Cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale

Il sangue del cordone ombelicale agisce come una fonte di cellule staminali ematopoietiche sul potenziale proliferativo e sulle capacità di ripopolamento delle cellule ematopoietiche. È stato ripetutamente dimostrato che, al momento della consegna, il sangue del cordone ombelicale contiene un numero sufficientemente ampio di cellule progenitrici ematopoietiche scarsamente impegnate. Alcuni autori ritengono che il vantaggio del trapianto di cellule staminali ematopoietiche del cordone ombelicale sia che non è necessario cercare un donatore compatibile con antigeni HLA. Secondo loro, l'immaturità del sistema immunitario del neonato causa una diminuita attività funzionale delle cellule immunocompetenti e, di conseguenza, il tasso di sviluppo della grave reazione "trapianto contro ospite", rispetto al trapianto di midollo osseo. In questo trapianto di cellule sopravvivenza del sangue del cordone ombelicale è non inferiore a cellule di midollo osseo, anche nel caso di utilizzo di un numero inferiore di GSK somministrato per 1 kg di peso del paziente. Tuttavia, a nostro avviso, il numero ottimale di domande trapiantato cellule del sangue cordone necessarie per attecchimento efficiente nel corpo del ricevente, la loro compatibilità immunologica, e una serie di altri aspetti del trapianto di cellule staminali ematopoietiche del cordone ombelicale richiede un'analisi più grave.

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Ottenimento di cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone ombelicale

La procedura per ottenere cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone ombelicale richiede la sua assunzione immediatamente dopo la nascita e la sua separazione dalla placenta, quando la placenta è in utero o ex utero, così come per il taglio cesareo, ma anche ex utero. È dimostrato che in caso di riduzione del tempo dalla nascita alla separazione del neonato dalla placenta a 30 secondi, il volume di sangue del cordone ombelicale ottenuto aumenta in media di 25-40 ml. Con una procedura successiva, si perde la stessa quantità di sangue. È stabilito che la separazione precoce del bambino dal post-ustione non comporta conseguenze negative per il neonato.

L'istituto di ricerca russo di Ematologia e Trasfusionale sviluppato una tecnologia efficace e di basso costo sia per il sangue del cordone a linee fisiologiche ((70,2 + 25,8) ml) e taglio cesareo ((73,4 + 25,1) ml). Procedimento per la separazione di sangue del cordone ombelicale con una sufficientemente elevata resa di cellule mononucleari e nucleato - (83,1 + 9,6) e (83,4 + 14,1)%, rispettivamente. Metodo migliorato per la crioconservazione di sangue del cordone che assicura un'elevata sicurezza di cellule mononucleari e CFU-GM - (96,8 + 5,7) e (89,6 + 22,6)%, rispettivamente. È stata determinata l'efficienza del metodo di drenaggio del prelievo del sangue cordonale mediante il contenitore "Kompoplast-300" (Russia). Recinzione autori sangue del cordone eseguite immediatamente dopo la nascita e la sua separazione dalla placenta, in termini di collocazione placenta in utero o ex utero. Prima puntura della vena ombelicale cordone ombelicale volta trattato con 5% tintura di iodio, e quindi due volte - 70% di alcol etilico. Il sangue scorreva attraverso i tubi di collegamento al contenitore spontaneamente. La durata della recinzione è durata non più di 10 minuti. 66 raccolti campioni di sangue ombelicale volume Metodo drenaggio media (72 + 28) ml, e il numero di leucociti nel campione media completo - (1,1 + 0,6) x x 107. L'analisi del sangue del cordone ombelicale di sterilità (contaminazione batterica, HIV-1 virus di epatite B e C, sifilide, e citomegalovirus) in un solo campione sono stati identificati anticorpi IgG dell'epatite C. In un altro studio una volta che la placenta dopo la nascita superficie fetale è stata posta su un apposito telaio verso il basso, il cavo è stato trattato con 5% di sodio iodio e 75% di etile alcol esimo. Le vene del cordone ombelicale sono state drenate con un ago dal sistema trasfusionale (G16). Il sangue drenato nel contenitore spontaneamente. Il volume di sangue assunto in questo modo è stato mediato (55 + 25) ml. Il documento G. Kogler et al (1996) cavo taken sangue senso chiuso e ottenuto grandi volumi di sangue - in media (79 + 26) ml. Gli autori di notare che tra 574 cavo di campioni di sangue contengono circa il 7% inferiore a 40 ml di sangue, che non consentono di utilizzarli per il trapianto. K. Isoyama et al (1996), prendendo il sangue del cordone da exfusion attivo usando siringhe, ricevuto in media 69,1 ml di sangue (volume di sangue del cordone variava da 15 a 135 ml). Infine, collaboratori A. Abdel-Mageed PI (1997) di punovinnoy vena cateterizzazione sono stati ottenuti in una media di 94 ml di sangue del cordone (da 56 a 143 ml).

