazione di sinapsi dendritiche sui neuroni spinali.

Questo settore della medicina plastica rigenerativa ha ricevuto il maggiore sviluppo in Ucraina grazie al lavoro del team scientifico guidato da V.I. Tsymbalyuk. Innanzitutto, si tratta di studi sperimentali sull'efficacia del trapianto di tessuto nervoso embrionale nelle lesioni del midollo spinale. Durante l'autotrapianto del nervo periferico, gli autori hanno osservato i cambiamenti distruttivi più pronunciati nella zona di sutura distale, dove il 30° giorno dopo l'intervento erano associati a processi riparativi. Durante l'allotrapianto, lo stato morfofunzionale del nervo impiantato al 30° giorno era caratterizzato da una marcata distruzione con degenerazione grassa e amiloidosi, sullo sfondo di un'infiltrazione focale di cellule linfoidi infiammatorie con predominante atrofia delle cellule di Schwann. Il trapianto di tessuto nervoso embrionale ha contribuito in misura maggiore al ripristino della conduttività del midollo spinale, soprattutto negli animali sottoposti a intervento chirurgico nelle prime 24 ore successive alla lesione: a fronte di una riduzione dell'intensità dei processi infiammatori e distruttivi, sono state osservate ipertrofia e iperplasia degli elementi ultrastrutturali dei neuroni spinali deputati alla sintesi proteica e alla produzione di energia, ipertrofia e iperplasia degli oligodendrociti, l'ampiezza del potenziale d'azione muscolare è stata ripristinata del 50% e la velocità di conduzione dell'impulso del 90%. Nella valutazione dell'efficacia del trapianto di tessuto nervoso embrionale in base alla zona di trapianto, si è riscontrato che i risultati migliori si sono ottenuti quando l'innesto è stato introdotto direttamente nella zona della lesione del midollo spinale. In caso di resezione completa del midollo spinale, il trapianto di tessuto nervoso embrionale si è rivelato inefficace. Studi dinamici hanno dimostrato che il momento ottimale per eseguire il trapianto di tessuto nervoso embrionale sono le prime 24 ore dopo la lesione del midollo spinale, mentre eseguire l'intervento chirurgico durante il periodo di marcati cambiamenti ischemico-infiammatori secondari che si verificano dal 2° al 9° giorno dopo la lesione dovrebbe essere considerato inappropriato.

È noto che un grave trauma cranico provoca un'attivazione potente e prolungata della perossidazione lipidica nelle fasi iniziali e intermedie del periodo post-traumatico, sia nel tessuto cerebrale danneggiato che nell'organismo nel suo complesso, e interferisce anche con i processi del metabolismo energetico nel cervello lesionato. In queste condizioni, il trapianto di tessuto nervoso embrionale nell'area del trauma favorisce la stabilizzazione dei processi di perossidazione lipidica e aumenta il potenziale del sistema antiossidante del cervello e dell'organismo nel suo complesso, migliorandone la protezione antiradicalica tra il 35° e il 60° giorno del periodo post-traumatico. Nello stesso periodo successivo al trapianto di tessuto nervoso embrionale, il metabolismo energetico e i processi di fosforilazione ossidativa nel cervello si normalizzano. Inoltre, è stato dimostrato che il primo giorno dopo un trauma cranico sperimentale, l'impedenza del tessuto dell'emisfero leso diminuisce del 30-37%, quella controlaterale del 20%, il che indica lo sviluppo di edema cerebrale generalizzato. Negli animali sottoposti a trapianto di tessuto nervoso embrionale, l'involuzione dell'edema si è verificata significativamente più rapidamente: già al settimo giorno, il valore medio dell'impedenza dei tessuti dell'emisfero leso ha raggiunto il 97,8% del livello di controllo. Inoltre, il completo ripristino dei valori di impedenza al trentesimo giorno è stato osservato solo negli animali sottoposti a trapianto di tessuto nervoso embrionale.

La morte di alcuni neuroni cerebrali dopo una grave lesione craniocerebrale è una delle principali cause di complicanze post-traumatiche. I neuroni dei sistemi integrati dopaminergici e noradrenergici del mesencefalo e del midollo allungato sono particolarmente sensibili alle lesioni. Una diminuzione dei livelli di dopamina nel complesso striopallidale e nella corteccia cerebrale aumenta significativamente il rischio di sviluppare disturbi motori e disturbi mentali, stati epilettiformi, e una diminuzione della produzione di dopamina nell'ipotalamo può essere la causa di numerosi disturbi vegetativi e somatici osservati nel periodo post-traumatico tardivo. I risultati di studi condotti su lesioni craniocerebrali sperimentali indicano che il trapianto di tessuto nervoso embrionale aiuta a ripristinare i livelli di dopamina nell'emisfero cerebrale leso, dopamina e noradrenalina nell'ipotalamo e ad aumentare i livelli di noradrenalina e dopamina nel mesencefalo e nel midollo allungato. Inoltre, in seguito al trapianto di tessuto nervoso embrionale nell'emisfero cerebrale danneggiato di animali da esperimento, la percentuale di fosfolipidi si normalizza e il contenuto di acidi grassi aumenta (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Questi dati confermano la stimolazione dei processi plastico-rigenerativi da parte del tessuto nervoso embrionale trapiantato e indicano l'effetto trofico-riparativo del trapianto sul cervello del ricevente nel suo complesso.

L'esperienza clinica del personale dell'Istituto di Neurochirurgia AP Romodanov dell'Accademia di Scienze Mediche dell'Ucraina nel trapianto di tessuto nervoso embrionale nella paralisi cerebrale, una patologia estremamente complessa con grave disfunzione motoria, merita particolare attenzione. Le forme cliniche di paralisi cerebrale dipendono dal livello di danno alle strutture integrali responsabili della regolazione del tono muscolare e della formazione di stereotipi motori. Attualmente, vi sono sufficienti prove a supporto del fatto che le alterazioni patologiche nel sistema di controllo motorio striopallido-talamocorticale svolgono un ruolo importante nei disturbi della funzione motoria e del tono muscolare. Il collegamento striopallidale di questo sistema svolge la funzione di controllo attraverso la produzione di dopamina nigrostriatale. La via diretta per l'attuazione del controllo talamocorticale inizia dai neuroni del putamen, è mediata dall'acido gamma-amminobutirrico (GABA) e dalla sostanza P e si proietta direttamente nella zona motoria del segmento interno del globo pallido e nella substantia nigra. La via indiretta, il cui effetto si realizza con la partecipazione del GABA e dell'encefalina, origina dai neuroni del putamen e colpisce i nuclei dei gangli della base attraverso una sequenza di connessioni che includono il segmento esterno del globo pallido e il nucleo subtalamico. Disturbi della conduttività della via diretta causano ipocinesia, mentre una diminuzione della conduttività delle strutture della via indiretta porta a ipercinesia con corrispondenti alterazioni del tono muscolare. L'integrità delle vie di conduzione GABAergiche a diversi livelli del sistema di controllo motorio e l'integrazione delle connessioni dopaminergiche a livello del putamen sono essenziali per la regolazione delle interazioni talamocorticali. La manifestazione più comune di patologia motoria in varie forme di paralisi cerebrale è una violazione del tono muscolare e una modifica strettamente correlata dell'attività muscolare riflessa.

Il trapianto di tessuto nervoso embrionale nella paralisi cerebrale infantile richiede un'analisi approfondita della natura del danno alle strutture cerebrali. Sulla base della determinazione dei livelli di dopamina e GABA nel liquido cerebrospinale subaracnoideo, gli autori hanno dettagliato il livello di compromissione dell'integrazione delle strutture cerebrali funzionali, il che ha permesso di oggettivare i risultati dell'intervento chirurgico e correggere i ripetuti neurotrapianti. Il tessuto nervoso embrionale (materiale abortivo di un embrione di 9 settimane) è stato trapiantato nel parenchima della corteccia delle circonvoluzioni precentrali degli emisferi cerebrali, a seconda della gravità delle alterazioni atrofiche. Non sono state osservate complicazioni o peggioramenti delle condizioni dei pazienti nel periodo postoperatorio. Una dinamica positiva è stata osservata nel 63% dei pazienti con forme spastiche, nell'82% dei bambini con forma atonica-estetica e solo nel 24% dei pazienti con forma mista della malattia. È stato stabilito un effetto negativo di un elevato livello di neurosensibilizzazione con presenza di autoanticorpi contro proteine neurospecifiche sui risultati dell'intervento. Il trapianto di tessuto nervoso embrionale si è rivelato inefficace nei pazienti di età pari o superiore a 8-10 anni, nonché nei casi di sindrome ipercinetica grave ed epilessia. Clinicamente, l'efficacia del trapianto di tessuto nervoso embrionale nei pazienti con forme spastiche di paralisi cerebrale si è manifestata con la formazione di nuove capacità statomotorie e movimenti volontari con correzione dello stereotipo motorio patologico e una riduzione del grado di spasticità, delle posture e degli atteggiamenti patologici. Gli autori ritengono che l'effetto positivo del trapianto di tessuto nervoso embrionale sia dovuto all'effetto normalizzante sull'attività funzionale delle strutture sopraspinali coinvolte nella regolazione del tono posturale e dei movimenti volontari. Allo stesso tempo, gli effetti clinici positivi del trapianto di tessuto nervoso embrionale sono accompagnati da una diminuzione del contenuto di neurotrasmettitori nel liquido cerebrospinale subaracnoideo, che indica il ripristino delle interazioni integrali delle strutture cerebrali colpite.

