Vibrione del colera

Secondo l'OMS, il colera è una malattia infettiva caratterizzata da diarrea acuta, grave e disidratante, con feci simili a liquido di riso, conseguenza dell'infezione da Vibrio cholerae. A causa della sua spiccata capacità di diffondersi ampiamente in epidemie, del suo decorso grave e dell'alto tasso di mortalità, il colera è considerato un'infezione particolarmente pericolosa.

La patria storica del colera è l'India, o più precisamente il delta dei fiumi Gange e Brahmaputra (oggi India orientale e Bangladesh), dove è presente da tempo immemorabile (epidemie di colera in questa regione furono osservate già nel 500 a.C.). La lunga presenza di un focolaio endemico di colera in questa regione è spiegata da numerose ragioni. Il vibrione del colera non solo può sopravvivere a lungo nell'acqua, ma anche riprodursi in essa in condizioni favorevoli: temperature superiori a 12 °C e presenza di materia organica. Tutte queste condizioni sono evidenti in India: clima tropicale (temperatura media annua tra 25 e 29 °C), abbondanti precipitazioni e zone paludose, elevata densità di popolazione, soprattutto nel delta del Gange, elevata presenza di materia organica nell'acqua, continuo inquinamento idrico durante tutto l'anno con liquami ed escrementi, basso tenore di vita materiale e riti religiosi e di culto peculiari della popolazione.

Nella storia delle epidemie di colera si possono distinguere quattro periodi.

Periodo I - fino al 1817, quando il colera era concentrato solo nell'Asia orientale e meridionale, principalmente in India, e non si diffuse oltre i suoi confini.

II periodo - dal 1817 al 1926. Con l'instaurazione di ampi legami economici e di altro tipo tra l'India e i paesi europei e di altri paesi, il colera si estese oltre i confini dell'India e, diffondendosi lungo le rotte dei legami economici e religiosi, causò 6 pandemie che causarono milioni di vittime. La Russia fu il primo paese europeo in cui il colera penetrò. Dal 1823 al 1926, la Russia visse 57 anni di colera. Durante questo periodo, oltre 5,6 milioni di persone si ammalarono di colera e 2,14 milioni di persone morirono a causa di essa (il 40%).

III periodo - dal 1926 al 1961, il colera tornò alla sua principale endemicità e iniziò un periodo di relativo benessere. Sembrava che con lo sviluppo di moderni sistemi di depurazione dell'acqua potabile, la rimozione e la disinfezione delle acque reflue e l'adozione di speciali misure anti-colera, tra cui l'istituzione di un servizio di quarantena, i paesi del mondo sarebbero stati protetti in modo affidabile da un'altra invasione di colera.

Il quarto periodo iniziò nel 1961 e continua ancora oggi. La settima pandemia non iniziò in India, ma in Indonesia, si diffuse rapidamente nelle Filippine, in Cina, nei paesi dell'Indocina e poi in altri paesi in Asia, Africa ed Europa. Le peculiarità di questa pandemia includono il fatto che, in primo luogo, fu causata da una variante speciale del vibrione del colera - V. cholerae eltor, che fino al 1961 non era nemmeno ufficialmente riconosciuto come agente causale del colera; in secondo luogo, in termini di durata, superò tutte le pandemie precedenti; in terzo luogo, si verificò in due ondate, la prima delle quali durò fino al 1990, e la seconda iniziò nel 1991 e colpì molti paesi del Sud e Nord America, compresi gli Stati Uniti, che non avevano visto un'epidemia di colera dal 1866. Dal 1961 al 1996, 3.943.239 persone si ammalarono di colera in 146 paesi.

L'agente eziologico del colera, Vibrio cholerae, fu scoperto nel 1883 durante la quinta pandemia da R. Koch, ma il vibrione fu individuato per la prima volta nelle feci di pazienti con diarrea nel 1854 da F. Pacini.

V. cholerae appartiene alla famiglia delle Vibrionaceae, che comprende diversi generi (Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas, Photobacterium). Il genere Vibrio conta più di 25 specie dal 1985, di cui le più importanti per l'uomo sono V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus e V. fluvialis.

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Caratteristiche principali del genere Vibrio

Bastoncini Gram-negativi corti, non sporigeni e non capsuleformi, curvi o dritti, di 0,5 µm di diametro e 1,5-3,0 µm di lunghezza, mobili (V. cholerae è monotrico, alcune specie hanno due o più flagelli polari); crescono bene e rapidamente su terreni normali, sono chemioorganotrofi e fermentano i carboidrati per produrre acido senza gas (il glucosio viene fermentato tramite la via di Embden-Meyerhof). Ossidasi-positivi, formano indolo, riducono i nitrati a nitriti (V. cholerae dà una reazione nitrosoindolo positiva), scompongono la gelatina, spesso danno una reazione di Voges-Proskauer positiva (cioè, formano acetilmetilcarbinolo), non hanno ureasi, non formano H₂S, hanno lisina e ornitina decarbossilasi, ma non hanno arginina diidrolasi. Una caratteristica del genere Vibrio è la sensibilità della maggior parte dei ceppi batterici al farmaco 0/129 (2,4-diammino-6,7-diazopropilpteridina), mentre i rappresentanti delle famiglie Pseudomonadaceae ed Enterobacteriaceae sono resistenti a questo farmaco. I Vibrioni sono aerobi e anaerobi facoltativi, la temperatura ottimale per la crescita è 18-37 °C, pH 8,6-9,0 (crescono nell'intervallo di pH 6,0-9,6), alcune specie (alofile) non crescono in assenza di NaCl. Il contenuto di G + C nel DNA è del 40-50% molare (per V. cholerae circa il 47% molare). I test biochimici vengono utilizzati per differenziare all'interno della famiglia Vibrionaceae dai generi morfologicamente simili Aeromonas e Plesiomonas, nonché per distinguerli dalla famiglia Enterobacteriaceae.