Per ridurre il rischio di infezione iatrogena e contaminazione da secrezioni materne sviluppati raccolta del sangue sistema chiuso basato sul sistema transfuzioinoy ampiamente utilizzato Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA), contenente 62,5 ml di CPDA (citrato-fosfato-destrosio con adenina) come anticoagulante. La tecnologia per la produzione di materiale è di fondamentale importanza per la preparazione di un campione di qualità rispetto alla quantità di contenuto e purezza della sospensione cellulare. Dei metodi esistenti di raccolta del sangue del cordone, kotoryeuslovno classificati in chiuso, semiaperto e aperto preferenza sistema sleduetotdavat prima, come in un sistema chiuso riduce significativamente il rischio di contaminazione microbica del materiale, così come la contaminazione della sospensione cellulare della cellula madre.

A. Nagler e co-autori (1998) hanno condotto un'analisi comparativa dell'efficacia di tutti e tre i sistemi di campionamento del sangue del cordone ombelicale. Nella prima variante, la procedura è stata eseguita in un sistema chiuso mediante l'esfusione di sangue direttamente nel contenitore. Nella seconda variante, il sangue del cordone ombelicale è stato ottenuto mediante il metodo di exfusion di sangue attivo di siringhe1 con ulteriore lavaggio delle vene della placenta e simultaneo drenaggio del sangue nel contenitore (metodo aperto). Nella terza variante, il sangue è stato prelevato in un sistema semi-aperto estraendolo attivamente con siringhe e lavando attraverso l'arteria del cordone ombelicale con l'esfusione simultanea nel contenitore. Nella prima versione, gli autori hanno ricevuto sangue del cordone ombelicale nel volume (76,4 + 32,1 ml) con una conta leucocitaria (10,5 + 3,6) x 10 ⁶ per 1 ml di sangue. Nella seconda variante, gli indici corrispondenti erano (174,4 + 42,8) ml e (8,8 + 3,4) x 10 ⁶ / ml; nel terzo - (173,7 + 41,3) ml e (9,3 + 3,8) x 10 ⁶ / ml. L'infezione più frequente dei campioni di sangue del cordone ombelicale è stata notata quando si utilizza un sistema aperto. Viene stabilita una correlazione diretta tra la massa della placenta e il volume di sangue estratto - con l'aumento della massa placenta aumenta la quantità di sangue raccolto.

Dopo il campionamento del sangue del cordone ombelicale, segue la fase di separazione: isolamento delle cellule mononucleate e purificazione della sospensione cellulare dagli eritrociti. Nelle condizioni sperimentali, le cellule nucleate vengono isolate mediante il metodo della loro sedimentazione con metilcellulosa durante la lisi degli eritrociti di ammonio mediante cloruro. Tuttavia, per scopi clinici, la metilcellulosa non deve essere utilizzata, poiché la perdita di cellule staminali ematopoietiche raggiunge il 50-90%. Lisi globuli rossi in connessione con grandi volumi di soluzione di lavoro nella clinica anche appena effettuata, anche se la percentuale di separazione in questo modo le cellule nucleate con il fenotipo di cellule CD34 + e cellule progenitrici funzioni CFU-GM e CFU-GEMM notevolmente superiore. È stato segnalato un nuovo agente per l'isolamento delle cellule mononucleate nella soluzione di densità del compratore a gradiente di densità (BDS72). Questa sostanza ha i seguenti parametri fisiologici: pH - 7.4, osmolalità - 280 mosm / kg, densità - 1.0720 g / ml. Secondo gli autori, con il suo aiuto è possibile isolare fino al 100% delle cellule CD34-positive e rimuovere il 98% dei globuli rossi. Tuttavia, la clinica non applica ancora BDS72.

I metodi di separazione testati cellule nucleate dal sangue del cordone ombelicale è tipicamente usato una soluzione HES 10% o soluzione di gelatina 3%. L'efficienza di precipitazione di erythrocytes e l'isolamento di celle nucleate in entrambi i casi è approssimativamente uguale. Tuttavia, nel caso di impiego come agente di gelatina di sedimentazione possibile avere un numero alquanto maggiore di CFU-GM, rispetto all'utilizzo HES. Si presume che la differenza di efficienza di recupero CFU-GM velocità disuguale dovuta alla deposizione di singole frazioni o cellule nucleate capacità molecole HES assorbite su recettori di superficie cellulare ematopoietiche e quindi bloccare loro sensibilità ai fattori stimolanti le colonie, che vengono utilizzati quando la coltura CFU-GM in vitro. Tuttavia, entrambi i sedimentatori potrebbero essere adatti per isolare le cellule nucleate durante la creazione di banche del sangue del cordone ombelicale su larga scala.

I metodi di separazione e crioconservazione del sangue del cordone ombelicale in linea di principio non differiscono da quelli utilizzati nel lavoro con cellule staminali ematopoietiche del sangue periferico e del midollo osseo di donatori adulti. Ma quando si prepara un gran numero di campioni di sangue del cordone ombelicale per le sue banche, i metodi di separazione devono essere, prima di tutto, a basso costo. Pertanto, ora, purtroppo, per le esigenze cliniche già utilizzate sono utilizzati metodi di isolamento e crioconservazione dei linfociti del cordone ombelicale, e i metodi più efficaci ma economicamente efficaci rimangono gli stessi sperimentatori.