Esiste un'altra grave forma di patologia neurologica: la sindrome apallica, il cui problema terapeutico, purtroppo, è lungi dall'essere risolto. La sindrome apallica è una condizione polieziologica subacuta o cronica che si verifica a seguito di gravi lesioni organiche del sistema nervoso centrale (principalmente della corteccia cerebrale) ed è caratterizzata dallo sviluppo di panaprassia e panagnosia con funzionalità relativamente conservata delle sezioni e delle formazioni segmentali del complesso limbico-reticolare dell'encefalo. Studi di follow-up (da 1 a 3 anni) hanno dimostrato che la sindrome apallica non è una diagnosi definitiva di danno persistente al sistema nervoso nei bambini, ma si trasforma in demenza organica o in stato vegetativo cronico. Presso il Dipartimento di Neurochirurgia Riparativa dell'Istituto di Neurochirurgia AP Romodanov dell'Accademia delle Scienze Mediche dell'Ucraina, 21 pazienti con le conseguenze della sindrome apallica sono stati sottoposti a trapianto di tessuto nervoso embrionale. In anestesia generale, è stata utilizzata una fresa a corona per praticare un foro di fresa nell'area delle alterazioni atrofiche più pronunciate, rilevate dalla tomografia computerizzata o dalla risonanza magnetica, e in presenza di atrofia diffusa della sostanza grigia o bianca, il trapianto è stato introdotto nelle circonvoluzioni precentrali e centrali del cervello. Dopo aver aperto la dura madre, frammenti di tessuto provenienti dalla corteccia sensomotoria di embrioni di 8-9 settimane sono stati impiantati intracorticalmente utilizzando un dispositivo speciale. Il numero di campioni di tessuto impiantati variava da 4 a 10, a seconda delle dimensioni del foro di fresa e delle dimensioni delle alterazioni locali nella sostanza cerebrale. A differenza di altri tipi di patologia, nella sindrome apallica gli autori hanno cercato di impiantare la maggior quantità possibile di tessuto embrionale nelle aree cerebrali più accessibili. La dura madre è stata suturata ed è stato eseguito un intervento di chirurgia plastica del difetto cranico. Durante l'operazione, tutti i pazienti hanno mostrato alterazioni significative sia nella corteccia (atrofia, assenza di circonvoluzioni, alterazioni del colore e della pulsazione della sostanza cerebrale) sia nelle meningi (ispessimento della dura madre, significativo ispessimento della membrana aracnoidea con presenza di vasi sanguigni propri, fusione delle membrane con la sostanza cerebrale sottostante). Queste alterazioni erano più pronunciate nei pazienti con una storia di lesioni infiammatorie cerebrali. Nei pazienti sottoposti a ipossia del SNC, predominavano alterazioni atrofiche diffuse nella sostanza cerebrale, soprattutto nella corteccia, con un aumento dello spazio subaracnoideo, senza alterazioni significative nelle meningi. Metà dei pazienti presentava un aumento del sanguinamento dei tessuti molli, delle ossa e della sostanza cerebrale. Dopo l'operazione, entro sei mesi-tre anni, le condizioni sono migliorate in 16 pazienti e sono rimaste invariate in cinque. Sono state osservate dinamiche positive sia nella sfera motoria che in quella mentale. Il tono muscolare è diminuito in dieci pazienti, mentre in 11 pazienti è aumentata l'attività motoria (paresi diminuita,(coordinazione dei movimenti migliorata), in cinque bambini la capacità manipolativa degli arti superiori è aumentata significativamente. In quattro pazienti, la frequenza e la gravità delle crisi epilettiche sono diminuite e in un bambino non si sono verificate affatto crisi durante l'intero periodo di osservazione dopo l'operazione. L'aggressività è diminuita in due bambini, in due pazienti con gravi disturbi bulbari è migliorata la capacità di deglutire, due bambini erano in grado di masticare autonomamente già 2 settimane dopo l'operazione. È stata notata una diminuzione della gravità dei disturbi mentali, nove bambini sono diventati più calmi dopo l'operazione, il sonno e l'attenzione sono migliorati in sette pazienti. Tre pazienti con conseguenze della sindrome apallica hanno iniziato a riconoscere i loro genitori, uno a seguire le istruzioni, due a pronunciare parole, in tre il grado di disartria è diminuito. Gli autori osservano che un notevole miglioramento delle condizioni dei pazienti inizia 2 mesi dopo l'operazione, raggiunge il massimo entro 5-6 mesi, quindi il tasso di miglioramento rallenta e entro la fine dell'anno il processo si stabilizza nel 50% dei pazienti. L'effetto positivo del neurotrapianto è servito da base per un intervento ripetuto in sei pazienti con conseguenze della sindrome apallica, ma sull'altro emisfero cerebrale. La tecnica e i metodi del secondo trapianto erano identici a quelli del primo intervento, ma l'effetto clinico del secondo intervento è stato inferiore, sebbene non si siano verificate gravi complicazioni né dopo il primo né dopo il secondo intervento chirurgico. Secondo gli autori, il meccanismo dell'effetto terapeutico del neurotrapianto è associato all'effetto neurotrofico del tessuto nervoso embrionale trapiantato, che contiene un gran numero di sostanze di crescita, ormonali e altre sostanze biologicamente attive che stimolano la riparazione dei neuroni danneggiati e la riorganizzazione plastica del tessuto cerebrale del ricevente. È anche possibile un effetto attivante sull'attività delle cellule nervose precedentemente morfologicamente conservate, ma che hanno perso la loro attività funzionale a causa della malattia. È il rapido effetto neurotrofico che può spiegare il miglioramento delle funzioni bulbari in alcuni bambini già alla fine della prima o della seconda settimana dopo l'intervento. Si presume inoltre che, entro il terzo o quarto mese, si stabiliscano connessioni morfofunzionali tra il trapianto e il cervello dell'ospite, attraverso le quali il neurotrapianto sostituisce le funzioni delle cellule cerebrali morte, che rappresentano il substrato per il miglioramento sia delle funzioni motorie che mentali dei pazienti. Due bambini erano in grado di masticare autonomamente già 2 settimane dopo l'operazione. È stata osservata una riduzione della gravità dei disturbi mentali, nove bambini sono diventati più calmi dopo l'operazione, il sonno e l'attenzione sono migliorati in sette pazienti. Tre pazienti con conseguenze della sindrome apallica hanno iniziato a riconoscere i genitori, uno a seguire le istruzioni, due a pronunciare parole.In tre casi, il grado di disartria è diminuito. Gli autori osservano che un miglioramento evidente delle condizioni dei pazienti inizia 2 mesi dopo l'operazione, raggiunge il massimo entro 5-6 mesi, quindi il tasso di miglioramento rallenta e entro la fine dell'anno il processo si stabilizza nel 50% dei pazienti. L'effetto positivo del neurotrapianto è servito da base per un intervento ripetuto in sei pazienti con conseguenze della sindrome apallica, ma sull'altro emisfero cerebrale. La tecnica e il metodo del secondo trapianto erano identici a quelli del primo intervento, ma l'effetto clinico del secondo intervento è stato inferiore, sebbene non si siano verificate gravi complicazioni né dopo il primo né dopo il secondo intervento chirurgico. Secondo gli autori, il meccanismo dell'effetto terapeutico del neurotrapianto è associato all'effetto neurotrofico del tessuto nervoso embrionale trapiantato, che contiene un gran numero di sostanze di crescita, ormonali e altre sostanze biologicamente attive che stimolano la riparazione dei neuroni danneggiati e la riorganizzazione plastica del tessuto cerebrale del ricevente. È anche possibile un effetto attivante sull'attività delle cellule nervose precedentemente morfologicamente conservate, ma che hanno perso la loro attività funzionale a causa della malattia. È proprio il rapido effetto neurotrofico che può spiegare il miglioramento delle funzioni bulbari in alcuni bambini già alla fine della prima o seconda settimana dopo l'intervento. Si presume che, parallelamente, entro il terzo o quarto mese si stabiliscano connessioni morfofunzionali tra il trapianto e il cervello dell'ospite, attraverso le quali il neurotrapianto sostituisce le funzioni delle cellule cerebrali morte, che rappresentano il substrato per il miglioramento delle funzioni motorie e mentali dei pazienti. Due bambini erano in grado di masticare autonomamente già 2 settimane dopo l'operazione. È stata osservata una riduzione della gravità dei disturbi mentali, nove bambini sono diventati più calmi dopo l'operazione, il sonno e l'attenzione sono migliorati in sette pazienti. Tre pazienti con le conseguenze della sindrome apallica hanno iniziato a riconoscere i genitori, uno a seguire le istruzioni, due a pronunciare parole, in tre il grado di disartria è diminuito. Gli autori osservano che un miglioramento significativo delle condizioni dei pazienti inizia 2 mesi dopo l'operazione, raggiunge il massimo entro 5-6 mesi, per poi rallentare e stabilizzarsi entro la fine dell'anno nel 50% dei pazienti. L'effetto positivo del neurotrapianto è servito da base per un intervento ripetuto in sei pazienti con sindrome apallica, ma a carico dell'altro emisfero cerebrale. La tecnica e il metodo del secondo trapianto erano identici a quelli del primo intervento, ma l'effetto clinico del secondo intervento è stato inferiore, sebbene non si siano verificate gravi complicazioni né dopo il primo né dopo il secondo intervento chirurgico. Secondo gli autori,Il meccanismo dell'effetto terapeutico del neurotrapianto è associato all'effetto neurotrofico del tessuto nervoso embrionale trapiantato, che contiene un gran numero di sostanze di crescita, ormonali e altre sostanze biologicamente attive che stimolano la riparazione dei neuroni danneggiati e la riorganizzazione plastica del tessuto cerebrale del ricevente. È anche possibile un effetto attivante sull'attività delle cellule nervose precedentemente morfologicamente conservate, ma che hanno perso la loro attività funzionale a causa della malattia. È proprio il rapido effetto neurotrofico che può spiegare il miglioramento delle funzioni bulbari in alcuni bambini già alla fine della prima o seconda settimana dopo l'intervento. Si presume che, parallelamente, entro il terzo o quarto mese, si stabiliscano connessioni morfofunzionali tra il trapianto e il cervello dell'ospite, attraverso le quali il neurotrapianto sostituisce le funzioni delle cellule cerebrali morte, che rappresentano il substrato per il miglioramento delle funzioni motorie e mentali dei pazienti, sebbene non si siano verificate gravi complicazioni dopo il primo o il secondo intervento chirurgico. Secondo gli autori, il meccanismo dell'effetto terapeutico del neurotrapianto è associato all'effetto neurotrofico del tessuto nervoso embrionale trapiantato, che contiene un gran numero di sostanze di crescita, ormonali e altre sostanze biologicamente attive che stimolano la riparazione dei neuroni danneggiati e la riorganizzazione plastica del tessuto cerebrale del ricevente. È anche possibile un effetto attivante sull'attività delle cellule nervose precedentemente morfologicamente conservate, ma che hanno perso la loro attività funzionale a causa della malattia. È proprio il rapido effetto neurotrofico che può spiegare il miglioramento delle funzioni bulbari in alcuni bambini già alla fine della prima o della seconda settimana dopo l'intervento. Si presume che, parallelamente, entro il terzo o quarto mese, si stabiliscano connessioni morfofunzionali tra il trapianto e il cervello dell'ospite, attraverso le quali il neurotrapianto sostituisce le funzioni delle cellule cerebrali morte, che rappresentano il substrato per il miglioramento sia delle funzioni motorie che mentali dei pazienti, sebbene non si siano verificate gravi complicazioni dopo il primo o il secondo intervento chirurgico. Secondo gli autori, il meccanismo dell'effetto terapeutico del neurotrapianto è associato all'effetto neurotrofico del tessuto nervoso embrionale trapiantato, che contiene un gran numero di sostanze di crescita, ormonali e altre sostanze biologicamente attive che stimolano la riparazione dei neuroni danneggiati e la riorganizzazione plastica del tessuto cerebrale del ricevente. È anche possibile un effetto attivante sull'attività delle cellule nervose precedentemente morfologicamente conservate, ma che hanno perso la loro attività funzionale a causa della malattia.È proprio il rapido effetto neurotrofico che può spiegare il miglioramento delle funzioni bulbari in alcuni bambini già alla fine della prima o seconda settimana dopo l'intervento. Si presume che, parallelamente, entro il terzo o quarto mese si stabiliscano connessioni morfofunzionali tra il trapianto e il cervello dell'ospite, attraverso le quali il neurotrapianto sostituisce le funzioni delle cellule cerebrali morte, che rappresentano il substrato per il miglioramento sia delle funzioni motorie che mentali dei pazienti.