Il vibrione del colera differisce dalla famiglia delle Pseudomonadaceae in quanto fermenta il glucosio solo attraverso la via di Embden-Meyerhof (senza la partecipazione di O₂), mentre i primi consumano glucosio solo in presenza di O₂. Questa differenza è facilmente rilevabile sul terreno di coltura Hugh-Leifson. Il terreno contiene agar nutriente, glucosio e un indicatore. La semina viene effettuata in due colonne con il terreno di coltura Hugh-Leifson, una delle quali riempita con vaselina (per creare condizioni anaerobiche). Nel caso della crescita del vibrione del colera, il colore del terreno cambia in entrambe le provette, mentre nel caso della crescita delle Pseudomonadaceae, cambia solo nella provetta senza vaselina (condizioni di crescita aerobica).

Il vibrione del colera è molto poco esigente in termini di terreni nutritivi. Si riproduce bene e rapidamente in acqua peptonata (PV) alcalina all'1% (pH 8,6-9,0) contenente lo 0,5-1,0% di NaCl, superando la crescita di altri batteri. Per sopprimere la crescita di Proteus, si consiglia di aggiungere tellurito di potassio (in una diluizione finale di 1:100.000) al PV all'1%. Il PV all'1% è il miglior terreno di arricchimento per il vibrione del colera. Durante la crescita, dopo 6-8 ore forma una pellicola delicata, lassa e grigiastra sulla superficie del PV, che si distrugge facilmente se agitata e si deposita sul fondo sotto forma di fiocchi; il PV diventa moderatamente torbido. Sono stati proposti diversi terreni selettivi per l'isolamento del vibrione del colera: agar alcalino, agar sali biliari, albuminato alcalino, agar alcalino con sangue, agar lattosio-saccarosio e altri terreni. Il migliore è il terreno TCBS (agar tiosolfato citrato-bromotimolo saccarosio) e le sue modificazioni. Tuttavia, il terreno più comunemente utilizzato è l'MPA alcalino, su cui il vibrione del colera forma colonie lisce, vetrose-trasparenti, di colore bluastro, a forma di disco, di consistenza viscosa.

Seminato tramite iniezione in una colonna di gelatina, il vibrione, dopo 2 giorni a una temperatura di 22-23 °C, provoca la liquefazione dalla superficie sotto forma di bolla, poi a forma di imbuto e infine strato per strato.

Nel latte, il vibrione si moltiplica rapidamente, provocando la coagulazione dopo 24-48 ore; successivamente si verifica la peptonizzazione del latte e dopo 3-4 giorni il vibrione muore a causa di uno spostamento del pH del latte verso il lato acido.

B. Heiberg, in base alla loro capacità di fermentare mannosio, saccarosio e arabinosio, ha suddiviso tutti i vibrioni (colerici e simili) in un certo numero di gruppi, il cui numero ammonta attualmente a 8.

Vibrio cholerae appartiene al primo gruppo di Heiberg.

I vibrioni simili per caratteristiche morfologiche, culturali e biochimiche al vibrione del colera erano e sono chiamati in modo diverso: paracolera, colera-simili, vibrioni NAG (vibrioni non agglutinanti); vibrioni non appartenenti al gruppo O1. Quest'ultimo nome sottolinea con maggiore precisione la loro parentela con il vibrione del colera. Come stabilito da A. Gardner e K. Venkat-Raman, i vibrioni del colera e colera-simili hanno un antigene H comune, ma differiscono per gli antigeni O. In base all'antigene O, i vibrioni del colera e colera-simili sono attualmente suddivisi in 139 sierogruppi O, ma il loro numero è in continua espansione. Il vibrione del colera appartiene al gruppo O1. Presenta un antigene A comune e due antigeni tipo-specifici, B e C, che distinguono tre sierotipi di V. cholerae: il sierotipo Ogawa (AB), il sierotipo Inaba (AC) e il sierotipo Hikoshima (ABC). Il vibrione del colera in fase di dissociazione presenta un antigene OR. A questo proposito, per identificare V. cholerae vengono utilizzati siero O, siero OR e sieri tipo-specifici Inaba e Ogawa.