In generale, sono stati stabiliti i criteri per stimare il numero di cellule ematopoietiche e i requisiti per lo studio di campioni di sangue del cordone ombelicale al fine di identificare agenti infettivi. Al fine di garantire il trapianto di cellule ematiche del cordone ematopoietico, tutti i campioni di sangue devono essere esaminati principalmente per le infezioni ematogene e le malattie genetiche. Alcuni autori raccomandano metodi speciali supplementari di studio del sangue del cordone ombelicale a scopo di diagnosi di malattie genetiche come la talassemia e anemia falciforme, deficit di adenosina deaminasi, agammaglobulinemia Bruton, malattie Harlera e scommettitore.

Secondo le raccomandazioni Ticheli L. Et al (1998), in ciascun campione di sangue del cordone ombelicale è necessario determinare il numero di cellule nucleate, cellule SB34-positivi e CFU-GM, trasportare HLA-tipizzazione per determinare il gruppo sanguigno ABO e Rh sua appartenenza. Inoltre, la semina avviene batteriologici, test sierologici per HIV e CMV, HBsAg, epatite C, HTLY-I e HTLV-II (leucemia a cellule T, umano), sifilide, toxoplasmosi. Una reazione a catena della polimerasi contro il citomegalovirus e l'infezione da HIV è obbligatoria.

La stessa procedura per ottenere il sangue del cordone ombelicale deve essere eseguita in stretta conformità con i principi della bioetica medica. Prima dell'inizio della raccolta del sangue è necessario ottenere il consenso della donna incinta per la sua attuazione. Il colloquio preliminare con una donna incinta per ottenere il consenso informato a compiere tutte le manipolazioni, dall'esfusione di sangue al completamento della documentazione, viene effettuato solo da personale medico. In ogni caso inammissibile eseguire qualsiasi di queste procedure da parte di personale con sostanze biologiche, chimiche, farmaceutiche e altre attività non medici, in considerazione della violazione delle norme stabilite della bioetica e dei diritti umani. Per i test positivi per carrier HBsAg, anticorpi contro l'agente eziologico dell'epatite C, HIV e sifilide sangue del cordone non prese, ed i campioni di sangue raccolti è già scartati e distrutti. Va notato che il trasporto di infezioni latenti nei neonati è molto più rara rispetto agli adulti, quindi la probabilità di trasferimento e sviluppo di complicanze infettive di infusioni ematopoietiche di cellule del sangue del cordone ematogena è significativamente inferiore nel caso di trapianto di midollo osseo da donatori adulti.

Un punto importante nell'applicazione del sangue del cordone ombelicale nella clinica è la valutazione del trapianto, che si basa sulla determinazione del numero di cellule staminali ematopoietiche nel campione di sangue cordonale e delle dosi cellulari richieste per il trapianto. Gli standard per il numero ottimale di cellule del sangue del cordone ombelicale richieste per il trapianto non sono ancora stati sviluppati. Non esiste un punto di vista generalmente accettato nemmeno su parametri di routine come il numero di cellule CD34-positive e CFU-GM. Alcuni autori hanno valutato il potenziale delle cellule ematopoietiche mediante analisi delle colture a lungo termine con determinazione del contenuto di unità formanti colonie comuni di granulociti, eritrociti, monociti e megacariociti - CFU-GEMM.

Tuttavia, in ambito clinico, la valutazione standard del trapianto di sangue cordonale solitamente include solo la determinazione del numero di cellule nucleate o mononucleate.

Conservazione delle cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone ombelicale

Alcuni problemi esistono nella tecnologia di conservazione delle cellule del sangue del cordone ematopoietico. Quando la crioconservazione di cellule staminali ematopoietiche per raggiungere la modalità di congelamento ottimale devono ridurre al minimo la quantità di sangue del cordone ombelicale e globuli rossi precedentemente rimosse per evitare emolisi e il rischio di reazioni di incompatibilità antigeni eritrocitari (ABO, Rh). Per questi scopi, sono adatti vari metodi per isolare le cellule nucleate. Nei primi anni '90 del secolo scorso il metodo più diffuso di separare cellule nucleate in un gradiente di densità Ficoll basato su con una densità di 1,077 g / ml, o percolazione con densità 1.080 g / ml. Separazione del sangue cordone mediante gradiente di densità permette di selezionare cellule mononucleate prevalentemente ma comporta notevoli perdite di cellule progenitrici ematopoietiche - fino al 30-50%.

