Il ruolo dei depositi di cristalli nella patogenesi dell'osteoartrite

Cristalli di fosfato di calcio basico (BCP) si trovano nel liquido sinoviale del 30-60% dei pazienti con osteoartrite. Secondo A. Swan et al. (1994), cristalli contenenti calcio si trovano nel liquido sinoviale di un numero molto maggiore di pazienti con osteoartrite; tuttavia, a causa delle dimensioni estremamente ridotte dei cristalli o del loro basso numero, non vengono identificati con le tecniche convenzionali. La presenza di cristalli di BCP nel liquido sinoviale è correlata ai segni radiografici di degenerazione della cartilagine articolare ed è associata a un maggiore volume di versamento rispetto al versamento nelle articolazioni del ginocchio senza cristalli. Uno studio sui fattori che influenzano la progressione radiografica della gonartrosi ha dimostrato che la deposizione di cristalli di pirofosfato di calcio diidrato (CPPD) è un fattore predittivo di un esito clinico e radiografico sfavorevole. In uno studio su pazienti anziani, è stata riscontrata un'associazione tra osteoartrite e condrocalcinosi, in particolare nel compartimento tibiofemorale laterale del ginocchio e nelle prime tre articolazioni metacarpofalangee. Non è raro che entrambi i tipi di cristalli, OFC e PFC, siano presenti in pazienti con osteoartrite.

Clinicamente, la degenerazione della cartilagine articolare causata dalla deposizione di cristalli di calcio differisce da quella osservata nell'osteoartrosi primaria. Se i cristalli fossero un semplice epifenomeno della degenerazione cartilaginea, si troverebbero nelle articolazioni più frequentemente colpite dall'osteoartrosi primaria, ovvero ginocchia, anche e piccole articolazioni delle mani. Al contrario, le malattie da deposizione di cristalli colpiscono più spesso articolazioni non tipiche dell'osteoartrosi primaria, come spalla, polso e gomito. La presenza di cristalli nel liquido articolare (versamento) è associata a una degenerazione più grave della cartilagine articolare. La questione di quale sia la causa e quale l'effetto, la deposizione di cristalli o la degenerazione cartilaginea, è dibattuta. Una posizione intermedia è occupata dalla seguente ipotesi: un'anomalia primaria nel metabolismo della cartilagine porta alla sua degenerazione e la deposizione secondaria di cristalli ne accelera la degradazione (la cosiddetta teoria del ciclo di amplificazione).

Il meccanismo esatto con cui i cristalli di calcio danneggiano la cartilagine articolare è sconosciuto e viene riassunto di seguito. Teoricamente, i cristalli di calcio possono danneggiare direttamente i condrociti. Tuttavia, l'esame istologico raramente rivela cristalli in prossimità dei condrociti e, ancora più raramente, vengono ingeriti da questi. Il meccanismo più probabile è la fagocitosi dei cristalli da parte delle cellule di rivestimento sinoviale, seguita dal rilascio di enzimi proteolitici o dalla secrezione di citochine che stimolano il rilascio di enzimi da parte dei condrociti. Questo concetto è supportato da uno studio sul ruolo della sinovite indotta da PFKD nello sviluppo di osteoartrite rapidamente progressiva nell'artropatia da pirofosfato. In questo studio, cristalli di pirofosfato diidrato di calcio (1 o 10 mg) sono stati iniettati settimanalmente nel ginocchio destro di conigli con osteoartrite indotta da meniscectomia laterale parziale. È emerso che dopo 8 iniezioni, l'articolazione del ginocchio destro mostrava alterazioni significativamente più gravi rispetto a quella sinistra. L'intensità dell'infiammazione sinoviale è risultata correlata alle iniezioni intra-articolari di cristalli di pirofosfato diidrato di calcio e alla loro dose. Nonostante le dosi di cristalli di CPPD utilizzate in questo studio superino quelle in vivo, i risultati indicano il ruolo dell'infiammazione indotta da CPPD nella progressione dell'osteoartrite nell'artropatia da pirofosfato.

I possibili meccanismi di induzione del danno alla cartilagine articolare da parte dei cristalli contenenti calcio sono associati alle loro proprietà mitogeniche, alla capacità di indurre le MMP e di stimolare la sintesi delle prostaglandine.