Nel 1992-1993, una vasta epidemia di colera iniziò in Bangladesh, India, Cina, Malesia e altri paesi, il cui agente causale era un nuovo sierotipo, precedentemente sconosciuto, della specie Vibrio cholerae. Differisce da V. cholerae O1 per caratteristiche antigeniche: possiede l'antigene 0139 e una capsula polisaccaridica e non viene agglutinato da nessun altro sierotipo O. Tutte le sue altre proprietà morfologiche e biologiche, inclusa la capacità di causare il colera, ovvero di sintetizzare l'esotossina-colerogeno, si rivelarono simili alle proprietà di V. cholerae O1. Di conseguenza, un nuovo agente causale del colera, V. cholerae 0139, apparentemente emerse a seguito di una mutazione che cambiò l'antigene O. Fu chiamato V. cholerae 0139 bengal.

La questione della relazione tra i cosiddetti vibrioni colera-simili e V. cholerae è stata a lungo poco chiara. Tuttavia, un confronto tra V. cholerae e vibrioni colera-simili (NAG) basato su oltre 70 caratteristiche ha rivelato una similarità del 90%, e il grado di omologia del DNA tra V. cholerae e i vibrioni NAG studiati è del 70-100%. Pertanto, i vibrioni colera-simili sono raggruppati in un'unica specie con il vibrione del colera, da cui differiscono principalmente per i loro antigeni O, per cui vengono chiamati vibrioni del gruppo non-01 - V. cholerae non-01.

La specie V. cholerae è suddivisa in 4 biotipi: V. cholerae, V. eltor, V. proteus e V. albensis. La natura del vibrione di El Tor è stata dibattuta per molti anni. Questo vibrione fu isolato nel 1906 da F. Gottschlich presso la stazione di quarantena di El Tor dal corpo di un pellegrino morto di dissenteria. F. Gottschlich isolò diversi ceppi di questo tipo. Non differivano dal vibrione del colera in tutte le loro proprietà ed erano agglutinati dal siero colerico O. Tuttavia, poiché a quel tempo non c'era colera tra i pellegrini e la portabilità a lungo termine del vibrione del colera era considerata improbabile, la questione del possibile ruolo eziologico di V. eltor nel colera rimase a lungo controversa. Inoltre, il vibrione di El Tor, a differenza di V. cholerae, aveva un effetto emolitico. Tuttavia, nel 1937, questo vibrione causò una vasta e grave epidemia di colera sull'isola di Sulawesi (Indonesia) con un tasso di mortalità superiore al 60%. Infine, nel 1961, divenne il responsabile della settima pandemia e nel 1962 la questione della sua natura colerica fu finalmente risolta. Le differenze tra V. cholerae e V. eltor riguardano solo alcune caratteristiche. Per tutte le altre proprietà, V. eltor non è fondamentalmente diverso da V. cholerae. Inoltre, è stato ora stabilito che il biotipo di V. proteus (V. finklerpriori) include l'intero gruppo di vibrioni, ad eccezione del gruppo 01 (e ora 0139), precedentemente denominato vibrioni NAG. Il biotipo di V. albensis è stato isolato dal fiume Elba e ha la capacità di fosforescenza, ma avendola persa, non è diverso da V. proteus. Sulla base di questi dati, la specie Vibrio cholerae è attualmente suddivisa in 4 biotipi: V. cholerae 01 cholerae, V. cholerae eltor, V. cholerae 0139 bengal e V. cholerae non 01. I primi tre appartengono ai due sierotipi 01 e 0139. L'ultimo biotipo comprende i precedenti biotipi V. proteus e V. albensis ed è rappresentato da molti altri sierotipi di vibrioni non agglutinati dai sieri 01 e 0139, ovvero i vibrioni NAG.

Fattori di patogenicità del vibrione del colera

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Chemiotassi del Vibrio cholerae

Grazie a queste proprietà, il vibrione interagisce con le cellule epiteliali. Nei mutanti del vibrione del colera (che hanno perso la capacità di chemiotassi), la virulenza è significativamente ridotta, mentre nei mutanti Mob (che hanno perso la mobilità) scompare completamente o diminuisce drasticamente.

Fattori di adesione e colonizzazione attraverso i quali il vibrione aderisce ai microvilli e colonizza la mucosa dell'intestino tenue. I fattori di adesione includono mucinasi, emoagglutinina/proteasi solubile, neuraminidasi, ecc. Promuovono l'adesione e la colonizzazione distruggendo le sostanze che fanno parte del muco. L'emoagglutinina/proteasi solubile favorisce la separazione dei vibrioni dai recettori delle cellule epiteliali e la loro fuoriuscita dall'intestino nell'ambiente esterno, garantendone la diffusione epidemica. La neuraminidasi rafforza il legame tra colerageno e cellule epiteliali e facilita la penetrazione della tossina nelle cellule, aumentando la gravità della diarrea.

La tossina del colera è un colerageno.

Le cosiddette nuove tossine sono in grado di causare diarrea, ma non hanno alcuna relazione genetica o immunologica con il colerageno.

Fattori dermoneurotici ed emorragici. La natura di questi fattori tossici e il loro ruolo nella patogenesi del colera non sono stati sufficientemente studiati.

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Endotossine di Vibrio cholerae

I lipopolisaccaridi di V. cholerae hanno una forte proprietà endotossica e causano un'intossicazione generale dell'organismo.