L'efficienza di sedimentazione dell'amido di idrossietile nel processo di isolamento delle cellule del sangue del cordone ombelicale è stimata in diversi modi. Alcuni autori indicano una bassa qualità della separazione usando questo metodo, mentre altri ricercatori, al contrario, tra tutti i possibili metodi preferiscono allocare sangue cordonale HSC usando precisamente una soluzione al 6% di amido idrossietilico. Ciò evidenzia l'elevata efficienza di sedimentazione delle cellule emopoietiche, che, secondo alcuni dati, va dall'84% al 90%.

Sostenitori di un altro punto di vista ritengono che quasi tutti i processi di frazionamento coinvolgono cellule grandi perdite yadrosoderzhashih e offrono di rendere separazione per centrifugazione, separando il sangue del cordone in 3 frazioni: eritrociti, leucociti e anello plasma. Separare le cellule in questo modo, gli inventori hanno trovato che il contenuto delle cellule mononucleari di cellule progenitrici ematopoietiche precoci e cellule CD34 + dell'immunofenotipo definitiva era rispettivamente 90, 88 e 100% del livello originale. Quantità simili di crescita purificato in questo metodo di cellule del sangue del cordone ombelicale ottenuti da altri ricercatori: dopo la sedimentazione nucleate allocato 92%, 98% - mononucleare, 96% - cellule CD34-positive e 106% di unità formanti colonie.

Alla fine degli anni '90, la gelatina era ampiamente usata come agente sedimentario. Nella pratica clinica, con l'aiuto della gelatina, le cellule staminali ematopoietiche dal sangue del cordone ombelicale sono state isolate dal 1994. Quando si utilizza una soluzione al 3% di gelatina, l'efficienza di isolamento delle cellule nucleate raggiunge l'88-94%. L'uso diffuso di gelatina nello sviluppo della banca del sangue del cordone ombelicale ha confermato i suoi vantaggi rispetto ad altri agenti di sedimentazione. Analisi comparativa di tutti i suddetti metodi di isolamento di cellule nucleate in termini di loro uso sequenziale in ciascuno dei campioni di sangue del cordone test ha dimostrato che le cellule mononucleate sedimentatore-out ottimali con fenotipo CD34 + / CD45 +, nonché dal numero di CFU-GM e CFU-GEMM è 3% soluzione di gelatina. Essa ha dimostrato di essere un metodo significativamente meno efficaci usando gradiente di densità Ficoll, e l'uso di metilcellulosa e amido idrossietilico in cui la perdita di cellule ematopoietiche raggiunto il 60%.

L'espansione del volume di trapianto di cellule staminali del sangue del cordone ombelicale è associata non solo allo sviluppo di metodi per la loro produzione, ma anche allo stoccaggio. Ci sono molti problemi direttamente correlati alla preparazione del sangue del cordone ombelicale per la conservazione a lungo termine e la scelta della tecnologia di crioconservazione ottimale per i suoi campioni. Tra questi vi sono i problemi della convenienza di eseguire procedure di separazione, l'uso di vari media crioconservatori e l'uso di metodi per preparare le cellule scongelate per il trapianto. Il trasporto di campioni nativi di sangue cordonale viene spesso effettuato da regioni lontane dai centri ematologici. In relazione a ciò, si pone il problema dei periodi ammissibili per la conservazione del sangue cordonale dal momento del suo ricevimento all'inizio della crioconservazione, che è di particolare importanza nello sviluppo delle banche del sangue del cordone ombelicale.

Lo studio dell'attività funzionale delle cellule del sangue del cordone ematopoietiche dopo stoccaggio a lungo termine (fino a 12 anni) in azoto liquido rivelato che circa il 95% delle cellule emopoietiche durante questo tempo non perdono la loro elevata capacità proliferativa. La carta Yurasova S. Et al (1997) hanno dimostrato che il sangue del cordone conservato a temperatura ambiente (22 ° C) oppure a 4 ° C per 24 ore e 48 non riduce sostanzialmente la vitalità delle cellule ematopoietiche che il livello iniziale è opportunamente 92 e 88%. Tuttavia, se il tempo di conservazione è esteso a tre giorni, il numero di cellule nucleate vitali nel sangue del cordone ombelicale è significativamente ridotto. Allo stesso tempo, altri studi hanno trovato che durante la conservazione per 2-3 giorni ad una temperatura di 22 ° C o 4 principalmente influenzato la vitalità dei granulociti maturi, ma non le cellule emopoietiche.

La vitalità delle cellule staminali ematopoietiche del sangue cordonale può essere influenzata negativamente dai componenti del sistema per la sua raccolta. L'analisi degli effetti di diversi anticoagulanti, quale meccanismo di azione è dovuta al legame di ioni calcio (ACD, EDTA, XAPD-1) per cellule progenitrici ematopoietiche in condizioni di conservazione del sangue del cordone di 24 a 72 ore rivelato loro impatto negativo sulla vitalità delle cellule nucleate. A questo proposito, gli autori suggeriscono l'uso di PBS (tampone fosfato) con l'aggiunta di eparina nativa senza conservante alla concentrazione di 20 U / ml, che, a loro avviso, rende possibile aumentare la durata della conservazione non frazionata sangue del cordone fino a 72 ore e salva l'attività funzionale delle unità formanti colonie. Tuttavia, nello studio della conservazione CFU-GM e CFU-G mostrato che il tempo di conservazione del sangue del cordone ombelicale prima crioconservazione non dovrebbe superare nove ore. Ovviamente, in questo caso dovrebbe agire il principio che se vi sono dati contrastanti dovrebbero utilizzare la durata minima raccomandata per l'immagazzinaggio sangue del cordone e avviare una programmabili cellule congelamento isolato il più rapidamente possibile.