Effetto mitogenico dei cristalli contenenti calcio. Nelle artropatie associate a cristalli, si osserva frequentemente la proliferazione delle cellule del rivestimento sinoviale, con i cristalli stessi solo parzialmente responsabili di questo processo. L'aumento del numero di cellule sinoviali è accompagnato da un aumento della secrezione di citochine, che promuovono la condrolisi e inducono la secrezione di enzimi proteolitici. I cristalli di OFC, a concentrazioni riscontrate nella patologia articolare umana, stimolano in modo dose-dipendente la mitogenesi di colture di fibroblasti cutanei a riposo e di fibroblasti sinoviali di cane e topo. I cristalli di pirofosfato di calcio diidrato, urato, solfato, carbonato e fosfato di calcio stimolano la crescita cellulare. L'inizio e il picco dell'incorporazione di ( ^3H )-timidina indotti da questi cristalli sono ritardati di 3 ore rispetto alla stimolazione delle cellule con siero sanguigno. Questo periodo di tempo può essere necessario per la fagocitosi e la dissoluzione dei cristalli. L'aggiunta di cristalli di controllo delle stesse dimensioni (ad esempio, polvere di diamante o particelle di lattice) non ha stimolato la mitogenesi. I cristalli di urato monoidrato di sodio presentavano deboli proprietà mitogeniche ed erano significativamente inferiori a quelli dell'urato di calcio, a indicare l'importanza del contenuto di calcio dei cristalli nella mitogenesi. I cristalli di OFC sintetico presentavano le stesse proprietà mitogeniche dei cristalli ottenuti da pazienti con condrocalcinosi. L'effetto mitogenico dei cristalli contenenti calcio non era il risultato di un aumento del contenuto di calcio nel mezzo nutritivo circostante in vitro, poiché la dissoluzione dei cristalli di fosfato di calcio basico nel mezzo nutritivo non stimolava l'incorporazione di ( ^3H )-timidina da parte dei fibroblasti.

Un meccanismo proposto per la mitogenesi indotta da OFC è che la proliferazione anomala delle cellule sinoviali possa essere dovuta, almeno in parte, all'endocitosi e alla dissoluzione intracellulare dei cristalli, che aumenta le concentrazioni citoplasmatiche di Ca ²⁺ e attiva la via calcio-dipendente che porta alla mitogenesi. Questo concetto è supportato dalla necessità di un contatto diretto cellula-cristallo per stimolare la mitogenesi, poiché l'esposizione delle colture cellulari ai cristalli induceva la crescita cellulare, mentre l'esposizione delle cellule private di tale contatto non lo faceva. Per studiare la necessità di fagocitosi dei cristalli a seguito dell'interazione cellula-cristallo, le cellule sono state coltivate con ⁴⁵ Ca-OPC e ( ^3H )-timidina. Si è scoperto che le cellule contenenti ⁴⁵ Ca-OPC incorporavano significativamente più ( ^3H )-timidina rispetto alle cellule senza marcatura con fosfato di calcio basico. Nelle colture di macrofagi, l'inibizione dell'endocitosi dei cristalli da parte della citocalasina ha portato all'inibizione della dissoluzione dei cristalli, evidenziando ulteriormente la necessità della fagocitosi.

I cristalli contenenti calcio sono solubili in acido. Dopo la fagocitosi, i cristalli si dissolvono nell'ambiente acido dei fagolisosomi dei macrofagi. Clorochina, cloruro di ammonio, bafilomicina A1 e tutti gli agenti lisosomotrofici che aumentano il pH lisosomiale inibiscono in modo dose-dipendente la dissoluzione dei cristalli intracellulari e l'assorbimento di (3H)-timidina ^nei fibroblasti coltivati con cristalli di fosfato di calcio basico.

L'aggiunta di cristalli OFC a una coltura di fibroblasti monostrato ha causato un immediato aumento di dieci volte del calcio intracellulare, che è tornato ai livelli basali dopo 8 minuti. La fonte di calcio era prevalentemente costituita da ioni extracellulari, poiché i cristalli di fosfato di calcio basico erano stati aggiunti a un terreno di coltura privo di calcio. Il successivo aumento della concentrazione di calcio intracellulare è stato osservato dopo 60 minuti ed è durato per almeno 3 ore. In questo caso, la fonte di calcio era costituita da cristalli fagocitati disciolti nei fagolisosomi.

