Metodi genetici molecolari per la diagnosi di malattie ereditarie

I metodi di tecnologia del DNA vengono utilizzati per determinare la localizzazione di un gene mutante in un particolare cromosoma, responsabile dell'origine di alcune forme di patologia ereditaria. Poiché un gene è una sezione di DNA e una mutazione genetica rappresenta un danno alla struttura primaria del DNA (per mutazione si intendono tutti i cambiamenti nella sequenza del DNA, indipendentemente dalla loro localizzazione e dal loro impatto sulla vitalità di un individuo), analizzando preparati di cromosomi in metafase di un paziente affetto da una malattia ereditaria, è possibile stabilire la localizzazione del gene patologico. I metodi di genetica molecolare offrono opportunità per diagnosticare le malattie a livello di alterazione della struttura del DNA, consentendo di determinare la localizzazione delle patologie ereditarie. I metodi di genetica molecolare possono identificare mutazioni associate alla sostituzione anche di una sola base.

La fase più importante dell'identificazione genica è il suo isolamento. Il DNA può essere isolato da qualsiasi tipo di tessuto e cellula contenente nuclei. Le fasi dell'isolamento del DNA includono: lisi rapida delle cellule, rimozione di frammenti di organelli e membrane cellulari mediante centrifugazione, distruzione enzimatica delle proteine e loro estrazione dalla soluzione utilizzando fenolo e cloroformio, concentrazione delle molecole di DNA mediante precipitazione in etanolo.

Nei laboratori di genetica, il DNA viene spesso isolato dai leucociti del sangue, prelevando 5-20 ml di sangue venoso dal paziente e trasferendoli in una provetta sterile con una soluzione anticoagulante (eparina). I leucociti vengono quindi separati e processati secondo le fasi descritte sopra.

La fase successiva della preparazione del materiale per la ricerca consiste nel "tagliare" il DNA in frammenti in aree con una sequenza di basi strettamente specifica, operazione che viene eseguita utilizzando enzimi batterici: le endonucleasi di restrizione (enzimi di restrizione). Gli enzimi di restrizione riconoscono sequenze specifiche di 4-6, meno frequentemente 8-12 nucleotidi in una molecola di DNA a doppio filamento e la dividono in frammenti nelle posizioni di queste sequenze, chiamate siti di restrizione. Il numero di frammenti di DNA di restrizione risultanti è determinato dalla frequenza di occorrenza dei siti di restrizione, mentre la dimensione dei frammenti è determinata dalla natura della distribuzione di questi siti lungo la lunghezza della molecola di DNA originale. Maggiore è la frequenza di presenza dei siti di restrizione, più corti saranno i frammenti di DNA dopo la restrizione. Attualmente sono noti più di 500 diversi tipi di enzimi di restrizione di origine batterica, e ciascuno di questi enzimi riconosce la propria specifica sequenza nucleotidica. In futuro, i siti di restrizione potranno essere utilizzati come marcatori genetici del DNA. I frammenti di DNA formati a seguito della restrizione possono essere ordinati in base alla lunghezza mediante elettroforesi su gel di agarosio o poliacrilammide, determinandone così il peso molecolare. Tipicamente, il DNA in un gel viene identificato mediante colorazione specifica (solitamente bromuro di etidio) e osservando il gel con luce ultravioletta trasmessa. I siti di localizzazione del DNA sono colorati in rosso. Tuttavia, nell'uomo, quando il DNA viene processato da diversi enzimi di restrizione, si formano così tanti frammenti di lunghezze diverse che non possono essere separati mediante elettroforesi, ovvero non è possibile identificare visivamente i singoli frammenti di DNA sull'elettroforesi (si ottiene una colorazione uniforme lungo l'intera lunghezza del gel). Pertanto, per identificare i frammenti di DNA desiderati in un gel di questo tipo, viene utilizzato il metodo di ibridazione con sonde di DNA marcate.

Qualsiasi segmento a singolo filamento di DNA o RNA è in grado di legarsi (ibridarsi) con un filamento complementare, con la guanina che si lega sempre alla citosina e l'adenina alla timina. In questo modo si forma una molecola a doppio filamento. Se una copia a singolo filamento di un gene clonato viene marcata con un marcatore radioattivo, si ottiene una sonda. La sonda è in grado di trovare un segmento complementare di DNA, che viene poi facilmente identificato mediante autoradiografia. Una sonda radioattiva aggiunta a una preparazione di cromosomi allungati consente di localizzare il gene su un cromosoma specifico: utilizzando una sonda di DNA, è possibile identificare aree specifiche durante il Southern blotting. L'ibridazione si verifica se la sezione di DNA in esame contiene un gene normale. Nel caso in cui sia presente una sequenza nucleotidica anomala, ovvero le strutture cromosomiche corrispondenti contengono un gene mutante, l'ibridazione non si verificherà, il che consente di determinare la localizzazione del gene patologico.

Per ottenere sonde di DNA, si utilizza il metodo della clonazione genica. L'essenza del metodo consiste nell'inserire un frammento di DNA corrispondente a un gene o a una sua sezione in una particella di clonazione, solitamente un plasmide batterico (DNA extracromosomico anulare presente nelle cellule batteriche e portatore di geni di resistenza agli antibiotici), e quindi moltiplicare i batteri con il plasmide contenente il gene umano inserito. Grazie ai processi di sintesi nel plasmide, è possibile ottenere miliardi di copie del gene umano o della sua sezione.

Le copie di DNA risultanti, marcate con un'etichetta radioattiva o fluorocromi, vengono poi utilizzate come sonde per ricercare sequenze complementari tra il pool di molecole di DNA studiato.

Attualmente esistono molti metodi diversi che utilizzano sonde di DNA per diagnosticare le mutazioni genetiche.

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