Quando si congelano le cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone ombelicale, una soluzione al 10% di DMSO viene solitamente utilizzata come crioprotettore. Tuttavia, oltre all'effetto crioprotettivo espresso, il dimetilsolfossido in questa concentrazione ha un effetto citotossico diretto, anche in condizioni di esposizione minima alle cellule che formano sangue del sangue del cordone ombelicale. Per ridurre l'effetto citotossico del DMSO, si applicano una temperatura di esposizione zero, un aumento della velocità di tutte le manipolazioni e il lavaggio ripetuto dopo lo scongelamento dei campioni del cordone ombelicale.

L'Istituto di Ematologia e Transfusiologia dell'Accademia delle scienze mediche dell'Ucraina ha sviluppato una direzione scientifica dal 1995, il cui obiettivo è studiare il sangue del cordone come fonte alternativa di cellule emopoietiche dello stelo. In particolare, sono state sviluppate nuove tecnologie per la crioconservazione a bassa temperatura di cellule emopoietiche di sangue cordonale non frazionato e frazionato. Come crioprotettore si usa il polivinilpiridone a basso peso molecolare. Il metodo di crioconservazione del sangue cordonale non frazionato si basa sulla tecnologia originale di pre-preparazione delle cellule per il congelamento e sulla tecnica di trattamento speciale della sospensione cellulare immediatamente prima del trapianto.

Uno dei fattori più importanti che influenzano il livello di attività funzionale delle cellule staminali emopoietiche crioconservate è il tasso di raffreddamento della sospensione cellulare, specialmente durante la fase di cristallizzazione. Un approccio software per risolvere il problema della velocità e del tempo di congelamento offre grandi opportunità per la creazione di metodi di crioconservazione semplici ed estremamente efficaci, senza lavare la sospensione cellulare dai crioprotettori prima del trapianto.

Le fasi di congelamento e scongelamento immediato sono più pericolose per la vitalità delle cellule durante la loro preparazione. Quando si congelano le cellule emopoietiche, una parte significativa di esse può essere distrutta al momento della transizione del mezzo intercellulare dalla fase liquida a quella solida - cristallizzazione. Per ridurre la percentuale di morte cellulare, vengono utilizzati crioprotettori, i meccanismi di azione e l'efficacia crioprotettiva di cui sono stati adeguatamente trattati nella letteratura scientifica.

A promettenti Tecniche direzione ottimizzazione di crioconservazione di midollo osseo e cellule del sangue del cordone ombelicale è quella di combinare nella stessa soluzione a basse concentrazioni di crioprotettori con diversi meccanismi d'azione, ad esempio, agendo sul livello intracellulare di DMSO e amido idrossietile o albumina possedere effetto racchiude extracellulare.

Per la crioconservazione di cellule ematiche del cordone sono tradizionalmente utilizzati soluzione in DMSO al 20%, che si agitava permanentemente meccanicamente in un bagno di ghiaccio, si è versata lentamente la sospensione cellulare per ottenere pari (1: 1) il rapporto in volume di sospensione cellulare e il crioprotettore. La concentrazione finale di dimetil solfossido è del 10%. La sospensione cellulare viene quindi raffreddata su un software criostato con una velocità di HS / min a -40 ° C, dopo di che la velocità di raffreddamento viene aumentata a 10 ° C / min. Dopo aver raggiunto -100 ° C, il contenitore con la sospensione cellulare viene posto in azoto liquido (-196 ° C). Con questo metodo di crioconservazione, la sicurezza delle cellule mononucleate funzionalmente attive dopo lo scongelamento raggiunge l'85% del livello iniziale.

Le modifiche dei metodi di crioconservazione mirano a ridurre la concentrazione di DMSO aggiungendo amido idrossietilico (le concentrazioni finali di dimetilsolfossido e idrossietilamido sono rispettivamente del 5% e 6%). L'elevata efficacia di questa combinazione di crioprotettori viene osservata quando la sospensione delle cellule mieloidi è congelata, con meno citoprotezione rispetto a una singola soluzione al 10% di dimetilsolfossido. Il numero di cellule nucleate vitali ha raggiunto il 96,7% del livello di base e la loro attività funzionale, stimata dal numero di CFU-GM, è stata dell'81,8%.

