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PCR come metodo per diagnosticare malattie genetiche
Ultima recensione: 23.04.2024
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La PCR è una nuova conquista nella genetica molecolare, utilizzata per l'amplificazione del DNA e consente di replicare in vitro la porzione specifica del DNA (cioè qualsiasi gene di interesse) più di 200.000 volte. Per effettuare la reazione, è sufficiente avere il materiale del DNA di una cellula; la quantità di DNA amplificato dalla PCR è così grande che questo DNA può essere semplicemente colorato (usando sonde radioattive dopo l'elettroforesi non è richiesto). Un prerequisito per condurre la PCR è la conoscenza della sequenza nucleotidica della regione del DNA amplificata per la corretta selezione di primer sintetizzati artificialmente.
Attualmente, la PCR è un processo che avviene in un singolo tubo e consistente in cicli ripetitivi di amplificazione (riproduzione, copia) di specifiche sequenze di DNA per ottenere un numero sufficientemente elevato di copie che possono essere identificati mediante elettroforesi. Uno dei componenti chiave della reazione è "primer" - oligonucleotidi sintetici composti da 20-30 basi, complementari a "siti" (sezioni) di ricottura (attacco) sul sito identificato del DNA modello.
La PCR procede automaticamente in un termostato programmabile - termociclatore (termociclatore). Il ciclo a tre fasi, come risultato del quale si ottengono le copie esatte della porzione identificabile del DNA del modello, viene ripetuto 30-50 volte in conformità con il programma preimpostato del termociclatore. Nel primo ciclo, gli oligoprameri si ibridizzano con il DNA del modello originale e quindi (nei cicli successivi) e con le molecole di DNA appena sintetizzate mentre si accumulano nella miscela di reazione. In quest'ultimo caso, la sintesi del DNA non termina a causa di un cambiamento nel regime di temperatura, ma al raggiungimento del limite della DNA polimerasi della regione amplificata, che determina la dimensione della regione del DNA di nuova sintesi all'interno di un nucleotide.
Come metodo per rilevare le molecole di DNA ottenute, viene utilizzata l'elettroforesi, mediante la quale il materiale amplificato viene diviso in base alla dimensione degli ampliconi (prodotti di amplificazione).
Con l'aiuto della PCR, è possibile studiare direttamente i siti di localizzazione di sospette mutazioni o siti polimorfici e anche studiare la presenza di altre caratteristiche specifiche del DNA.
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