È stato scoperto che l'effetto mitogenico dei cristalli di OFC è simile a quello del PDGF come fattore di crescita; come quest'ultimo, i cristalli di OFC mostrano sinergismo con IGF-1 e plasma sanguigno. Il blocco di IGF-1 riduce la mitogenesi cellulare in risposta a OFC. PG Mitchell et al. (1989) hanno dimostrato che l'induzione della mitogenesi nei fibroblasti Balb/c- ₃ T3 _{da parte} dei cristalli di OFC richiede la presenza della proteina chinasi C (PKC) serina/treonina, uno dei principali mediatori dei segnali generati durante la stimolazione esterna delle cellule con ormoni, neurotrasmettitori e fattori di crescita. Una diminuzione dell'attività della PKC nelle cellule Balb/c-3 T3 _{inibisce l'induzione mediata daOFC} dei proto-oncogeni c-fos e c-myc, ma non influenza la stimolazione di questi oncogeni mediata dal PDGF.

L'aumento del calcio intracellulare in seguito alla dissoluzione dei cristalli fagocitati non è l'unica via di segnalazione per la mitogenesi. Quando fattori di crescita come il PDGF si legano al loro recettore di membrana, viene stimolata la fosfolipasi C (una fosfodiesterasi), che idrolizza il fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato per formare i messaggeri intracellulari inositolo-3-fosfato e diacilglicerolo. Il primo rilascia calcio dal reticolo endoplasmatico modulando l'attività di enzimi calcio-dipendenti e calcio/calmodulina-dipendenti, come le protein chinasi e le proteasi.

R. Rothenberg e H. Cheung (1988) hanno riportato un aumento della degradazione del fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato da parte della fosfolipasi C in cellule sinoviali di coniglio in risposta alla stimolazione con cristalli di OFC. Quest'ultimo ha aumentato significativamente il contenuto di inositolo-1-fosfato nelle cellule con ( ^3H )-inositolo marcato; il picco è stato raggiunto entro 1 minuto e si è mantenuto per circa 1 ora.

Il diacilglicerolo è un potenziale attivatore del pirofosfato di calcio diidrato. Poiché i cristalli di OFC aumentano l'attività della fosfolipasi C, che porta all'accumulo di diacilglicerolo, di conseguenza, ci si può aspettare un aumento dell'attivazione della PKC. PG Mitchell et al. (1989) hanno confrontato gli effetti dei cristalli di OFC e del PDGF sulla sintesi del DNA da parte _{dei fibroblasti Balb/c-3T3}. In coltura cellulare, la PKC è stata inattivata dall'incubazione delle cellule con il diestere del forbolo (TPD) che supporta il tumore, un analogo del diacilglicerolo. La stimolazione a lungo termine con basse dosi di TPD ha ridotto l'attività della PKC, mentre una singola stimolazione con una dose elevata l'ha attivata. La stimolazione della sintesi del DNA da parte dei cristalli di OFC è stata soppressa dopo l'inattivazione della PKC, indicando l'importanza di questo enzima nella mitogenesi indotta da OFC. In precedenza, GM McCarthy et al. (1987) hanno dimostrato un legame tra la risposta mitogenica dei fibroblasti umani ai cristalli di OFC e l'attivazione della PKC. Tuttavia, i cristalli di OFC non attivano la fosfatidilinositolo 3-chinasi o le tirosin-chinasi, confermando che il meccanismo di attivazione cellulare da parte dei cristalli di OFC è selettivo.

La proliferazione cellulare è controllata da un gruppo di geni chiamati proto-oncogeni. Le proteine foe e mye, prodotti dei proto-oncogeni c-fos e c-myc, sono localizzate nel nucleo cellulare e legate a specifiche sequenze di DNA. La stimolazione dei fibroblasti 3T3 con cristalli di OFC determina l'espressione di c-fos entro pochi minuti, che raggiunge il massimo 30 minuti dopo la stimolazione. L'induzione della trascrizione di c-myc da parte di cristalli di OFC o PDGF avviene entro 1 ora e raggiunge il massimo 3 ore dopo la stimolazione. Le cellule mantengono un livello elevato di trascrizione di c-fos e c-myc per almeno 5 ore. Nelle cellule con PCD inattivato, la stimolazione di c-fos e c-myc da parte di cristalli di OFC o TFD è significativamente soppressa, mentre l'induzione di questi geni da parte di PDGF non cambia.