L'effetto del trapianto di tessuto nervoso embrionale sulla riorganizzazione delle interconnessioni interneuronali è stato studiato sperimentalmente. Gli autori hanno studiato i modelli di ripristino delle connessioni assonali intermodulari nell'area di danno meccanico alla corteccia cerebrale in ratti bianchi con e senza trapianto di tessuto nervoso embrionale utilizzando il marcatore lipofilo fluorescente DIL (1,1-diottadecil-3,3,33'-tetrametilindocarbocianina perclorato) e la scansione laser confocale. Si è scoperto che l'introduzione di tessuto nervoso embrionale nell'area danneggiata garantisce la crescita degli assoni, che dopo il passaggio attraverso il trapianto si connettono con il tessuto cerebrale adiacente, mentre senza trapianto di tessuto nervoso embrionale l'area danneggiata rappresenta un ostacolo insormontabile per la crescita degli assoni. In questo lavoro, è stato eseguito il trapianto di neocorteccia embrionale (15-17° giorno di gestazione). I risultati ottenuti dagli autori costituiscono un'ulteriore prova a favore dell'influenza attiva del trapianto di tessuto nervoso embrionale sulla riorganizzazione post-traumatica delle relazioni interneuronali dei moduli strutturali e funzionali adiacenti della corteccia cerebrale. Il trapianto di tessuto nervoso embrionale consente il ripristino parziale delle connessioni tra le aree danneggiate della corteccia cerebrale, creando condizioni favorevoli per la crescita assonale nella zona d'azione dei fattori neurotrofici del trapianto. L'esistenza di tale effetto è stata dimostrata sperimentalmente ed è discussa in letteratura come prova delle elevate capacità plastiche del cervello danneggiato di animali sessualmente maturi. A questo proposito, il trapianto cellulare è attualmente considerato una strategia terapeutica ottimale per il ripristino della funzionalità del sistema nervoso centrale umano danneggiato.

I dati ottenuti dagli autori sull'efficacia dell'utilizzo del tessuto nervoso embrionale cerebrale come mezzo di trapianto esogeno per la crescita assonale confermano le prospettive di creazione mirata di collegamenti di comunicazione tra aree cerebrali adiacenti intatte. Il lavoro sullo studio dell'effetto del trapianto di tessuto nervoso sulla dinamica dei parametri funzionali del sistema nervoso centrale appare pertinente. L'obiettivo del lavoro era quello di studiare l'effetto del trapianto del locus coeruleus (LC) embrionale sugli indici morfofunzionali dei neuroni del LC e sull'attività locomotoria dei riceventi. I riceventi erano ratti Wistar femmina e i donatori erano embrioni di 18 giorni di ratti della stessa linea. Il trapianto di LC embrionale è stato eseguito nella cavità del terzo ventricolo cerebrale. Istologicamente, l'attecchimento dell'innesto è stato rilevato nel 75% degli animali riceventi. Nei casi di attecchimento, l'innesto era adiacente alla parete ventricolare, occupando 1/5-2/5 del suo lume, ed era vitale. A 1 e 6 mesi dall'intervento, il tessuto nervoso trapiantato, in base alle sue caratteristiche morfologiche, presentava strutture che si sarebbero formate durante il normale sviluppo ontogenetico, ovvero strutture LC. I dati ottenuti dagli autori indicano che negli animali in cui è stato trapiantato il tessuto LC embrionale, l'attività dinamica cambia e l'attività della matrice della cromatina dei nuclei delle cellule LC aumenta. Di conseguenza, l'attività dei neuroni della propria LC si intensifica, ma anche il trapianto innestato risulta funzionalmente attivo. È noto che la cosiddetta regione locomotoria del mesencefalo coincide praticamente con la localizzazione della LC. Gli autori ritengono che la base del cambiamento dell'attività motoria dei ratti riceventi sia l'attivazione delle cellule LC, sia proprie che del trapianto, con il rilascio di un'elevata quantità di noradrenalina, anche nei segmenti del midollo spinale. Si suppone quindi che l'aumento dell'attività motoria in condizioni di trapianto di LC nel cervello intatto degli animali sia dovuto alla presenza di un trapianto funzionalmente attivo, integrato con il cervello del ricevente e che contribuisce all'attivazione dell'attività locomotoria nei ratti.

Inoltre, è stato dimostrato che le cellule neuroepiteliali trapiantate dei rudimenti embrionali della neocorteccia e del midollo spinale sopravvivono e si differenziano in neuroblasti, neuroni giovani e maturi entro 1-2 mesi dal trapianto nel nervo sciatico danneggiato di ratti adulti. Studiando le dinamiche di sviluppo dei neuroni NADPH-positivi dei rudimenti embrionali della neocorteccia e del midollo spinale di ratti in allotrapianti eterotopici (embrione di ratto di 15 giorni), è stato rilevato un attecchimento del 70-80% dei neurotrapianti su sezioni longitudinali attraverso i nervi sciatici dei ratti riceventi, a seconda del periodo di osservazione. Neuroblasti uni- e bipolari con nuclei chiari arrotondati e uno o due nucleoli hanno iniziato a formarsi negli innesti una settimana dopo l'intervento chirurgico, accompagnati dalla formazione di cluster. Gli autori non sono riusciti a rilevare cellule contenenti NADPH diaforasi (NADPH-d) tra i neuroblasti. Dopo 7 giorni, solo gli elementi cellulari dei vasi sanguigni erano NADPH-positivi: le cellule endoteliali capillari nello spessore del trapianto, così come le cellule muscolari lisce ed endoteliali dei vasi del nervo sciatico del ricevente. Poiché nelle cellule muscolari lisce vascolari l'induzione della NO sintasi (NOS) avviene sotto l'influenza dell'IL-1, gli autori associano la comparsa di cellule muscolari lisce NADPH-positive nei vasi sanguigni del nervo sciatico alla presenza di IL-1 sintetizzata nei tronchi nervosi danneggiati. È noto che la neurogenesi in condizioni di trapianto di rudimenti cerebrali embrionali avviene in sincronia con lo sviluppo dei neuroni in situ. I risultati degli studi morfologici indicano che la differenziazione di alcuni elementi neurali dei trapianti sette giorni dopo il trapianto corrisponde alla differenziazione delle cellule in parti analoghe del cervello di ratti neonati. Pertanto, in condizioni di trapianto eterotopico nel nervo periferico, le cellule nervose embrionali trapiantate mostrano la capacità di sintetizzare NADPH-d. In questo caso, nei trapianti di midollo spinale si trovano più neuroni contenenti NADPH-β rispetto ai trapianti di neocorteccia, ma la sintesi di ossido nitrico inizia nei neuroni trapiantati più tardi rispetto allo sviluppo in situ. Nel sistema nervoso centrale dei vertebrati, le cellule NOS-positive compaiono già nel periodo prenatale. Si ritiene che l'NO promuova la formazione di connessioni sinaptiche nel cervello in via di sviluppo e la presenza di fibre nervose afferenti NOS-positive che forniscono la sintesi di NO nei neuroblasti cerebellari stimola la migrazione e la differenziazione dei neuroni, grazie alle quali si forma una normale citoarchitettura cerebrale. Un ruolo importante dell'NO nella sinapsogenesi è stato accertato nel tetto: solo i neuroni che presentavano connessioni sinaptiche con le cellule retiniche risultavano NOS-positivi.

È noto che l'ossido nitrico è uno dei regolatori dell'attività cerebrale, dove viene prodotto a partire dall'arginina sotto l'influenza della NO sintasi, che ha attività diaforasica. Nel sistema nervoso centrale, l'NO viene sintetizzato nelle cellule endoteliali dei vasi sanguigni, nella microglia, negli astrociti e nei neuroni di varie aree cerebrali. Dopo un trauma cranico, così come durante ipossia e ischemia, si osserva un aumento del numero di neuroni contenenti NO, che è uno dei regolatori del flusso ematico cerebrale. Data la capacità dell'NO di indurre la sinapsogenesi, lo studio della formazione di cellule contenenti NO in condizioni di neurotrapianto, in un contesto di danno traumatico al tessuto nervoso del ricevente, è di particolare interesse.

Non meno importante è lo studio dell'effetto del neurotrapianto sullo stereotipo del riflesso condizionato del comportamento. In esperimenti sullo studio dell'effetto del trapianto intracerebrale e a distanza (tra CII e CIII) di tessuto embrionale del locus coeruleus (17-19 giorni di gestazione) sui processi mnemonici e sul contenuto di catecolamine nei ratti con distruzione della neocorteccia frontotemporale, è stato dimostrato che il danno elettrolitico alla corteccia frontotemporale del cervello interrompe lo stereotipo della reazione emotiva riflessa condizionata di evitamento (memoria), indebolisce l'attività fisiologica, riduce il contenuto di noradrenalina nella zona della neocorteccia coagulata, ma ne aumenta il livello nell'ipotalamo, dove si osserva una diminuzione della concentrazione di adrenalina, sebbene la sua quantità nel sangue e nelle ghiandole surrenali aumenti.

In seguito al trapianto intracerebrale di tessuto embrionale del locus coeruleus, lo stereotipo della reazione di evitamento emotivo riflesso condizionato, interrotto dal danno elettrolitico alle regioni frontotemporali della corteccia cerebrale, viene ripristinato nell'81,4% degli animali, il contenuto di adrenalina nella formazione reticolare del mesencefalo, dell'ipotalamo e della neocorteccia viene normalizzato e il suo livello nell'ippocampo aumenta addirittura, il che si combina con una diminuzione della concentrazione di adrenalina nel sangue.

Il trapianto a distanza di tessuto embrionale del locus coeruleus non solo ripristina lo stereotipo alterato della reazione di evitamento emotivo riflessa condizionale nei ratti con danno elettrolitico alla corteccia frontotemporale, ma aumenta anche il contenuto di noradrenalina e adrenalina, principalmente nell'ipotalamo, nel sangue, nelle ghiandole surrenali e nel cuore. Si presume che ciò sia dovuto alla vascolarizzazione del trapianto, alla penetrazione dei neurotrasmettitori nel flusso sanguigno, al loro passaggio attraverso la barriera emato-encefalica e all'attivazione dei meccanismi di ricaptazione di adrenalina e noradrenalina da parte dei tipi di assorbimento 1, 2, 3. Gli autori ritengono che la stabilizzazione a lungo termine del livello di noradrenalina in condizioni di attecchimento e funzionalità del trapianto possa essere considerata un fenomeno di rilascio progressivo in dosi minime da parte dei neuroni del locus coeruleus.

Gli effetti clinici positivi del trapianto di tessuto nervoso embrionale possono anche essere dovuti alla capacità di quest'ultimo di influenzare i processi di neoplasia vascolare, alla cui regolazione partecipano direttamente fattori di crescita e citochine. La vasculogenesi è attivata dai fattori di crescita angiogenici - fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), FGF, PDGF e TGF - che vengono sintetizzati durante l'ischemia, che funge da momento iniziale dell'angiogenesi. È stato dimostrato che l'esaurimento del potenziale di crescita vascolare si verifica durante il processo di invecchiamento dell'organismo, il quale svolge un ruolo significativo nella patogenesi di malattie come la cardiopatia coronarica e l'aterosclerosi obliterante degli arti inferiori. L'ischemia tissutale si sviluppa anche in molte altre patologie. L'introduzione di fattori angiogenici nelle zone ischemiche (angiogenesi terapeutica) stimola la crescita dei vasi sanguigni nei tessuti ischemici e migliora la microcircolazione grazie allo sviluppo di circoli collaterali, che a sua volta aumenta l'attività funzionale dell'organo interessato.