Il principale fattore di patogenicità del vibrione del colera elencato è l'esotossina coleragena (CTX AB), che determina la patogenesi di questa malattia. La molecola del colera è composta da due frammenti: A e B. Il frammento A è costituito da due peptidi, A1 e A2, e possiede una proprietà specifica della tossina del colera, conferendole le qualità di superantigene. Il frammento B è costituito da 5 subunità identiche. Svolge due funzioni: 1) riconosce il recettore (monosialoganglioside) dell'enterocita e si lega ad esso; 2) forma un canale idrofobico intramembrana per il passaggio della subunità A. Il peptide A2 serve a legare i frammenti A e B. La funzione tossica vera e propria è svolta dal peptide Aj (ADP-ribosiltransferasi). Esso interagisce con il NAD+, causandone l'idrolisi; l'ADP-ribosio risultante si lega alla subunità regolatrice dell'adenilato ciclasi. Ciò porta all'inibizione dell'idrolisi del GTP. Il complesso GTP + adenilato ciclasi risultante causa l'idrolisi dell'ATP con la formazione di cAMP. (Un'altra via per l'accumulo di cAMP è la soppressione, da parte del colerageno, dell'enzima che idrolizza il cAMP a 5-AMP). La manifestazione della funzione del gene ctxAB, che codifica per la sintesi dell'esotossina, dipende dalla funzione di numerosi altri geni di patogenicità, in particolare i geni tcp (che codificano per la sintesi dei pili di adesione controllati dalla tossina - TCAP), i geni regolatori toxR, toxS e toxT, i geni hap (emoagglutinina/proteasi solubile) e neuraminidasi (neuraminidasi). Pertanto, il controllo genetico della patogenicità di V. cholerae è complesso.

Come si è scoperto, ci sono due isole di patogenicità nel cromosoma di V. cholerae. Una di queste è il genoma del fago filamentoso a conversione moderata CTXφ, e l'altra è il genoma del fago filamentoso a conversione moderata VPIcp. Ognuna di queste isole di patogenicità contiene cassette di geni specificati nella profase, che determinano la patogenicità del patogeno del colera. Il profago CTXφ trasporta i geni CTX, i geni delle nuove tossine zot e ace, il gene ser (sintesi dell'adesina) e il gene ortU (sintesi di un prodotto a funzione sconosciuta). Questa cassetta include anche il gene nei e la regione fagica RS2, che codifica per la replicazione e l'integrazione del profago nei cromosomi. I geni zot, ace e ortU sono necessari per la formazione dei virioni fagici quando il profago viene escluso dal cromosoma del patogeno.

Il profago VPIcp trasporta i geni tcp (che codificano per la produzione di pili (proteina TCPA)), toxT, toxR, e i geni act (fattore di colonizzazione aggiuntivo, geni della mobilità (integrasi e trasposasi)). La trascrizione dei geni di virulenza è regolata da tre geni regolatori: toxR, toxS e toxT. Questi geni modificano in modo coordinato, a livello di trascrizione, l'attività di oltre 20 geni di virulenza, tra cui ctxAB, tcp e altri geni. Il principale gene regolatore è il gene toxR. Il suo danno o la sua assenza porta all'avirulenza o a una riduzione di oltre 100 volte della produzione delle tossine del colera CTX e TCPA. Probabilmente, è in questo modo che l'espressione coordinata dei geni di virulenza viene regolata nelle isole di patogenicità formate dai fagi convertenti temperati e in altre specie batteriche. È stato accertato che nel cromosoma di V. cholerae eltor è presente un altro profago, il K139, ma il suo genoma è stato poco studiato.

Il gene hap è localizzato sul cromosoma. Pertanto, la virulenza (patogenicità) e la capacità epidemica di V. cholerae sono determinate da 4 geni: ctxAB, tcp, toxR e hap.

Esistono vari metodi per rilevare la capacità del V. cholerae di produrre colerageno.

Test biologico sui conigli. Quando i vibrioni del colera vengono iniettati per via intramuscolare in conigli lattanti (di età non superiore alle 2 settimane), questi sviluppano la tipica sindrome colerica: diarrea, disidratazione e morte del coniglio.

Rilevazione diretta del colerageno mediante PCR, immunofluorescenza a fluorescenza (IFM) o reazione di emolisi immunitaria passiva (il colerageno si lega alle proteine Gmj degli eritrociti, che vengono lisate in seguito all'aggiunta di anticorpi antitossici e complemento). Tuttavia, la sola rilevazione della capacità di produrre tossina non è sufficiente a determinare il pericolo epidemico di tali ceppi. Per questo, è necessario rilevare la presenza del gene hap; pertanto, il metodo migliore e più affidabile per differenziare i ceppi tossigeni ed epidemici di vibrioni del colera dei sierogruppi 01 e 0139 è la PCR, utilizzando primer specifici per rilevare tutti e 4 i geni di patogenicità: ctxAB, tcp, toxR e hap.

La capacità di V. cholerae, diversi dai sierogruppi 01 o 0139, di causare malattie diarroiche sporadiche o a grappolo negli esseri umani può essere dovuta alla presenza di enterotossine di tipo LT o ST, che stimolano rispettivamente i sistemi dell'adenilato o della guanilato ciclasi, oppure alla presenza solo dei geni ctxAB ma non del gene hap.