I membri della famiglia delle proteine chinasi attivate da mitogeni (MAP K) sono regolatori chiave di diverse cascate di segnalazione intracellulare. Una sottoclasse di questa famiglia, p42/p44, regola la proliferazione cellulare attraverso un meccanismo che coinvolge l'attivazione dei proto-oncogeni c-fos e c-jun. I cristalli di OFC e PFKD attivano una via di segnalazione proteica chinasi che coinvolge sia p42 che p44, suggerendo un ruolo di questa via nella mitogenesi indotta dai cristalli contenenti calcio.

Infine, la mitogenesi indotta da OFC coinvolge il fattore di trascrizione nucleare κB (NF-κB), descritto per la prima volta come gene della catena leggera delle immunoglobuline κ (IgK). Si tratta di un fattore di trascrizione inducibile importante in molte vie di segnalazione perché regola l'espressione di vari geni. L'induzione di NF-κB è solitamente associata al rilascio di proteine inibitorie chiamate IκB dal citoplasma. L'induzione di NF-κB è seguita dalla traslocazione del fattore di trascrizione attivo nel nucleo. I cristalli di OFC inducono NF-κB nei fibroblasti Balb/c- _3T3 e nei fibroblasti cutanei umani.

Diversi pathway possono essere coinvolti nella trasduzione del segnale in seguito all'attivazione di NF-κB, ma tutti coinvolgono protein chinasi che fosforilano (e quindi degradano) IκB. Sulla base di studi in vitro, si pensava in precedenza che IκB fungesse da substrato per le chinasi (ad esempio, PKC e protein chinasi A). Tuttavia, è stato recentemente identificato un complesso chinasi IκB ad alto peso molecolare. Queste chinasi fosforilano specificamente i residui di serina di IκB. L'attivazione di NF-κB da parte di TNF-α e IL-1 richiede l'azione efficiente della chinasi inducente NF-κB (NIK) e della chinasi IκB. Il meccanismo molecolare dell'attivazione di NIK è attualmente sconosciuto. Sebbene i cristalli di OFC attivino sia PKC che NF-κB, non è noto in che misura questi due processi possano essere correlati. Poiché la modificazione della chinasi GκB avviene tramite fosforilazione, non si può escludere un ruolo della PKC nell'induzione di NF-κB da parte dei cristalli di OFC attraverso la fosforilazione e l'attivazione della chinasi GκB. Questo concetto è supportato dall'inibizione della mitogenesi indotta dai cristalli di OFC e dell'espressione di NF-κB da parte dell'inibitore della PKC, la staurosporina. Analogamente, la staurosporina può inibire la chinasi GκB e, di conseguenza, la protein chinasi A e altre protein chinasi.

Pertanto, il meccanismo della mitogenesi indotta dai cristalli OFC nei fibroblasti comprende almeno due processi diversi:

• un rapido evento legato alla membrana che provoca l'attivazione di PKC e MAP K, l'induzione di NF-κB e proto-oncogeni,
• dissoluzione intracellulare più lenta dei cristalli, che porta ad un aumento del contenuto intracellulare di Ca ²⁺ e quindi all'attivazione di una serie di processi dipendenti dal calcio che stimolano la mitogenesi.

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Induzione mediante cristalli contenenti calcio MMP

I mediatori del danno tissutale causato dai cristalli contenenti calcio sono le MMP: collagenasi-1, stromelisina, gelatinasi da 92 kD e collagenasi-3.

Data la relazione tra il contenuto di cristalli di OFC e la distruzione del tessuto articolare, è stata avanzata l'ipotesi che i cristalli di OFC e forse anche alcuni collageni vengano fagocitati dalle cellule sinoviali. I sinoviciti stimolati proliferano e secernono proteasi. Questa ipotesi è stata testata in vitro aggiungendo OFC naturale o sintetico, PFCD e altri cristalli a sinoviciti umani o canini in coltura. L'attività delle proteasi e delle collagenasi neutre è aumentata in modo dose-dipendente ed è risultata circa 5-8 volte superiore a quella della coltura cellulare di controllo coltivata senza cristalli.

Nelle cellule coltivate in un mezzo contenente cristalli, è stata rilevata la co-induzione di collagenasi-1, stromelisina e gelatinasi-mRNA da 92 kDa, seguita dalla secrezione di enzimi nel mezzo.

I cristalli OFC hanno inoltre indotto l'accumulo di mRNA della collagenasi-1 e della collagenasi-2 nei condrociti suini maturi, seguito dalla secrezione degli enzimi nel mezzo.