VEGF e FGF sono considerati i più promettenti per l'uso clinico. I risultati dei primi studi randomizzati sono stati incoraggianti, soprattutto se i dosaggi e i metodi di somministrazione ottimali dei fattori angiogenici sono stati scelti correttamente. A questo proposito, è stata condotta una valutazione sperimentale dell'attività angiogenica di un estratto isolato da tessuto cerebrale embrionale umano. Il lavoro ha utilizzato materiale abortivo ottenuto alla ventesima settimana di gravidanza e processato secondo il metodo di I. Maciog et al. (1979) modificato dall'IC ANRF. Questo farmaco è un analogo dell'"integratore per la crescita delle cellule endoteliali" ("Sigma") ed è una miscela naturale di fattori angiogenici umani, che include VEGF e FGF. Gli esperimenti sono stati condotti su ratti con modelli di ischemia degli arti posteriori e del tessuto miocardico. Sulla base dello studio dell'attività della fosfatasi alcalina in animali da esperimento a cui è stato somministrato l'estratto di tessuto nervoso embrionale, è stato riscontrato un aumento del numero di capillari per unità di area del miocardio, sia nelle sezioni longitudinali che trasversali del cuore. L'attività angiogenica del preparato si è manifestata sia con la somministrazione diretta nella zona ischemica, sia con la somministrazione sistemica (intramuscolare), che ha portato a una diminuzione dell'area media della cicatrice post-infartuale.

In qualsiasi variante di trapianto di tessuto nervoso embrionale, è estremamente importante selezionare correttamente l'età gestazionale del materiale embrionale trapiantato. L'analisi comparativa dell'efficienza di preparazioni cellulari provenienti dal mesencefalo ventrale embrionale di embrioni di ratto di 8, 14 e 16-17 giorni, tre mesi dopo il neurotrapianto intrastriatale, rispetto a ratti maturi con parkinsonismo, nel test automatizzato di asimmetria motoria indotta da apomorfina, ha rivelato un'efficienza significativamente maggiore delle preparazioni cellulari del SNC provenienti da embrioni di 8 giorni e la più bassa efficienza da tessuto nervoso embrionale di 16-17 giorni. I dati ottenuti sono correlati con i risultati dell'analisi istomorfologica, in particolare con le dimensioni dei trapianti, la gravità della reazione gliale e il numero di neuroni dopaminergici in essi contenuti.

Le differenze nell'effetto terapeutico delle cellule del tessuto nervoso embrionale possono essere associate sia al grado di immaturità e di impegno delle cellule stesse, sia alle loro diverse risposte ai fattori di crescita rilasciati nell'area di danno indotto ai neuroni dopaminergici. In particolare, l'effetto di EGF e FGF2 sullo sviluppo delle cellule staminali neurali telencefaliche in vivo si verifica in diverse fasi dell'embriogenesi. Le cellule neuroepiteliali di embrioni di topo di 8,5 giorni, coltivate in vitro in un terreno privo di siero, proliferano in presenza di FGF2, ma non di EGF, a cui rispondono solo popolazioni di cellule staminali isolate dal cervello di embrioni in fasi successive di sviluppo. Allo stesso tempo, le cellule staminali neurali proliferano in risposta a ciascuno di questi mitogeni e migliorano in modo additivo la crescita nel caso di aggiunta di EGF e FGF2 a una coltura con una bassa densità di semina cellulare. Le cellule staminali neurali reattive all'EGF provenienti dalle zone germinali di embrioni di topo di 14,5 giorni di vita sono considerate discendenti lineari delle cellule staminali neurali reattive all'FGF che compaiono per la prima volta dopo 8,5 giorni di gestazione. Il fenotipo potenziale delle cellule staminali e progenitrici neurali dipende dal complesso effetto del loro microambiente. L'immunofenotipizzazione delle cellule neurali provenienti dalle zone periventricolare e ippocampale di embrioni umani di 8-12 e 17-20 settimane di vita mediante citofluorimetria a flusso ha rivelato una significativa variabilità associata sia all'età gestazionale che alle caratteristiche costituzionali individuali del biomateriale del donatore. Quando queste cellule progenitrici neurali vengono coltivate in un terreno selettivo privo di siero con EGF, FGF2 e NGF, le neurosfere si formano a una velocità che dipende significativamente dall'età gestazionale. Cellule provenienti da diverse parti del cervello di embrioni umani di 5-13 settimane, coltivate brevemente con FGF2 in coltura monostrato su un substrato di laminina in presenza di tracce di fattori di crescita, mantengono la proliferazione per 6 settimane con un'alta percentuale di cellule positive alla nestina, sullo sfondo della formazione spontanea di cellule con marcatori di tutte e tre le linee di differenziazione neurale. Cellule isolate dal mesencefalo di un embrione umano con un periodo di gestazione superiore alle 13 settimane proliferano sotto l'influenza di EGF e formano anche neurosfere. Un effetto sinergico è stato ottenuto utilizzando una combinazione di EGF e FGF2. La proliferazione più intensa di cellule staminali neurali con formazione di neurosfere si osserva quando si coltiva il tessuto della corteccia cerebrale di embrioni umani di 6-8 settimane in presenza di EGF2, IGF1 e siero di cavallo al 5% su un substrato con fibronectina.

È importante notare che le questioni relative all'età gestazionale e alla sezione del SNC embrionale, il cui tessuto è preferibile utilizzare per il neurotrapianto, rimangono aperte. Le risposte a queste domande vanno ricercate nella neurogenesi del cervello in via di sviluppo, che continua per tutto il periodo prenatale, in un momento in cui l'epitelio del tubo neurale forma una struttura multistrato. Si ritiene che la fonte di cellule staminali e nuovi neuroni sia la glia radiale, costituita da cellule allungate con lunghi processi diretti radialmente rispetto alla parete delle vescicole cerebrali e a contatto con la superficie interna dei ventricoli e la superficie piale esterna della parete cerebrale. In precedenza, la glia radiale era dotata solo della funzione di tratto neuronale lungo il quale i neuroblasti migrano dalla regione ventrale alle sezioni superficiali, e le veniva anche assegnato un ruolo scheletrico nel processo di formazione della corretta organizzazione laminare della corteccia. Oggi è stato accertato che, con il procedere dello sviluppo, la glia radiale transdifferenzia in astrociti. Nei mammiferi, una parte significativa di essa si riduce subito dopo la nascita, tuttavia, nelle specie animali in cui la glia radiale è conservata fino all'età adulta, la neurogenesi avviene attivamente nel periodo postnatale.

In coltura, le cellule gliali radiali provenienti dalla neocorteccia embrionale dei roditori hanno formato neuroni e cellule gliali, con i neuroni che si formano prevalentemente tra il 14° e il 16° giorno di gestazione dello sviluppo embrionale (il periodo di massima intensità della neurogenesi nella corteccia cerebrale di topi e ratti). Al 18° giorno di embriogenesi, la differenziazione si è spostata verso la formazione di astrociti, con una significativa diminuzione del numero di neuroni neoformati. La marcatura in situ delle cellule gliali radiali con GFP ha permesso di rilevare una divisione asimmetrica delle cellule marcate nella cavità delle vescicole cerebrali di embrioni di ratto di 15-16 giorni, con la comparsa di cellule figlie con caratteristiche immunologiche ed elettrofisiologiche dei neuroblasti. È interessante notare che, secondo i risultati delle osservazioni dinamiche, i neuroblasti emergenti utilizzano la cellula madre delle cellule gliali radiali per la migrazione verso la superficie piale.

Il marcatore endogeno della glia radiale è la proteina del filamento intermedio nestina. Utilizzando il metodo di ordinamento a flusso fluorescente di cellule marcate con un retrovirus associato a GFP ed espresse sotto il controllo della nestina, è stato dimostrato che le cellule staminali del giro dentato e dell'ilo dell'ippocampo umano (il materiale è stato ottenuto durante interventi chirurgici per l'epilessia) esprimono nestina. Pertanto, appartengono alla glia radiale, che nell'uomo, come in altri mammiferi, è conservata solo nel giro dentato.

Allo stesso tempo, l'efficacia del trapianto cellulare è determinata non solo dall'elevata vitalità delle cellule donatrici, dal loro potenziale di differenziazione e dalla capacità di sostituire le cellule difettose, ma soprattutto dalla loro migrazione mirata. La piena integrazione funzionale delle cellule trapiantate dipende dalla loro capacità di migrazione, senza alterare la citoarchitettura cerebrale del ricevente. Poiché la glia radiale subisce una riduzione pressoché completa nel periodo postnatale, è stato necessario scoprire come le cellule donatrici possano spostarsi dalla zona del trapianto al sito del danno cerebrale nei riceventi adulti. Esistono due varianti di migrazione cellulare verso il SNC che non dipendono dalla glia radiale: il fenomeno della migrazione tangenziale, ovvero il movimento dei neuroblasti durante lo sviluppo della corteccia cerebrale perpendicolare alla rete gliale radiale, e la migrazione "in fila" o "a catena". In particolare, la migrazione delle cellule progenitrici neurali dalla zona subventricolare rostrale al bulbo olfattivo avviene come una sequenza di cellule strettamente adiacenti circondate da cellule gliali. Si ritiene che queste cellule utilizzino cellule partner come substrato per la migrazione e che il principale regolatore di tali interazioni intercellulari sia il PSA-NCAM (molecola di adesione neuronale polisialilata). Pertanto, la migrazione neuronale non richiede necessariamente la partecipazione della glia radiale o di connessioni assonali preesistenti. La forma extraradiale del movimento cellulare, a "corda", lungo il tratto di migrazione rostrale, viene mantenuta per tutta la vita, il che indica una reale possibilità di veicolazione mirata di cellule progenitrici neuronali trapiantate nel sistema nervoso maturo.

Esiste un'ipotesi sulla presenza di una linea di cellule staminali nell'ontogenesi del cervello, secondo la quale, nelle fasi precoci dello sviluppo cerebrale, la cellula staminale è una cellula neuroepiteliale che, maturando, transdifferenzia in glia radiale. Nell'età adulta, il ruolo delle cellule staminali è svolto da cellule che presentano le caratteristiche degli astrociti. Nonostante una serie di punti controversi (contraddizioni riguardanti le cellule staminali dell'ippocampo, così come le regioni profonde del cervello che non presentano una corteccia stratificata e si sviluppano dai tubercoli talamici, dove la glia radiale è assente), un concetto chiaro e semplice di un cambiamento costante nel fenotipo delle cellule staminali durante l'ontogenesi appare molto attraente.