Quando si utilizza la soluzione dimetilsolfossido a concentrazioni comprese fra 5 e 10% in combinazione con 4% di amido idrossietilico (concentrazione finale) trovarono che la conservazione di cellule CD34-positive in questi intervalli dimetilsolfossido praticamente invariata. Allo stesso tempo, in condizioni di diminuzione della concentrazione di dimetilsolfossido dal 5 al 2,5%, si osserva la perdita di massa delle cellule del sangue del cordone ombelicale - il numero di cellule vitali diminuisce dall'85,4 al 12,2%. Altri autori hanno inoltre concluso che era 5 e il 10% di soluzione di dimetilsolfossido (nella forma di realizzazione di copyright - in combinazione con siero autologo) con la massima efficienza fornire citoprotezione durante crioconservazione di HTS sangue del cordone. Inoltre, l'alta sicurezza sequenzialmente congelati e scongelati cella è contrassegnata nel caso della combinazione di 5 o 10% DMSO 4% soluzione di amido idrossietilico, in particolare ad una velocità di raffreddamento controllato TOS / min. In un'altra carta utilizzata soluzione crioprotettiva composto da tre ingredienti già - DMSO, purificato albumina umana e terreno RPMI in un rapporto di 1: 4: 5, che è stata aggiunta alla sospensione cellulare fino a un pari rapporti volumetrici (concentrazione di DMSO finale era 5%). Dopo aver scongelato a bagnomaria ad una temperatura di + 4 ° C, la sicurezza del CFU-GM ha superato il 94%.

Alcuni autori suggeriscono l'uso di sangue cordonale non frazionato per la crioconservazione, dal momento che quantità significative di cellule ematopoietiche vengono perse durante la rimozione dei globuli rossi. In questa forma di realizzazione, una soluzione al 10% di dimetilsolfossido viene utilizzata per proteggere le cellule mononucleate dagli effetti dannosi della criocristallizzazione. Il congelamento viene effettuato a una velocità di raffreddamento costante di HS / min fino a -80 ° C, dopo di che la sospensione delle cellule del sangue del cordone ombelicale viene immerso in azoto liquido. Con questo metodo di congelamento, si verifica una parziale lisi degli eritrociti, pertanto i campioni di sangue non richiedono il frazionamento. Dopo lo scongelamento, la sospensione cellulare viene lavata dall'emoglobina libera e dal dimetilsolfossido in una soluzione di albumina umana o nel siero autologo del paziente e utilizzata per il trapianto.

Conservazione di cellule progenitrici ematopoietiche dopo scongelamento sangue del cordone non frazionata è effettivamente superiore alla frazionata, ma in connessione con krioustoychivostyu dei globuli rossi può causare seri problemi a causa di post-trasfusione trasfusione di globuli rossi ABO-incompatibili. Inoltre, il volume di sangue non frazionato conservato aumenta in modo significativo. Da un punto di vista clinico, è ancora preferibile crioconservare pre-isolato e purificato da altre frazioni cellulari di cellule ematiche del cordone ematopoietico.

In particolare, un metodo di crioconservazione di cellule del sangue del cordone frazionati permettendo rimuovere eritrociti in preparazione per il congelamento, che utilizza una soluzione al 6% di amido idrossietilico nella soluzione composizione plazmozameshchath "Stabizol". Dopo lo scongelamento, la sospensione cellulare così ottenuta è pronta per l'uso clinico senza ulteriori manipolazioni.

Così, al momento, ci sono molti modi abbastanza efficaci di crioconservazione del sangue del cordone ombelicale. La principale differenza è che i campioni di sangue vengono congelati non frazionati o sottoposti a separazione in frazioni cellulari durante la fase di preparazione e cellule nucleate raccolte senza una mescolanza di eritrociti.

Trapianto di cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale

Alla fine degli anni '80 - agli inizi degli anni '90 del secolo scorso si è scoperto che il sangue del cordone ombelicale che alimenta il feto durante la gravidanza è caratterizzato da un alto contenuto di cellule staminali ematopoietiche. La relativa semplicità nell'ottenere cellule del sangue del cordone ombelicale e l'assenza di evidenti problemi etici hanno promosso l'uso delle cellule staminali del sangue del cordone nella medicina pratica. Il primo trapianto riuscito di sangue cordonale a un bambino affetto da anemia di Fanconi è servito come punto di partenza per espandere i volumi di trapianto di cellule staminali del sangue del cordone ombelicale e creare un sistema per le sue prestazioni bancarie. Nel sistema globale delle banche del sangue del cordone ombelicale, il più grande è il Centro di New York per il sangue placentare, che è sul bilancio del National Institutes of Health. Il numero di campioni di sangue cordonale memorizzati in questa banca si avvicina a 20 LLC. Anche il numero di riceventi (soprattutto bambini) è in crescita e il trapianto è stato effettuato con successo. Secondo il Dipartimento della Sanità degli Stati Uniti, il periodo di recidiva della vita post-trapianto dei riceventi di sangue cordonale HSC ha già superato i 10 anni.