Durante la settima pandemia, sono stati isolati ceppi di V. cholerae con diversi gradi di virulenza: colerogeni (virulenti), debolmente colerogeni (a bassa virulenza) e non colerogeni (non virulenti). I ceppi di V. cholerae non colerogeni, di norma, mostrano attività emolitica, non vengono lisati dal fago diagnostico del colera HDF(5) e non causano malattie nell'uomo.

Per la tipizzazione fagica di V. cholerae 01 (incluso El Tor), S. Mukherjee ha proposto set di fagi, che sono stati poi integrati con altri fagi in Russia. Un set di tali fagi (1-7) consente di distinguere i tipi fagici di V. cholerae 0116. Per l'identificazione di V. cholerae El Tor, tossigenico e non tossigenico, in Russia vengono ora proposti i fagi CTX* (che lisano i vibrioni tossigeni di El Tor) e CTX" (che lisano i vibrioni non tossigeni di El Tor).

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Resistenza dei patogeni del colera

I vibrioni del colera sopravvivono bene a basse temperature; rimangono vitali nel ghiaccio fino a 1 mese; nell'acqua di mare - fino a 47 giorni, nell'acqua di fiume - da 3-5 giorni a diverse settimane, nell'acqua minerale bollita sopravvivono per più di 1 anno, nel terreno - da 8 giorni a 3 mesi, nelle feci fresche - fino a 3 giorni, nei prodotti bolliti (riso, pasta, carne, porridge, ecc.) sopravvivono per 2-5 giorni, nelle verdure crude - 2-4 giorni, nella frutta - 1-2 giorni, nel latte e nei latticini - 5 giorni; se conservati al freddo, il periodo di sopravvivenza aumenta di 1-3 giorni; su lino contaminato da feci, sopravvivono fino a 2 giorni e su materiale umido - una settimana. I vibrioni del colera muoiono entro 5 minuti a una temperatura di 80 °C e istantaneamente a 100 °C; sono altamente sensibili agli acidi; Muoiono entro 5-15 minuti sotto l'effetto di cloramina e altri disinfettanti. Sono sensibili all'essiccazione e alla luce solare diretta, ma sopravvivono bene e a lungo e si moltiplicano persino in corpi idrici aperti e acque reflue ricche di materia organica, con pH alcalino e temperatura superiore a 10-12 °C. Sono altamente sensibili al cloro: una dose di cloro attivo di 0,3-0,4 mg/l di acqua in 30 minuti provoca una disinfezione affidabile dai vibrioni del colera.

Vibrioni patogeni per l'uomo che non appartengono alla specie Vibrio Cholerae

Il genere Vibrio comprende più di 25 specie, di cui, oltre a V. cholerae, almeno otto sono in grado di causare malattie nell'uomo: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus, V. fluvialis, V. fumissii, V. mimicus, V. damsela e V. hollisae. Tutti questi vibrioni vivono in mari e baie. L'infezione avviene attraverso il nuoto o l'ingestione di frutti di mare. È stato scoperto che i vibrioni colerici e non colerici possono causare non solo gastroenteriti, ma anche infezioni delle ferite. Questa capacità è stata riscontrata nei gruppi V. cholerae 01 e non 01, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. mimicus, V. damsela e V. vulnificus. Causano processi infiammatori nei tessuti molli quando vengono danneggiati dalla conchiglia di animali marini o a diretto contatto con acqua di mare infetta.

Tra i vibrioni non colerici patogeni elencati, quelli di maggiore interesse pratico sono V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus e V. fluvialis.

V. parahaemolyticus, un vibrione paraemolitico, fu isolato per la prima volta in Giappone nel 1950 durante una vasta epidemia di intossicazione alimentare causata dal consumo di sardine semi-secche (la mortalità fu del 7,5%). L'agente eziologico apparteneva al genere Vibrio da R. Sakazaki nel 1963. Egli divise i ceppi studiati in 2 specie: V. parahaemolyticus e V. alginolyticus. Entrambe le specie si trovano nelle acque marine costiere e, nei suoi abitanti, sono alofili (dal greco hals, sale); a differenza dei vibrioni comuni, quelli alofili non crescono su substrati privi di NaCl e si riproducono bene ad alte concentrazioni di quest'ultimo. L'appartenenza alla specie dei vibrioni alofili è determinata dalla loro capacità di fermentare il saccarosio, formare acetilmetilcarbinolo e riprodursi in acqua piovana con il 10% di NaCl. Tutte queste caratteristiche sono inerenti alla specie V. alginolyticus, ma sono assenti in V. parahaemolyticus.