GM McCarty et al. (1998) hanno studiato il ruolo della dissoluzione dei cristalli intracellulari nella produzione di MMP indotta dai cristalli stessi. L'innalzamento del pH lisosomiale con bafilomicina A ha inibito la dissoluzione dei cristalli intracellulari e ha anche attenuato la risposta proliferativa dei fibroblasti umani ai cristalli di OFC, ma non ha inibito la sintesi e la secrezione di MMP.

Né il fosfato di calcio basico né i cristalli di PFCD hanno indotto la produzione di IL-1 in vitro, al contrario dei cristalli di urato di sodio.

I dati attuali indicano chiaramente una stimolazione diretta della produzione di MMP da parte dei fibroblasti e dei condrociti in seguito al contatto con cristalli contenenti calcio.

I sintomi dell'osteoartrite indicano un ruolo significativo dell'MMP nella progressione della malattia. La presenza di cristalli contenenti calcio aumenta la degenerazione dei tessuti delle articolazioni colpite.

Stimolazione della sintesi delle prostaglandine

Oltre a stimolare la crescita cellulare e la secrezione di enzimi, i cristalli contenenti calcio causano il rilascio di prostaglandine dalle colture cellulari di mammifero, in particolare di PGE2 _. Il rilascio di PGE2 si verifica _in tutti i casi entro la prima ora dall'esposizione delle cellule ai cristalli. R. Rothenberg (1987) ha determinato che le principali fonti di acido arachidonico per la sintesi di PGE2 _sono la fosfatidilcolina e la fosfatidiletanolammina, e ha anche confermato che la fosfolipasi A2 _e NOX sono le vie dominanti per _{la produzione} di PGE2.

La PGE1 può anche essere rilasciata in risposta ai cristalli di OFA. GM McCarty et al. (1993, 1994) hanno studiato gli effetti di PGE2 _, PGE e del suo analogo misoprostolo sulla risposta mitogenica dei fibroblasti umani ai cristalli di OFA. Tutti e tre gli agenti hanno inibito la risposta mitogenica in modo dose-dipendente, con PGE e misoprostolo che hanno mostrato un'attività inibitoria più pronunciata. PGE2 e misoprostolo, ma non PGE2 _, hanno inibito l'accumulo di mRNA della collagenasi in risposta ai cristalli di OFA.

MG McCarty e H. Cheung (1994) hanno studiato il meccanismo di attivazione cellulare mediata da OFC da parte di PGE. Gli autori hanno dimostrato che PGE, un induttore di cAMP intracellulare più potente di PGE2 _e PGE, inibisce la mitogenesi indotta da OFC e la produzione di MMP attraverso una via di trasduzione del segnale dipendente da cAMP. È possibile che l'aumento della produzione di PGE indotto dai cristalli di OFC indebolisca i loro altri effetti biologici (mitogenesi e produzione di MMP) attraverso un meccanismo di feedback.

Infiammazione indotta dai cristalli

Cristalli contenenti calcio si trovano spesso nel liquido sinoviale dei pazienti con osteoartrosi, tuttavia episodi di infiammazione acuta con leucocitosi sono rari sia nell'osteoartrosi che nelle artropatie associate a cristalli (ad esempio, la sindrome della spalla di Milwaukee). Il potenziale flogistico dei cristalli può essere modificato da numerosi fattori inibitori. R. Terkeltaub et al. (1988) hanno dimostrato la capacità del siero e del plasma sanguigno di inibire significativamente la risposta dei granulociti neutrofili ai cristalli di fosfato di calcio basico. I fattori che causano tale inibizione sono le proteine leganti i cristalli. Uno studio su una di queste proteine, una glicoproteina ₂ -HS (AHSr), ha dimostrato che l'AHSР è l'inibitore più potente e specifico della risposta dei granulociti neutrofili ai cristalli di OFC. L'AHSr è una proteina sierica di origine epatica; è noto che, rispetto ad altre proteine sieriche, si trova in concentrazioni relativamente elevate nell'osso e nel tessuto mineralizzante. Inoltre, l'AHSr è presente nel liquido sinoviale "non infiammato" ed è stato rilevato anche sui cristalli di fosfato di calcio basico nel liquido sinoviale nativo. Pertanto, non si può escludere la possibilità che l'AHSr moduli il potenziale flogogeno dei cristalli di fosfato di calcio basico in vivo.

Per riassumere tutto quanto sopra, presentiamo due schemi di patogenesi dell'osteoartrosi proposti da WB van den Berg et al. (1999) e M. Carrabba et al. (1996), che combinano fattori meccanici, genetici e biochimici.