L'influenza dei fattori microambientali sulla determinazione e la successiva differenziazione delle cellule neurali differenziate è stata chiaramente dimostrata dal trapianto di cellule staminali mature del midollo spinale di ratto in diverse regioni del sistema nervoso maturo. Quando le cellule staminali venivano trapiantate nel giro dentato o nella regione di migrazione neuronale nei bulbi olfattivi, si osservava una migrazione attiva delle cellule trapiantate, con la formazione di numerosi neuroni. Il trapianto di cellule staminali nel midollo spinale e nella regione del corno di Ammone ha portato alla formazione di astrociti e oligodendrociti, mentre il trapianto nel giro dentato ha portato alla formazione non solo di cellule gliali, ma anche di neuroni.

In un ratto adulto, il numero di cellule in divisione nel giro dentato può raggiungere diverse migliaia al giorno, meno dell'1% del numero totale di cellule granulari. I neuroni rappresentano il 50-90% delle cellule, gli astociti e altri elementi gliali circa il 15%. Le cellule rimanenti non presentano caratteristiche antigeniche di neuroni e glia, ma contengono antigeni delle cellule endoteliali, il che indica una stretta relazione tra neurogenesi e angiogenesi nel giro dentato. I sostenitori della possibilità di differenziazione delle cellule endoteliali in cellule precursori neuronali fanno riferimento alla capacità delle cellule endoteliali in vitro di sintetizzare BDNF.

La velocità di autoassemblaggio dei circuiti neurali è impressionante: durante la differenziazione, le cellule precursori delle cellule granulari migrano verso il giro dentato e formano processi che crescono verso la zona SAZ del corno di Ammone, formando sinapsi con i neuroni glutamatergici piramidali e i neuroni inibitori intercalari. Le cellule granulari di nuova creazione vengono integrate nei circuiti neurali esistenti entro 2 settimane e le prime sinapsi compaiono già 4-6 giorni dopo la comparsa delle nuove cellule. Con la somministrazione frequente di BrdU o 3H-timidina (uno dei metodi per l'identificazione delle cellule staminali adulte) ad animali maturi, è stato riscontrato un gran numero di neuroni e astrociti marcati nel corno di Ammone, il che indica la possibilità di formare nuovi neuroni non solo nel giro dentato, ma anche in altre parti dell'ippocampo. L'interesse per i processi di divisione, differenziazione e morte cellulare nel giro dentato dell'ippocampo del cervello maturo è dovuto anche al fatto che i neuroni qui formati sono localizzati in una delle aree chiave dell'ippocampo, responsabile dei processi di apprendimento e memoria.

Pertanto, oggi è stato stabilito che le cellule progenitrici neurali originano dalle cellule della zona subependimale del ventricolo laterale dei roditori adulti. Migrano lungo il tratto di migrazione rostrale formato da cellule astrogliali orientate longitudinalmente fino al bulbo olfattivo, dove si immergono nello strato di cellule granulari e si differenziano in neuroni di questa struttura. La migrazione delle cellule progenitrici neurali è stata rilevata nel tratto di migrazione rostrale di scimmie adulte, il che indica la possibilità di formare nuovi neuroni nel bulbo olfattivo dei primati. Cellule staminali neurali sono state isolate dal bulbo olfattivo di un essere umano adulto e trasferite in linee, le cui cellule clonate si differenziano in neuroni, astrociti e oligodendrociti. Cellule staminali sono state trovate nell'ippocampo del cervello maturo di ratti, topi, scimmie ed esseri umani. Le cellule staminali neurali della zona subgranulare della fascia dentata sono una fonte di cellule progenitrici che migrano verso le estremità mediali e laterali dell'ippocampo, dove si differenziano in cellule granulari mature ed elementi gliali. Gli assoni dei neuroni neoformati della fascia dentata sono rintracciati nel campo CA3, il che indica la partecipazione dei neuroni neoformati all'implementazione delle funzioni ippocampali. Nelle aree associative della neocorteccia delle scimmie adulte sono state riscontrate cellule progenitrici neuronali che migrano dalla zona subventricolare. Nello strato VI della neocorteccia del cervello di topo, nuovi neuroni piramidali vengono rilevati 2-28 settimane dopo il danno indotto e la morte dei neuroni nativi di questo strato, a causa della migrazione di cellule progenitrici precedentemente dormienti della zona subventricolare. Infine, la realtà della neurogenesi postnatale nel cervello umano è dimostrata da un raddoppio del numero di neuroni corticali, che continua durante i primi 6 anni dopo la nascita.

Di non poca importanza per la pratica del trapianto cellulare è la questione della regolazione dei processi di riproduzione e differenziazione delle cellule staminali e progenitrici neurali. I fattori più importanti che inibiscono la proliferazione delle cellule progenitrici neurali sono i glucocorticoidi, che riducono drasticamente il numero di divisioni, mentre l'asportazione delle ghiandole surrenali, al contrario, aumenta significativamente il numero di mitosi (Gould, 1996). È interessante notare che la morfogenesi del giro dentato nei roditori è più intensa durante le prime due settimane di sviluppo postnatale, durante il periodo di assenza di reazione allo stress, sullo sfondo di una forte diminuzione della produzione e secrezione di ormoni steroidei della corteccia surrenale. I corticosteroidi inibiscono la migrazione delle cellule granulari: i nuovi neuroni non si incorporano nello strato granulare del giro dentato, ma rimangono nell'ilo. Si presume che i processi di formazione delle connessioni sinaptiche vengano simultaneamente interrotti. La protezione delle cellule da tale "aggressione steroidea" è assicurata da una minima espressione di recettori mineralcorticoidi e glucocorticoidi sulle cellule granulari in proliferazione non solo durante lo sviluppo del giro dentato, ma anche negli animali adulti. Tuttavia, tra tutti i neuroni del cervello, sono i neuroni dell'ippocampo a essere caratterizzati dal più alto contenuto di recettori glucocorticoidi, che causa l'effetto stressante sull'ippocampo. Lo stress psicoemotivo e le situazioni stressanti inibiscono la neurogenesi, e lo stress cronico riduce drasticamente la capacità degli animali di acquisire nuove competenze e di apprendere. Un effetto negativo più pronunciato dello stress cronico sulla neurogenesi è del tutto comprensibile se si considera lo stato prevalentemente dormiente delle cellule staminali neurali. Immobilizzando ratti gravidi (per i roditori, un fattore di stress estremamente forte), si è scoperto che anche lo stress prenatale causa una diminuzione del numero di cellule nel giro dentato e inibisce significativamente la neurogenesi. È noto che i glucocorticoidi partecipano alla patogenesi degli stati depressivi, il cui equivalente morfologico è l'inibizione della neurogenesi, la riorganizzazione patologica dei neuroni e delle connessioni interneuronali e la morte delle cellule nervose. D'altra parte, gli agenti chemioterapici antidepressivi attivano la formazione di neuroni de novo, il che conferma la connessione tra i processi di formazione di nuovi neuroni nell'ippocampo e lo sviluppo della depressione. Gli estrogeni hanno un effetto significativo sulla neurogenesi, i cui effetti sono opposti all'azione dei glucocorticosteroidi e consistono nel supportare la proliferazione e la vitalità delle cellule progenitrici neurali. È importante notare che gli estrogeni aumentano significativamente la capacità di apprendimento degli animali. Alcuni autori associano le variazioni cicliche del numero di cellule granulari e il loro eccesso nelle femmine all'influenza degli estrogeni.

È noto che la neurogenesi è controllata da EGF, FGF e BDNF, tuttavia, i meccanismi dell'effetto dei segnali esterni sulle cellule staminali provenienti da mitogeni e fattori di crescita non sono stati sufficientemente studiati. È stato stabilito che il PDGF in vitro mantiene la direzione neuronale della differenziazione delle cellule progenitrici e che il fattore neurotrofico ciliare (CNTF), come la triiodotironina, stimola la formazione di elementi prevalentemente gliali: astrociti e oligodendrociti. La proteina attivante l'adenilato ciclasi ipofisaria (PACAP) e il peptide intestinale vasoattivo (VIP) attivano la proliferazione delle cellule progenitrici neurali, ma allo stesso tempo inibiscono i processi di differenziazione delle cellule figlie. Gli oppioidi, soprattutto in caso di esposizione a lungo termine, inibiscono significativamente la neurogenesi. Tuttavia, i recettori degli oppioidi non sono stati identificati nelle cellule staminali e nelle cellule progenitrici neurali del giro dentato (sono presenti nei neuroni in via di differenziazione del periodo embrionale), il che non consente di valutare gli effetti diretti degli oppioidi.

Le esigenze della medicina plastica rigenerativa pratica hanno costretto i ricercatori a prestare particolare attenzione allo studio della pluripotenza e multipotenza delle cellule staminali. L'implementazione di queste proprietà a livello delle cellule staminali regionali di un organismo adulto potrebbe in futuro garantire la produzione del materiale necessario per i trapianti. È stato dimostrato in precedenza che la stimolazione epigenetica delle cellule staminali neurali consente di ottenere cellule proliferanti già preformate secondo i fenotipi neurali, il che ne limita il numero. Nel caso in cui si utilizzino le proprietà totipotenti di una cellula staminale embrionale, la proliferazione fino all'ottenimento di un numero sufficiente di cellule avviene prima della differenziazione neurale e le cellule moltiplicate vengono facilmente convertite in un fenotipo neurale. Per ottenere cellule staminali neurali, le ESC vengono isolate dalla massa cellulare interna della blastocisti e coltivate in presenza obbligatoria di LIF, che preserva la loro totipotenza e la capacità di divisione illimitata. Successivamente, la differenziazione neurale delle ESC viene indotta utilizzando acido retinoico. Il trapianto delle cellule staminali neurali risultanti nello striato danneggiato da chinolina e 6-idrossidopamina è accompagnato dalla loro differenziazione in neuroni dopaminergici e serotoninergici. Dopo l'iniezione nei ventricoli del cervello embrionale di ratto, le cellule progenitrici neurali derivate dalle ESC migrano verso varie regioni del cervello ricevente, tra cui corteccia, striato, setto, talamo, ipotalamo e cervelletto. Le cellule rimanenti nella cavità ventricolare formano strutture epiteliali simili a un tubo neurale, nonché singole isole di tessuto non neurale. Nel parenchima cerebrale dell'embrione ricevente, le cellule trapiantate producono i tre principali tipi cellulari del sistema nervoso. Alcune di esse presentano dendriti apicali allungati, corpi cellulari piramidali e assoni basali che si proiettano nel corpo calloso. Gli astrociti di origine donatrice estendono i processi ai capillari adiacenti, e gli oligodendrociti sono strettamente a contatto con le membrane mieliniche, partecipando alla formazione della mielina. Pertanto, le cellule progenitrici neurali ottenute dalle cellule staminali embrionali (ESC) in vitro sono capaci di migrazione diretta e differenziazione regionale adeguata ai segnali microambientali, fornendo neuroni e glia a molte aree del cervello in via di sviluppo.