Il vibrione paraemolitico presenta tre tipi di antigeni: antigeni flagellari H termolabili, antigeni O termostabili che non vengono distrutti dal riscaldamento a 120 °C per 2 ore e antigeni K di superficie che vengono distrutti dal riscaldamento. Le colture di V. parahaemolyticus appena isolate presentano antigeni K ben definiti che proteggono i vibrioni vivi dall'agglutinazione da parte di sieri O omologhi. Gli antigeni H sono gli stessi per tutti i ceppi, ma gli antigeni H di monotrichus differiscono dagli antigeni H di peritrichs. In base all'antigene O, V. parahaemolyticus è suddiviso in 14 sierogruppi. All'interno dei sierogruppi, i vibrioni sono suddivisi in sierotipi in base agli antigeni K, il cui numero totale è 61. Lo schema antigenico di V. parahaemolyticus è stato sviluppato esclusivamente per i suoi ceppi isolati dall'uomo.

La patogenicità di V. parahaemolyticus è associata alla sua capacità di sintetizzare emolisina, dotata di proprietà enterotossiche. Quest'ultima viene rilevata utilizzando il metodo Kanagawa. La sua essenza risiede nel fatto che V. parahaemolyticus, patogeno per l'uomo, causa una chiara emolisi su agar sangue contenente il 7% di NaCl. Su agar sangue contenente meno del 5% di NaCl, l'emolisi è causata da molti ceppi di V. parahaemolyticus, e su agar sangue con il 7% di NaCl - solo da ceppi con proprietà enteropatogene. Il vibrione paraemolitico è presente sulle coste del Mar Giapponese, del Mar Caspio, del Mar Nero e di altri mari. Causa infezioni tossiche trasmesse dagli alimenti e malattie simili alla dissenteria. L'infezione si verifica ingerendo frutti di mare crudi o semicrudi infetti da V. parahaemolyticus (pesce di mare, ostriche, crostacei, ecc.).

Tra gli otto vibrioni non colerici sopra menzionati, il più patogeno per l'uomo è il V. vulnificus, descritto per la prima volta nel 1976 come Beneckea vulnificus e poi riclassificato come Vibrio vulnificus nel 1980. È spesso presente nell'acqua marina e nei suoi abitanti e causa diverse malattie umane. I ceppi di V. vulnificus di origine marina e clinica non differiscono tra loro né fenotipicamente né geneticamente.

Le infezioni delle ferite causate da V. vulnificus progrediscono rapidamente e portano alla formazione di tumori con successiva necrosi dei tessuti, accompagnati da febbre, brividi, talvolta dolore intenso e in alcuni casi che richiedono l'amputazione.

È stato scoperto che V. vulnificus produce esotossina. Esperimenti su animali hanno dimostrato che il patogeno causa gravi danni locali con sviluppo di edema e necrosi tissutale, seguiti da morte. Il ruolo dell'esotossina nella patogenesi della malattia è in fase di studio.

Oltre alle infezioni delle ferite, il V. vulnificus può causare polmonite nelle vittime di annegamento ed endometrite nelle donne dopo l'esposizione all'acqua di mare. La forma più grave di infezione causata dal V. vulnificus è la setticemia primaria associata al consumo di ostriche crude (e forse di altri animali marini). Questa malattia si sviluppa molto rapidamente: il paziente manifesta malessere, febbre, brividi e prostrazione, seguiti da grave ipotensione, che è la principale causa di morte (il tasso di mortalità è di circa il 50%).

V. fluvialis è stato descritto per la prima volta come agente patogeno della gastroenterite nel 1981. Appartiene a un sottogruppo di vibrioni non patogeni per il colera che possiedono arginina diidrolasi ma non netornitina e lisina decarbossilasi (V. fluvialis, V. furnissii, V. damsela, cioè fenotipicamente simili ad Aeromonas). V. fluvialis è un agente causale comune di gastroenterite, che è accompagnata da vomito grave, diarrea, dolore addominale, febbre e disidratazione grave o moderata. Il principale fattore patogeno è l'enterotossina.

Epidemiologia del colera

La principale fonte di infezione è rappresentata esclusivamente dall'uomo, ovvero un paziente affetto da colera o un portatore di vibrioni, e dall'acqua contaminata da questi. Nessun animale in natura contrae il colera. La via di infezione è oro-fecale. Vie di infezione: a) la principale: attraverso l'acqua utilizzata per bere, lavarsi e per le necessità domestiche; b) per contatto: domestica; c) attraverso gli alimenti. Tutte le principali epidemie e pandemie di colera sono state associate all'acqua. I vibrioni del colera possiedono meccanismi adattativi tali da garantire l'esistenza delle loro popolazioni sia nel corpo umano che in alcuni ecosistemi di corpi idrici aperti. La diarrea grave, causata dal vibrione del colera, porta alla purificazione dell'intestino dai batteri concorrenti e contribuisce all'ampia diffusione del patogeno nell'ambiente, principalmente nelle acque reflue e nei corpi idrici aperti in cui vengono scaricati. Una persona affetta da colera espelle il patogeno in enormi quantità: da 100 milioni a 1 miliardo per 1 ml di feci; un portatore di vibrioni espelle 100-100.000 vibrioni in 1 ml, la dose infettante è di circa 1 milione di vibrioni. La durata dell'escrezione del vibrione del colera nei portatori sani è compresa tra 7 e 42 giorni e tra 7 e 10 giorni in coloro che sono guariti. Un'escrezione più lunga è estremamente rara.

