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La PCR come metodo di diagnosi delle malattie genetiche
Ultima recensione: 04.07.2025
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La PCR è una nuova conquista della genetica molecolare, utilizzata per l'amplificazione del DNA e consente la rapida moltiplicazione in vitro di una specifica regione di DNA (ovvero qualsiasi gene di interesse) per oltre 200.000 volte. Per eseguire la reazione, è sufficiente disporre di materiale di DNA proveniente da una singola cellula; la quantità di DNA amplificata dalla PCR è così grande che questo DNA può essere semplicemente colorato (non è necessario l'uso di sonde radioattive dopo l'elettroforesi). Un prerequisito per eseguire la PCR è la conoscenza della sequenza nucleotidica della regione di DNA amplificata per la corretta selezione dei primer sintetizzati artificialmente.
Attualmente, la PCR è un processo a singola provetta che consiste in ripetuti cicli di amplificazione (riproduzione, copia) di una specifica sequenza di molecole di DNA al fine di ottenere un numero sufficientemente elevato di copie che possano essere identificate mediante elettroforesi. Uno dei componenti chiave della reazione sono i "primer", oligonucleotidi sintetici costituiti da 20-30 basi complementari ai "siti" (aree) di annealing (attaccamento) presenti sulla zona identificata del DNA della matrice.
La PCR avviene automaticamente in un termostato programmabile, un termociclatore (amplificatore). Il ciclo a tre fasi, che produce copie esatte della sezione identificata di DNA della matrice, viene ripetuto 30-50 volte secondo il programma specificato dal termociclatore. Nel primo ciclo, gli oligoprimer si ibridano con il DNA della matrice originale e, successivamente (nei cicli successivi), con le molecole di DNA di nuova sintesi che si accumulano nella miscela di reazione. In quest'ultimo caso, la sintesi del DNA non termina a causa di una variazione di temperatura, ma al raggiungimento del limite di DNA polimerasi della sezione amplificata, che determina la dimensione della sezione di DNA di nuova sintesi con una precisione di un nucleotide.
Per rilevare le molecole di DNA ottenute si utilizza l'elettroforesi, mediante la quale il materiale amplificato viene separato in base alle dimensioni degli ampliconi (prodotti di amplificazione).
La PCR può essere utilizzata per esaminare direttamente le posizioni di sospette mutazioni o siti polimorfici, nonché per studiare la presenza di altre caratteristiche specifiche del DNA.
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