Alcuni autori considerano la possibilità di de- e transdifferenziazione delle cellule staminali regionali di un organismo adulto. Una conferma indiretta della dedifferenziazione cellulare in coltura con espansione del loro potenziale è fornita dai dati sull'attecchimento di cellule staminali neurali di topo nel midollo osseo rosso con successivo sviluppo di linee cellulari da esse derivanti, che hanno prodotto cellule funzionalmente attive del sangue periferico. Inoltre, il trapianto di cellule neurosferiche marcate geneticamente (LacZ) ottenute da cervello maturo o embrionale nel cervello di topi irradiati con emopoiesi soppressa ha portato alla formazione non solo di derivati neurali da cellule staminali, ma ha anche causato la generazione di cellule del sangue, il che indica la pluripotenza delle cellule staminali neurali, realizzata al di fuori del cervello. Pertanto, una cellula staminale neurale è in grado di differenziarsi in cellule del sangue sotto l'influenza di segnali provenienti dal microambiente del midollo osseo con trasformazione preliminare in una cellula staminale emopoietica. D'altra parte, trapiantando cellule staminali ematopoietiche del midollo osseo nel cervello, è stata stabilita la loro differenziazione in cellule gliali e neurali sotto l'influenza del microambiente del tessuto cerebrale. Di conseguenza, il potenziale di differenziazione delle cellule staminali neurali ed ematopoietiche non è limitato dalla specificità tissutale. In altre parole, fattori del microambiente locale, diversi da quelli caratteristici dei tessuti cerebrali e del midollo osseo, sono in grado di modificare la direzione di differenziazione di queste cellule. È stato dimostrato che le cellule staminali neurali introdotte nel sistema venoso di topi irradiati creano popolazioni di cellule mieloidi, linfoidi ed ematopoietiche immature nella milza e nel midollo osseo. In vitro, è stato stabilito l'effetto delle proteine morfogenetiche del midollo osseo (BMP) sulla sopravvivenza e la differenziazione delle cellule staminali neurali, determinandone, come nelle fasi precoci dell'embriogenesi, lo sviluppo in direzione neurale o gliale. Nelle colture di cellule staminali neurali da embrioni di ratto di 16 giorni, le BMP inducono la formazione di neuroni e astroglia, mentre nelle colture di cellule staminali derivate da cervello perinatale si formano solo astrociti. Inoltre, le BMP inibiscono la generazione di oligodendrociti, che compaiono in vitro solo con l'aggiunta dell'antagonista delle BMP, il noggin.

I processi di transdifferenziazione sono specie-specifici: le cellule staminali emopoietiche del midollo osseo umano trapiantate nello striato di ratti maturi migrano verso la sostanza bianca della capsula esterna, della neocorteccia ipsilaterale e controlaterale, dove formano elementi cellulari simili agli astrociti (Azizi et al., 1998). Quando le cellule staminali del midollo osseo vengono allotrapiantate nel ventricolo laterale di topi neonati, la migrazione delle cellule staminali emopoietiche può essere ricondotta alle strutture del proencefalo e del cervelletto. Nello striato e nello strato molecolare dell'ippocampo, le cellule migrate si trasformano in astrociti, e nel bulbo olfattivo, nello strato interno delle cellule granulari del cervelletto e nella formazione reticolare del tronco encefalico, formano cellule simili ai neuroni con una reazione positiva ai neurofilamenti. In seguito alla somministrazione endovenosa di cellule emopoietiche a topi adulti, microciti e astrociti marcati con GFP sono stati rilevati nella neocorteccia, nel talamo, nel tronco encefalico e nel cervelletto.

Inoltre, le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo, che danno origine a tutti i tipi di cellule del tessuto connettivo, possono anche subire transdifferenziazione neurale in determinate condizioni (ricordiamo che la fonte embrionale del mesenchima sono le cellule della cresta neurale). È stato dimostrato che le cellule stromali del midollo osseo umano e murino, coltivate in vitro in presenza di EGF o BDNF, esprimono il marcatore delle cellule progenitrici neurali nestina, e l'aggiunta di varie combinazioni di fattori di crescita porta alla formazione di cellule con marcatori della glia (GFAP) e dei neuroni (proteina nucleare, NeuN). Le cellule staminali mesenchimali singeniche marcate, trapiantate nel ventricolo laterale del cervello di topi neonati, migrano e si localizzano nel proencefalo e nel cervelletto senza alterare la citoarchitettura del cervello ricevente. Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo si differenziano in astrociti maturi nello striato e nello strato molecolare dell'ippocampo e popolano il bulbo olfattivo, gli strati granulari del cervelletto e la formazione reticolare, dove si trasformano in neuroni. Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo umano sono in grado di differenziarsi in macroglia in vitro e di integrarsi nelle strutture cerebrali di ratto dopo il trapianto. Il trapianto diretto di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo nell'ippocampo di ratti adulti è inoltre accompagnato dalla loro migrazione nel parenchima cerebrale e dalla differenziazione neurogliale.

Si presume che il trapianto di cellule staminali del midollo osseo possa ampliare le possibilità della terapia cellulare per le patologie del sistema nervoso centrale caratterizzate da un'eccessiva morte patologica dei neuroni. Va tuttavia notato che non tutti i ricercatori riconoscono il fatto della reciproca trasformazione delle cellule staminali neurali ed emopoietiche, soprattutto in vivo, ancora una volta a causa della mancanza di un marcatore affidabile per valutarne il transdifferenziamento e l'ulteriore sviluppo.

Il trapianto di cellule staminali apre nuovi orizzonti per la terapia genica cellulare delle patologie neurologiche ereditarie. La modificazione genetica delle cellule staminali neurali prevede l'inserimento di costrutti regolatori genetici, i cui prodotti interagiscono con le proteine del ciclo cellulare in modalità di regolazione automatica. La trasduzione di tali geni nelle cellule progenitrici embrionali viene utilizzata per moltiplicare le cellule staminali neurali. La maggior parte dei cloni cellulari geneticamente modificati si comporta come linee cellulari stabili, senza mostrare segni di trasformazione in vivo o in vitro, ma presenta una spiccata capacità di inibizione da contatto della proliferazione. Una volta trapiantate, le cellule trasfettate moltiplicate si integrano nel tessuto ricevente senza alterarne la citoarchitettura e senza subire trasformazione tumorale. Le cellule staminali neurali del donatore non deformano la zona di integrazione e competono alla pari per lo spazio con le cellule progenitrici dell'ospite. Tuttavia, al 2°-3° giorno, l'intensità di divisione delle cellule trasfettate diminuisce drasticamente, il che corrisponde all'inibizione da contatto della loro proliferazione in vitro. Gli embrioni riceventi di cellule staminali neurali trasfettate non presentano anomalie nello sviluppo del sistema nervoso centrale; tutte le aree cerebrali a contatto con il trapianto si sviluppano normalmente. Dopo il trapianto, i cloni di cellule staminali neurali migrano rapidamente dalla zona di iniezione e spesso superano le corrispondenti zone embrionali lungo il tratto rostrale, integrandosi adeguatamente con altre aree cerebrali. L'integrazione di cloni geneticamente modificati e linee cellulari trasfettate di cellule staminali neurali nel cervello dell'organismo ospite non è caratteristica solo del periodo embrionale: queste cellule vengono impiantate in numerose aree del sistema nervoso centrale del feto, del neonato, dell'adulto e persino dell'organismo ricevente anziano e dimostrano la capacità di un'adeguata integrazione e differenziazione. In particolare, dopo il trapianto nella cavità ventricolare del cervello, le cellule trasfettate migrano senza danneggiare la barriera emato-encefalica e diventano componenti cellulari funzionali integrali del tessuto cerebrale. I neuroni del donatore formano sinapsi appropriate ed esprimono canali ionici specifici. Preservando l'integrità della barriera emato-encefalica, l'astroglia, un derivato delle cellule staminali neurali transfettanti, estende i processi ai vasi cerebrali e gli oligodendrociti derivati dal donatore esprimono la proteina basica della mielina e mielinizzati i processi neuronali.

Inoltre, le cellule staminali neurali vengono trasfettate per essere utilizzate come vettori cellulari. Tali costrutti genetici-vettoriali forniscono un'espressione stabile in vivo di geni estranei coinvolti nello sviluppo del sistema nervoso, oppure vengono utilizzati per correggere difetti genetici esistenti, poiché i prodotti di questi geni sono in grado di compensare diverse anomalie biochimiche del sistema nervoso centrale. L'elevata attività di migrazione delle cellule staminali trasfettate e l'adeguato impianto nelle zone germinali di varie aree del cervello in via di sviluppo ci consentono di sperare in un completo ripristino della carenza ereditaria di enzimi cellulari. Nella modellazione della sindrome da atassia-telangiectasia (linee murine mutanti pg e pcd), le cellule di Purkinje scompaiono dal cervelletto di animali da esperimento durante le prime settimane di sviluppo postnatale. È stato dimostrato che l'introduzione di cellule staminali neurali nel cervello di tali animali è accompagnata dalla loro differenziazione in cellule di Purkinje e neuroni granulari. Nei mutanti pcd, i disturbi della coordinazione del movimento vengono parzialmente corretti e l'intensità del tremore si riduce. Risultati simili sono stati ottenuti trapiantando cellule staminali neurali umane clonate in primati in cui la degenerazione delle cellule di Purkinje è stata indotta utilizzando l'onconasi. Dopo il trapianto, le cellule staminali neurali del donatore sono state trovate negli strati granulare, molecolare e delle cellule di Purkinje del parenchima cerebellare. Pertanto, la modificazione genetica delle cellule progenitrici neurali può fornire una modificazione stabile e determinata del fenotipo, resistente alle influenze esterne. Ciò è particolarmente importante nei processi patologici associati allo sviluppo di fattori nel ricevente che impediscono la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule del donatore (ad esempio, durante l'aggressione immunitaria).

La mucopolisaccaridosi di tipo VII nell'uomo è caratterizzata da neurodegenerazione e progressiva disabilità intellettiva, che è modellata nei topi da una mutazione da delezione nel gene della beta-glucuronidasi. Dopo il trapianto di cellule staminali neurali trasfettate secernenti beta-glucuronidasi nei ventricoli cerebrali di topi riceventi neonati difettosi, le cellule donatrici si trovano dapprima nella zona terminale e poi si diffondono in tutto il parenchima cerebrale, correggendo stabilmente l'integrità dei lisosomi nel cervello dei topi mutanti. In un modello di malattia di Tay-Sachs, le cellule staminali neurali trasdotte con retrovirus, quando somministrate in utero a feti di topo e trapiantate in topi neonati, forniscono un'espressione efficiente della subunità beta della beta-esosaminidasi nei riceventi con una mutazione che porta all'accumulo patologico di beta2-ganglioside.

Un altro ambito della medicina rigenerativa è la stimolazione del potenziale proliferativo e differenziativo delle cellule staminali neurali del paziente. In particolare, le cellule staminali neurali secernono NT-3 durante l'emisezione del midollo spinale e l'asfissia cerebrale nei ratti, esprimono NGF e BDNF nel setto e nei gangli della base, tirosina idrossilasi nello striato, così come reelina nel cervelletto e proteina basica della mielina nel cervello.