Una particolarità del colera è che, di norma, non si verifica una trasmissione a lungo termine e non si formano focolai endemici stabili. Tuttavia, come già accennato in precedenza, a causa dell'inquinamento dei corpi idrici aperti con acque reflue contenenti grandi quantità di sostanze organiche, detergenti e sale da cucina, in estate il vibrione del colera non solo sopravvive a lungo, ma addirittura si moltiplica.

Di grande rilevanza epidemiologica è il fatto che i vibrioni del colera del gruppo 01, sia non tossigeni che tossigeni, possano persistere a lungo in vari ecosistemi acquatici come forme non coltivate. Utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR), i geni vct delle forme non coltivate di V. chokrae sono stati rilevati in vari corpi idrici in diversi territori endemici della CSI durante studi batteriologici negativi.

Il focolaio endemico del vibrione del colera El Tor è l'Indonesia; si ritiene che la comparsa di questo colpevole della settima pandemia da lì sia associata all'espansione dei legami economici dell'Indonesia con il mondo esterno dopo l'ottenimento dell'indipendenza; la durata e lo sviluppo rapidissimo della pandemia, in particolare della sua seconda ondata, sono stati influenzati in modo decisivo dalla mancanza di immunità al colera e da vari sconvolgimenti sociali nei paesi di Asia, Africa e America.

In caso di colera, viene adottata una serie di misure antiepidemiche, tra cui le principali e decisive sono l'individuazione attiva e tempestiva e l'isolamento (ricovero ospedaliero, trattamento) dei pazienti in forme acute e atipiche e dei portatori sani di vibrioni; vengono adottate misure per prevenire possibili vie di infezione; viene prestata particolare attenzione all'approvvigionamento idrico (clorazione dell'acqua potabile), al rispetto delle condizioni igienico-sanitarie nelle aziende alimentari, negli istituti per bambini, nei luoghi pubblici; viene effettuato un controllo rigoroso, anche batteriologico, sui corpi idrici aperti, viene effettuata l'immunizzazione della popolazione, ecc.

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Sintomi del colera

Il periodo di incubazione del colera varia da diverse ore a 6 giorni, il più delle volte 2-3 giorni. Una volta entrati nel lume dell'intestino tenue, i vibrioni del colera, grazie alla loro mobilità e alla chemiotassi della mucosa, si dirigono verso il muco. Per penetrarvi, i vibrioni producono diversi enzimi: neuraminidasi, mucinasi, proteasi, lecitinasi, che distruggono le sostanze contenute nel muco e facilitano il movimento dei vibrioni verso le cellule epiteliali. Per adesione, i vibrioni si attaccano al glicocalice dell'epitelio e, perdendo mobilità, iniziano a moltiplicarsi intensamente, colonizzando i microvilli dell'intestino tenue (vedi inserto a colori, Fig. 101.2), e producendo contemporaneamente una grande quantità di esotossina-colerogeno. Le molecole di colerageno si legano al monosialoganglioside Gni! E penetrano nella membrana cellulare, dove attivano il sistema dell'adenilato ciclasi, e l'accumulo di cAMP causa ipersecrezione di liquidi, cationi e anioni Na, HCO3, Kl, Cl dagli enterociti, che porta a colera, diarrea, disidratazione e desalinizzazione dell'organismo. Esistono tre tipi di malattia:

• una malattia diarroica disidratante violenta e grave che provoca la morte del paziente nel giro di poche ore;
• decorso meno grave o diarrea senza disidratazione;
• decorso asintomatico della malattia (portatore di vibrioni).

Nei casi gravi di colera, i pazienti sviluppano diarrea, la frequenza delle evacuazioni aumenta, le feci diventano più abbondanti, acquose, perdono l'odore fecale e assumono l'aspetto di brodo di riso (un liquido torbido con residui di muco e cellule epiteliali galleggianti). Successivamente si verifica un vomito debilitante, inizialmente del contenuto intestinale, che poi assume l'aspetto di brodo di riso. La temperatura del paziente scende al di sotto del normale, la pelle diventa bluastra, rugosa e fredda: colera algida. A causa della disidratazione, il sangue si addensa, si sviluppa cianosi, carenza di ossigeno, la funzionalità renale si deteriora bruscamente, compaiono convulsioni, il paziente perde conoscenza e sopraggiunge la morte. Il tasso di mortalità per colera durante la settima pandemia variava dall'1,5% nei paesi sviluppati al 50% nei paesi in via di sviluppo.

L'immunità post-infettiva è forte, duratura e le malattie ricorrenti sono rare. L'immunità è antitossica e antimicrobica, causata da anticorpi (le antitossine persistono più a lungo degli anticorpi antimicrobici), cellule della memoria immunitaria e fagociti.

Diagnostica di laboratorio del colera

Il metodo principale e decisivo per diagnosticare il colera è batteriologico. Il materiale da esaminare sul paziente sono feci e vomito; le feci vengono esaminate per la presenza di vibrioni; dalle persone decedute per colera viene prelevata una sezione legata dell'intestino tenue e della cistifellea per l'esame; dagli oggetti dell'ambiente esterno, vengono spesso esaminate l'acqua proveniente da bacini di raccolta aperti e le acque reflue.