Questo non è sorprendente, in quanto numerosi studi del potenziale ematopoietiche del sangue del cordone ombelicale hanno dimostrato che la quantità e la qualità delle cellule staminali primi non solo non è inferiore a un midollo osseo umano adulto, ma anche da alcune misure superarla. Un più alto potenziale proliferativo delle cellule staminali del sangue del cordone causato funzioni di segnalazione cellulare di sviluppo, la presenza di recettori sulle CSE a fattori di crescita specifici, la capacità dei globuli cordoncino autocrina produzione di fattori di crescita, le grandi dimensioni e la lunghezza dei telomeri.

Pertanto, le caratteristiche genomiche e fenotipiche delle cellule del sangue del cordone ombelicale che formano il sangue, predetermina l'attecchimento qualitativo di un trapianto con un alto potenziale per il ripristino della formazione di emopoiesi del donatore nell'organismo ricevente.

Vantaggi delle cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone ombelicale

Tra i reali vantaggi di utilizzare cellule staminali del sangue del cordone ematopoietiche per il trapianto rispetto ad altre fonti di cellule ematopoietiche si precisa quasi zero rischio per la salute del donatore (se non considerata tale placenta), eliminando la necessità di anestesia generale. L'uso del sangue del cordone ombelicale estende le possibilità di trapianto di cellule a causa del trapianto parzialmente compatibile nel sistema HLA (incompatibilità da uno a tre antigeni). La tecnica di conservazione a lungo termine dei globuli cordone ematopoietiche in uno stato congelato, che aumenta la probabilità di ottenere raro HLA-tipo e riduce il tempo di ricerca HLA-matched trapianto allogenico. Allo stesso tempo, il rischio di sviluppare alcune infezioni latenti trasmesse dalla via di trasmissione è significativamente ridotto. Inoltre, esiste una forma economica di assicurazione sulla vita biologica in relazione alla possibilità di utilizzare cellule del sangue del cordone per il trapianto autologo.

Tuttavia, poiché piccole quantità di sangue che possono essere raccolti dalla placenta (una media di non più di 100 ml) alla ribalta il problema di ottenere la massima quantità possibile di sangue dalla vena del cordone ombelicale nel rigoroso rispetto delle condizioni di minimo rischio di contaminazione batterica di campioni derivati sangue del cordone ombelicale.

Cellule ematopoietiche primitive dal sangue del cordone ombelicale vengono generalmente identificati mediante la presenza sulla loro superficie CD34 glikofosfoproteina, e sulla base delle loro proprietà funzionali esaminando il clonogenica dosaggio o colonia formazione in vitro. Analisi comparativa ha dimostrato che nel cordone ombelicale e del midollo osseo contenuto massimo di cellule mononucleate CD34-positive nella frazione sono rispettivamente 1,6 e 5,0%, il livello massimo di unità formanti colonia in una sottopopolazione di cellule CD34 + - 80 e 25%, efficienza di clonazione totale di CD34 + -cellule - 88 e 58%, la colonia massima formante cellule con elevato potenziale proliferativo (HPP-CFC in -populyatsii CD34 +) - 50 e 6,5%. Va aggiunto che l'efficienza di clonazione delle cellule CD34 + CD38-cellule e la capacità di rispondere alla stimolazione citochina anche maggiore nelle cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone.

Combinazione antigeni fenotipici Thy-1, CD34 e CD45RA conferma l'elevata capacità proliferativa delle cellule ematopoietiche sangue del cordone, e l'espressione dei tre antigeni sulla superficie delle cellule ematiche del cordone indica che appartengono al cellule staminali. Inoltre, è stato stabilito che il sangue del cordone ombelicale contiene cellule con un fenotipo CD34 + che non hanno marcatori di differenziazione lineare. Il livello nel sangue del cordone ombelicale delle sottopopolazioni cellulari con il profilo fenotipico di CD34 + / Lin è circa l'1% del numero totale di cellule CD34-positive. Le cellule precursori del sangue del cordone ematopoietico danno origine sia alla linea cellulare linfoide che alla serie mieloide polipotente di differenziazione lineare delle cellule, che indica anche la loro appartenenza alle cellule staminali.

Come già accennato, le differenze essenziali tra midollo osseo e sangue del cordone ombelicale sono la quantità di cellule ematopoietiche utilizzate per il trapianto, ottenute con una procedura. Quando midollo osseo perdita trapianto di massa delle cellule nel processo di separazione, crioconservazione, lo scongelamento e test sono ammesse nel range di 40-50%, il sangue del cordone tale perdita è molto significativo, poiché quando si utilizza il numero insufficiente di HTS trapianto può essere insostenibile. Secondo G. Kogler et al (1998), per il trapianto di cellule del peso corporeo del ricevente di 10 kg potenziale trapianto (numero totale di campioni di sangue del cordone raccolti - 2098) possono essere tutti i campioni di sangue del cordone, peso corporeo 35 kg - 67%, e solo Il 25% dei campioni sarà in grado di fornire un trapianto efficace in pazienti con un peso corporeo di 50-70 kg. Questa situazione clinica indica la necessità di ottimizzare e migliorare l'efficacia dei metodi esistenti di campionamento, riproduzione e conservazione delle cellule del sangue del cordone ombelicale. Pertanto, le questioni di standardizzazione dei metodi di campionamento, prove, separazione e crioconservazione di sangue del cordone è ora ampiamente discussi in letteratura per la creazione di banche del sangue, il suo uso in clinica, oltre a stabilire le condizioni e modalità di conservazione delle cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone.