Tuttavia, le problematiche relative alla stimolazione della neurogenesi non ricevono chiaramente sufficiente attenzione. Alcuni studi suggeriscono che il carico funzionale sui centri nervosi responsabili della distinzione degli odori si rifletta nella formazione di nuovi neuroni. Nei topi transgenici con deficit di molecole di adesione neuronale, una diminuzione dell'intensità della neurogenesi e una diminuzione del numero di neuroni che migrano verso i bulbi olfattivi si sono combinate con una compromissione della capacità di distinguere gli odori, sebbene la soglia di percezione degli odori e la memoria olfattiva a breve termine non siano state compromesse. Lo stato funzionale delle cellule del giro dentato svolge un ruolo importante nella regolazione della neurogenesi: un indebolimento dell'effetto del glutammato sulle cellule granulari dopo la distruzione della corteccia entorinale promuove la proliferazione e la differenziazione dei neuroni, mentre la stimolazione delle fibre della via perforante (il principale input afferente all'ippocampo) causa l'inibizione della neurogenesi. Gli antagonisti del recettore NMDA attivano i processi di formazione di nuovi neuroni, mentre gli agonisti, al contrario, riducono l'intensità della neurogenesi, che in effetti assomiglia all'azione dei glucocorticosteroidi. In letteratura si trovano risultati di ricerca contraddittori: le informazioni sull'effetto inibitorio, dimostrato sperimentalmente, del neurotrasmettitore eccitatorio glutammato sulla neurogenesi sono incoerenti con i dati sulla stimolazione della proliferazione delle cellule progenitrici e sulla comparsa di nuovi neuroni con un aumento dell'attività convulsiva nell'ippocampo di animali con modelli sperimentali di epilessia con caina e pilocarpina. Allo stesso tempo, nel modello tradizionale di epilessia causato da stimolazione multipla sottosoglia di una determinata area del cervello (kindling) e caratterizzato da morte neuronale meno pronunciata, l'intensità della neurogenesi aumenta solo nella fase tardiva del kindling, quando si osservano danni e morte neuronale nell'ippocampo. È stato dimostrato che nell'epilessia, l'attività convulsiva stimola la neurogenesi con localizzazione anomala di nuovi neuroni granulari, molti dei quali compaiono non solo nel giro dentato, ma anche nell'ilo. Questi neuroni sono di grande importanza nello sviluppo della germinazione delle fibre muscoidi, poiché i loro assoni formano collaterali inversi normalmente assenti che stabiliscono numerose sinapsi con le cellule granulari adiacenti.

L'utilizzo di cellule staminali neurali regionali apre nuove prospettive per l'applicazione del trapianto cellulare nel trattamento di malattie neurodegenerative metaboliche e genetiche, malattie demielinizzanti e disturbi post-traumatici del sistema nervoso centrale. Prima di eseguire il trapianto di cellule sostitutive secondo uno dei metodi, si procede alla selezione e all'espansione ex vivo del tipo desiderato di cellule progenitrici neurali, al fine di introdurle successivamente direttamente nell'area cerebrale danneggiata. L'effetto terapeutico in questo caso è dovuto alla sostituzione delle cellule danneggiate o al rilascio locale di fattori di crescita e citochine. Questo metodo di terapia plastica-rigenerativa richiede il trapianto di un numero sufficientemente elevato di cellule con caratteristiche funzionali predeterminate.

Ulteriori studi sulle caratteristiche molecolari e sul potenziale rigenerativo-plastico delle cellule staminali cerebrali mature, nonché sulla capacità di transdifferenziarsi delle cellule staminali regionali di diversa origine tissutale, dovrebbero essere considerati appropriati. Oggi è già stato effettuato lo screening di antigeni delle cellule staminali emopoietiche del midollo osseo, con la determinazione di una combinazione marcatrice di cellule capaci di transdifferenziarsi in cellule progenitrici staminali neurali (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Sono state ottenute cellule che formano neurosfere in vitro e neuroni quando trapiantate nel cervello di topi immunodeficienti neonati. Di interesse per la xenotrapiantologia cellulare sono i risultati di studi sulla possibilità di cross-trapianto di cellule staminali in individui di taxa evolutivamente distanti. I risultati dell'impianto di cellule staminali neurali nell'area del tumore cerebrale rimangono senza una corretta interpretazione: le cellule trapiantate migrano attivamente attraverso il volume tumorale senza oltrepassarne i limiti, e quando le cellule vengono introdotte nella parte intatta del cervello, si osserva la loro migrazione attiva verso il tumore. La questione del significato biologico di tale migrazione rimane aperta.

È importante notare che il trapianto di successo di cellule staminali neurali, così come di altre cellule progenitrici neurali ottenute da cellule staminali embrionali (ESC), è possibile solo utilizzando cellule progenitrici neurali altamente purificate, poiché le cellule staminali embrionali indifferenziate si trasformano inevitabilmente in teratomi e teratocarcinomi quando trapiantate in un ricevente adulto immunocompetente. Anche una quantità minima di cellule scarsamente differenziate nella sospensione cellulare del donatore aumenta notevolmente la tumorigenicità del trapianto e aumenta in modo inaccettabile il rischio di sviluppo tumorale o di formazione di tessuto non neurale. L'ottenimento di popolazioni omogenee di cellule progenitrici neurali è possibile utilizzando cellule che si formano in determinate fasi dell'embriogenesi normale come fonte alternativa di tessuto donato. Un altro approccio prevede l'attenta eliminazione delle popolazioni cellulari indesiderate mediante selezione specifica per lignaggio. Anche l'uso di ESC per il neurotrapianto dopo la loro insufficiente esposizione in vitro ai fattori di crescita è pericoloso. In questo caso, non si può escludere un fallimento del programma di differenziazione neurale con la formazione di strutture inerenti al tubo neurale.

Oggi è abbastanza ovvio che le cellule staminali neurali mostrano tropismo per le aree patologicamente alterate del sistema nervoso centrale e hanno un pronunciato effetto rigenerativo-plastico. Il microambiente nel sito di morte cellulare del tessuto nervoso modella la direzione di differenziazione delle cellule trapiantate, colmando così la carenza di specifici elementi neurali all'interno della zona di danno al SNC. In alcuni processi neurodegenerativi, si generano segnali neurogenici per la ricapitolazione della neurogenesi e le cellule staminali neurali del cervello maturo sono in grado di rispondere a queste informazioni istruttive. Numerosi dati sperimentali servono come chiara illustrazione del potenziale terapeutico delle cellule staminali neurali. La somministrazione intracisternale di un clone di cellule staminali neurali ad animali con legatura dell'arteria cerebrale media (un modello di ictus ischemico) aiuta a ridurre l'area e il volume dell'area cerebrale distruttivamente alterata, soprattutto nel caso del trapianto di cellule staminali neurali insieme a FGF2. Immunocitochimicamente, si osserva la migrazione delle cellule donatrici verso la zona ischemica con la loro successiva integrazione con le cellule cerebrali intatte del ricevente. Il trapianto di cellule immature della linea neuroepiteliale murina MHP36 nel cervello di ratti con ictus sperimentale migliora la funzione sensomotoria e l'introduzione di queste cellule nei ventricoli cerebrali migliora la funzione cognitiva. Il trapianto di cellule emopoietiche neurali preformate da midollo osseo umano nei ratti elimina la disfunzione della corteccia cerebrale causata da danno ischemico. In questo caso, le cellule progenitrici neurali xenogeniche migrano dal sito di iniezione alla zona di alterazioni distruttive del tessuto cerebrale. Il trapianto intracranico di cellule omologhe del midollo osseo in caso di danno traumatico alla corteccia cerebrale nei ratti porta al parziale ripristino della funzione motoria. Le cellule del donatore si attecchiscono, proliferano, subiscono la differenziazione neurale in neuroni e astrociti e migrano verso la lesione. Quando iniettate nello striato di ratti adulti con ictus sperimentale, le cellule staminali neurali umane clonate sostituiscono le cellule del sistema nervoso centrale danneggiate e ripristinano parzialmente la funzione cerebrale compromessa.

Le cellule staminali neurali umane vengono isolate principalmente dal telencefalo embrionale, che si sviluppa molto più tardi rispetto alle parti più caudalmente del tronco nervoso. È stata dimostrata la possibilità di isolare cellule staminali neurali dal midollo spinale di un feto umano di 43-137 giorni di vita, poiché in presenza di EGF e FGF2 queste cellule formano neurosfere e mostrano multipotenza nei passaggi precoci, differenziandosi in neuroni e astrociti. Tuttavia, la coltivazione a lungo termine delle cellule progenitrici neurali (oltre 1 anno) le priva della multipotenza: tali cellule sono in grado di differenziarsi solo in astrociti, ovvero diventano unipotenti. Le cellule staminali neurali regionali possono essere ottenute a seguito di bulbectomia parziale e, dopo la riproduzione in coltura in presenza di LIF, trapiantate nello stesso paziente con alterazioni neurodegenerative in altre parti del sistema nervoso centrale. In clinica, la terapia cellulare sostitutiva con cellule staminali neurali è stata eseguita per la prima volta per trattare pazienti con ictus accompagnato da danni ai gangli della base del cervello. Grazie al trapianto di cellule donatrici è stato riscontrato un miglioramento delle condizioni cliniche della maggior parte dei pazienti.

Alcuni autori ritengono che la capacità delle cellule staminali neurali di attecchire, migrare e integrarsi in diverse aree del tessuto nervoso in caso di danno al sistema nervoso centrale apra possibilità illimitate per la terapia cellulare di processi patologici non solo locali, ma anche estesi (ictus o asfissia), multifocali (sclerosi multipla) e persino globali (la maggior parte dei disturbi metabolici ereditari o delle demenze neurodegenerative). Infatti, quando cellule staminali neurali clonate di topo e di esseri umani vengono trapiantate in animali riceventi (rispettivamente topi e primati) con degenerazione dei neuroni dopaminergici nel sistema mesostriatale indotta dall'introduzione di metil-fenil-tetrapiridina (modello del morbo di Parkinson) 8 mesi prima del trapianto, le cellule staminali neurali del donatore si integrano nel sistema nervoso centrale del ricevente. Un mese dopo, le cellule trapiantate sono localizzate bilateralmente lungo il mesencefalo. Alcuni dei neuroni risultanti di origine del donatore esprimono la tirosina idrolasi in assenza di segni di reazione immunitaria al trapianto. Nei ratti a cui è stata somministrata 6-idrossidopamina (un altro modello sperimentale di morbo di Parkinson), l'adattamento delle cellule trapiantate al microambiente cerebrale dell'ospite è stato determinato dalle condizioni di coltura delle cellule staminali neurali prima del trapianto. Le cellule staminali neurali, in rapida proliferazione in vitro sotto l'influenza dell'EGF, hanno compensato la carenza di neuroni dopaminergici nello striato danneggiato in modo più efficace rispetto alle cellule provenienti da colture di 28 giorni. Gli autori ritengono che ciò sia dovuto alla perdita della capacità di percepire i corrispondenti segnali di differenziazione durante il processo di divisione cellulare delle cellule progenitrici neurali in vitro.