Quando si conduce uno studio batteriologico, devono essere soddisfatte le tre condizioni seguenti:

• seminare il materiale dal paziente il più rapidamente possibile (il vibrione del colera sopravvive nelle feci per un breve periodo di tempo);
• il contenitore in cui viene prelevato il materiale non deve essere disinfettato con prodotti chimici e non deve contenerne tracce, poiché il vibrione del colera è molto sensibile ad essi;
• eliminare la possibilità di contaminazione e infezione degli altri.

La coltura viene isolata secondo il seguente schema: semina su PV, contemporaneamente su MPA alcalino o qualsiasi terreno selettivo (il TCBS è il migliore). Dopo 6 ore, si esamina il film formatosi su PV e, se necessario, si effettua un trasferimento su un secondo PV (la velocità di semina del vibrione del colera in questo caso aumenta del 10%). Dal PV, si effettua un trasferimento su MPA alcalino. Le colonie sospette (trasparenti e vitree) vengono trasferite per ottenere una coltura pura, che viene identificata in base alle proprietà morfologiche, colturali, biochimiche, alla motilità e infine tipizzata utilizzando sieri agglutinanti diagnostici O-, OR-, Inaba e Ogawa e fagi (HDF). Sono state proposte diverse opzioni per la diagnosi accelerata, la migliore delle quali è il metodo sierologico luminescente. Questo metodo consente di rilevare il vibrione del colera direttamente nel materiale di prova (o dopo una coltura preliminare in due provette con l'1% di PV, a una delle quali viene aggiunto il fago del colera) entro 1,5-2 ore. Per l'individuazione accelerata del vibrione del colera, l'IEM di Nižnij Novgorod ha proposto un set di dischi indicatori cartacei composto da 13 test biochimici (ossidasi, indolo, ureasi, lattosio, glucosio, saccarosio, mannosio, arabinosio, mannitolo, inositolo, arginina, ornitina, lisina), che consentono di differenziare i rappresentanti del genere Vibrio dai generi Aeromonas, Plesiomonas, Pseudomonas, Comamonas e dalla famiglia delle Enterobacteriaceae. Per l'individuazione rapida del vibrione del colera nelle feci e negli oggetti ambientali, è possibile utilizzare la RPGA con un anticorpo diagnosticum. Per l'individuazione di forme non coltivate di vibrione del colera negli oggetti ambientali, viene utilizzato esclusivamente il metodo della reazione a catena della polimerasi.

Nei casi in cui vengano isolati vibrioni di V. cholerae non appartenenti al gruppo Ol, questi devono essere tipizzati utilizzando i corrispondenti sieri agglutinanti di altri sierogruppi. L'isolamento di vibrioni di V. cholerae non appartenenti al gruppo Ol da un paziente con diarrea (inclusa diarrea simil-colerica) richiede le stesse misure antiepidemiche previste per l'isolamento di vibrioni di V. cholerae appartenenti al gruppo Ol. Se necessario, la presenza dei geni di patogenicità ctxAB, tcp, toxR e hap viene determinata in tali vibrioni mediante PCR.

La diagnosi sierologica del colera è di natura ausiliaria. A tale scopo, si può utilizzare la reazione di agglutinazione, ma è preferibile determinare il titolo di anticorpi vibriocidi o antitossine (gli anticorpi contro il colera vengono determinati con metodi immunoenzimatici o di immunofluorescenza).

Diagnostica di laboratorio dei vibrioni patogeni non colerici

Il metodo principale per diagnosticare le malattie causate da vibrioni patogeni non colerici è quello batteriologico, che utilizza terreni selettivi come TCBS, MacConkey, ecc. L'appartenenza della coltura isolata al genere Vibrio viene determinata sulla base delle caratteristiche chiave dei batteri di questo genere.

Trattamento del colera

Il trattamento dei pazienti affetti da colera dovrebbe consistere principalmente nella reidratazione e nel ripristino del normale metabolismo idrico-salino. A tale scopo, si raccomanda l'utilizzo di soluzioni saline, ad esempio, con la seguente composizione: NaCl - 3,5; NaHC03 - 2,5; KCl - 1,5 e glucosio - 20,0 g per 1 litro d'acqua. Tale trattamento, patogeneticamente comprovato, in combinazione con una terapia antibiotica razionale, consente di ridurre il tasso di mortalità nel colera all'1% o meno.

Prevenzione specifica del colera

Per creare l'immunità artificiale, è stato proposto un vaccino contro il colera, composto da ceppi uccisi di Inaba e Ogawa; un tossoide colerico per uso sottocutaneo e un vaccino chimico bivalente enterale composto da anatossina e antigeni somatici dei sierotipi di Inaba e Ogawa, poiché non si forma immunità crociata. Tuttavia, la durata dell'immunità post-vaccinazione non supera i 6-8 mesi, quindi le vaccinazioni vengono effettuate solo in base alle indicazioni epidemiologiche. La profilassi antibiotica si è dimostrata efficace nei focolai di colera, in particolare con la tetraciclina, a cui il vibrione del colera è altamente sensibile. Altri antibiotici efficaci contro il V. cholerae possono essere utilizzati allo stesso scopo.