In alcuni studi, si è cercato di aumentare l'efficacia dell'impatto sui processi di reinnervazione dello striato danneggiato trapiantando cellule striato embrionali in quest'area come fonte di fattori neurotrofici con trapianto simultaneo di neuroni dopaminergici del mesencefalo ventrale. Come si è scoperto, l'efficacia del neurotrapianto dipende in larga misura dal metodo di introduzione del tessuto nervoso embrionale. A seguito di studi sul trapianto di preparati di tessuto nervoso embrionale nel sistema ventricolare del cervello (al fine di evitare lesioni al parenchima striato), sono state ottenute informazioni sul loro effetto positivo sul deficit motorio nel parkinsonismo.

Tuttavia, in altri studi, osservazioni sperimentali hanno dimostrato che il trapianto di preparati di tessuto nervoso embrionale del mesencefalo ventrale contenenti neuroni dopaminergici nel ventricolo cerebrale, così come il trapianto di elementi neurali embrionali GABA-ergici nello striato di ratti con emiparkinsonismo, non promuove il ripristino delle funzioni compromesse del sistema dopaminergico. Al contrario, l'analisi immunocitochimica ha confermato i dati sul basso tasso di sopravvivenza dei neuroni dopaminergici del mesencefalo ventrale trapiantati nello striato di ratti. L'effetto terapeutico del trapianto intraventricolare di tessuto nervoso embrionale del mesencefalo ventrale è stato ottenuto solo a condizione del simultaneo impianto di un preparato di cellule striatali embrionali nello striato denervato. Gli autori ritengono che il meccanismo di questo effetto sia associato all'effetto trofico positivo degli elementi GABA-ergici dello striato embrionale sull'attività dopaminergica specifica dei trapianti di mesencefalo ventrale intraventricolare. Una pronunciata reazione gliale nei trapianti è stata accompagnata da una lieve regressione dei parametri del test dell'apomorfina. Questi ultimi, a loro volta, erano correlati con il contenuto di GFAP nel siero sanguigno, che indicava direttamente una violazione della permeabilità della barriera emato-encefalica. Sulla base di questi dati, gli autori hanno concluso che il livello di GFAP nel siero sanguigno può essere utilizzato come criterio adeguato per valutare lo stato funzionale del trapianto e che l'aumentata permeabilità della barriera emato-encefalica per antigeni neurospecifici come GFAP rappresenta un collegamento patogenetico nello sviluppo del fallimento del trapianto dovuto a danno autoimmune al tessuto nervoso del ricevente.

Dal punto di vista di altri ricercatori, l'attecchimento e l'integrazione delle cellule staminali neurali dopo il trapianto sono stabili e duraturi, poiché le cellule del donatore si trovano nei riceventi per almeno due anni dopo il trapianto e senza una diminuzione significativa del loro numero. I tentativi di spiegare questo fatto con il fatto che, in uno stato indifferenziato, le cellule staminali neurali non esprimono le molecole MHC di classe I e II a un livello sufficiente a indurre una reazione di rigetto immunitario possono essere considerati veri solo in relazione ai precursori neurali a bassa differenziazione. Tuttavia, non tutte le cellule staminali neurali nel cervello del ricevente si conservano in uno stato dormiente immaturo. La maggior parte di esse subisce un processo di differenziazione, durante il quale le molecole MHC vengono espresse completamente.

In particolare, l'insufficiente efficacia del trapianto intrastriatale di preparati embrionali di mesencefalo ventrale contenenti neuroni dopaminergici per il trattamento del parkinsonismo sperimentale è associata al basso tasso di sopravvivenza dei neuroni dopaminergici trapiantati (solo il 5-20%), causato dalla gliosi reattiva che accompagna il trauma locale del parenchima cerebrale durante il trapianto. È noto che il trauma locale del parenchima cerebrale e la gliosi concomitante portano alla rottura dell'integrità della barriera emato-encefalica con il rilascio di antigeni del tessuto nervoso, in particolare OCAR e antigeni neuronali specifici, nel sangue periferico. La presenza di questi antigeni nel sangue può causare la produzione di anticorpi citotossici specifici contro di essi e lo sviluppo di aggressioni autoimmuni.

V. Tsymbalyuk e coautori (2001) riferiscono che il punto di vista tradizionale, secondo cui il sistema nervoso centrale è una zona immunologicamente privilegiata, isolata dal sistema immunitario dalla barriera emato-encefalica, è ancora valido. Nella loro revisione della letteratura, gli autori citano una serie di lavori che indicano come questo punto di vista non corrisponda pienamente all'essenza dei processi immunitari nel cervello dei mammiferi. È stato stabilito che sostanze marcate introdotte nel parenchima cerebrale possono raggiungere i linfonodi cervicali profondi e, dopo l'iniezione intracerebrale di antigeni, si formano anticorpi specifici nell'organismo. Le cellule dei linfonodi cervicali rispondono a tali antigeni proliferando, a partire dal quinto giorno dopo l'iniezione. La formazione di anticorpi specifici è stata anche rivelata durante il trapianto di pelle nel parenchima cerebrale. Gli autori della revisione forniscono diverse vie ipotetiche per il trasporto degli antigeni dal cervello al sistema linfatico. Una di queste è la transizione degli antigeni dagli spazi perivascolari allo spazio subaracnoideo. Si presume che gli spazi perivascolari localizzati lungo i grandi vasi del cervello siano l'equivalente del sistema linfatico cerebrale. Il secondo percorso si trova lungo le fibre bianche, attraverso l'osso etmoide, nei vasi linfatici della mucosa nasale. Inoltre, esiste un'ampia rete di vasi linfatici nella dura madre. Anche l'impermeabilità della barriera emato-encefalica per i linfociti è piuttosto relativa. È stato dimostrato che i linfociti attivati sono in grado di produrre enzimi che influenzano la permeabilità delle strutture del "filtro immunitario" cerebrale. A livello delle venule postcapillari, i linfociti T helper attivati penetrano la barriera emato-encefalica intatta. La tesi sull'assenza di cellule nel cervello che rappresentino gli antigeni non regge alle critiche. Attualmente, la possibilità che gli antigeni nel SNC siano rappresentati da almeno tre tipi di cellule è stata dimostrata in modo convincente. In primo luogo, si tratta di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo, localizzate nel cervello lungo i grandi vasi sanguigni e nella sostanza bianca. In secondo luogo, gli antigeni sono in grado di presentare le cellule endoteliali dei vasi sanguigni cerebrali e, in associazione con gli antigeni MHC, supportano la crescita clonale dei linfociti T specifici per questi antigeni. In terzo luogo, le cellule microgliali e astrogliali agiscono come agenti presentanti l'antigene. Partecipando alla formazione della risposta immunitaria nel sistema nervoso centrale, gli astrociti acquisiscono le proprietà di una cellula effettrice immunitaria ed esprimono una serie di antigeni, citochine e immunomodulatori. Quando incubate con interferone γ (γ-INF), le cellule astrogliali in vitro esprimono antigeni MHC di classe I e II, e gli astrociti stimolati sono in grado di presentare l'antigene e mantenere la proliferazione clonale dei linfociti.

Traumi del tessuto cerebrale, infiammazione postoperatoria, edema e depositi di fibrina che accompagnano il trapianto di tessuto nervoso embrionale creano le condizioni per un aumento della permeabilità della barriera emato-encefalica, con compromissione dell'autotolleranza, della sensibilizzazione e dell'attivazione dei linfociti CD3+CD4+. La presentazione di autoantigeni e alloantigeni è effettuata da astrociti e cellule microgliali che rispondono all'γ-INF esprimendo molecole MHC, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, molecole costimolatorie B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86), nonché la secrezione di IL-la, IL-ip e γ-INF.

Di conseguenza, la maggiore sopravvivenza del tessuto nervoso embrionale dopo trapianto intracerebrale rispetto alla sua somministrazione periferica difficilmente può essere associata all'assenza di inizio dell'immunità da trapianto. Inoltre, i monociti, i linfociti attivati (CD3+CD8+ citotossici e cellule T-helper) e le citochine da essi prodotte, così come gli anticorpi contro gli antigeni del trapianto periferico di tessuto nervoso embrionale, svolgono un ruolo importante nel processo di rigetto. Un basso livello di espressione delle molecole MHC nel tessuto nervoso embrionale è di particolare importanza nel creare le condizioni per una maggiore resistenza dei neurotrapianti ai processi immunitari delle cellule T. Per questo motivo, nell'esperimento, l'infiammazione immunitaria dopo il trapianto di tessuto nervoso embrionale nel cervello si sviluppa più lentamente rispetto al trapianto cutaneo. Ciononostante, si osserva la completa distruzione dei singoli trapianti di tessuto nervoso dopo 6 mesi. In questo caso, i linfociti T ristretti dagli antigeni MHC di classe II sono prevalentemente localizzati nella zona del trapianto (Nicholas et al., 1988). È stato dimostrato sperimentalmente che durante il neurotrapianto xenologico, la deplezione dei linfociti T helper (L3T4+), ma non dei linfociti T citotossici (Lyt-2), prolunga la sopravvivenza del tessuto nervoso di ratto nel cervello dei topi riceventi. Il rigetto del neurotrapianto è accompagnato dalla sua infiltrazione da parte di macrofagi e linfociti T dell'ospite. Di conseguenza, i macrofagi dell'ospite e le cellule microgliali attivate agiscono in situ come cellule immunostimolanti presentanti l'antigene, e l'aumentata espressione degli antigeni MHC di classe I del donatore potenzia l'attività killer dei linfociti T citotossici del ricevente.

Non ha senso analizzare i numerosi tentativi speculativi di spiegare il rigetto del neurotrapianto con la reazione del sistema immunitario del ricevente alle cellule endoteliali o agli elementi gliali del donatore, poiché anche linee pure di cellule progenitrici neurali sono soggette ad attacco immunitario. È interessante notare che l'espressione di ligandi di Fas da parte delle cellule cerebrali che legano i recettori dell'apoptosi (molecole di Fas) sui linfociti T infiltranti il cervello e ne inducono l'apoptosi gioca un ruolo importante nei meccanismi di maggiore sopravvivenza del trapianto all'interno del SNC, un tipico meccanismo protettivo dei tessuti autoimmunogenici trans-barriera.

Come giustamente osservano V. Tsymbalyuk e coautori (2001), il trapianto di tessuto nervoso embrionale è caratterizzato dallo sviluppo di infiammazione con la partecipazione di cellule sensibilizzate agli antigeni cerebrali e di cellule attivate, anticorpi e anche a seguito della produzione locale di citochine. Un ruolo importante in questo è svolto dalla preesistente sensibilizzazione dell'organismo agli antigeni cerebrali, che si verifica durante lo sviluppo di patologie del sistema nervoso centrale e può essere diretta contro gli antigeni del trapianto. Per questo motivo, la sopravvivenza a lungo termine dei neurotrapianti istoincompatibili si ottiene solo sopprimendo il sistema immunitario con ciclosporina A o introducendo anticorpi monoclonali nei linfociti CD4+ del ricevente.

Molti problemi del neurotrapianto restano quindi irrisolti, tra cui quelli legati alla compatibilità immunologica dei tessuti, che potranno essere risolti solo dopo una ricerca fondamentale e clinica mirata.