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L'uso di cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone ombelicale in medicina

Di solito, fino a 10 ⁶ cellule staminali ematopoietiche possono essere isolate dal sangue del cordone ombelicale , raramente di più. In relazione a questo, fino ad oggi, rimane la domanda della sufficienza di così tante cellule del sangue del cordone ematopoietico per ripristinare l'emopoiesi del ricevente adulto. Le opinioni su questo tema sono state divise. Alcuni ricercatori ritengono che questa quantità sia sufficiente per il trapianto ai bambini, ma troppo poco per un trapianto a un adulto, per il quale la somministrazione ottimale (7-10) x 10 ⁶ cellule CD34-positive per 1 kg di peso corporeo è in media 7 x 10 ⁸ per trapianto. Da questi calcoli risulta che un campione di cordone ombelicale contiene 700 volte meno cellule staminali ematopoietiche di quanto sia necessario per un trapianto a un paziente adulto. Tuttavia, tale valutazione quantitativa viene effettuata per analogia con il numero di cellule trasfuse nel midollo osseo e ignora completamente le caratteristiche ontogenetiche dell'ematopoiesi.

In particolare, si tiene conto del fatto la capacità proliferativa maggiore di cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone rispetto alle cellule progenitrici ematopoietiche del midollo osseo. I risultati degli studi sul potenziale di formazione di colonie in vitro suggeriscono che una dose di sangue cordonale può fornire una ricostituzione dell'ematopoiesi del ricevente adulto. D'altra parte, non bisogna dimenticare che il numero di CSE diminuisce anche nel processo di sviluppo embrionale: il contenuto di cellule CD34-positive nel sangue del cordone ombelicale è linearmente ridotta 5 volte in un periodo di 20 settimane (sangue per lo studio è stato ottenuto in caso di cessazione anticipata di gravidanza) per 40 settimane di gestazione (il periodo delle nascite fisiologiche), che è accompagnato da un parallelo, aumento permanente nell'espressione dei marcatori di citodifferenziazione lineare.

A causa della mancanza di un approccio standardizzato alla quantificazione delle cellule progenitrici nei campioni di sangue del cordone ombelicale, continua la controversia sulla dose ottimale di cellule staminali emopoietiche del cordone ombelicale. Alcuni ricercatori ritengono che il numero di cellule nucleate e di cellule mononucleate, ricalcolate per il peso corporeo del ricevente, cioè la loro dose, possa essere utilizzato come criterio per la selezione di campioni di cordone ombelicale. Alcuni autori ritengono che la soglia quantitativa minima delle cellule CD34 +, anche per il trapianto autologo di CSE, sia 2 x 10 ⁶ / kg. L'aumento della dose di cellule ematopoietiche a 5 × 10 ⁶ cellule / kg (totale 2,5) fornisce già una più adatto per l'inizio del periodo post-trapianto, riduce l'incidenza di complicanze infettive e accorcia il periodo della terapia antibiotica preventiva.

Secondo E. Gluckman et al (1998) in ematologia per successo del trapianto di cellule ematiche del cordone ombelicale è l'introduzione di almeno 3,7 x 10 ⁷ cellule nucleate per 1 kg di peso corporeo del ricevente. Con una diminuzione della dose di cellule staminali ematopoietiche a 1 x 10 ⁷ e meno cellule nucleate per 1 kg di peso corporeo, il rischio di fallimento dell'innesto e di recidiva del cancro è nettamente aumentato. Dovrebbe essere riconosciuto che il numero minimo di cellule progenitrici necessarie per un rapido recupero della formazione di sangue dopo l'allotrapianto di GSG non è ancora noto. Teoricamente questo può essere realizzato utilizzando una singola cella, ma in clinica trapianto di midollo osseo rapido e stabile attecchimento garantito trasfusione almeno (1-3) × 10 ⁸ cellule nucleate per 1 kg di peso corporeo del paziente.

Un recente studio dettagliato per determinare la quantità ottimale di HSC in oncoematologia includeva l'osservazione di pazienti di tre gruppi isolati a seconda del contenuto di cellule CD34-positive nel materiale di trapianto. I pazienti del primo gruppo hanno ricevuto (3-5) x 10 ⁶ cellule / kg. La dose di HSC nei pazienti del secondo gruppo era (5-10) x 10 ⁶ cellule / kg, e i pazienti del terzo gruppo hanno ricevuto il trapianto di più di 10 x 10 ⁶ CD34 + cellule / kg. I migliori risultati sono stati osservati nel gruppo di riceventi che hanno ricevuto un trapianto con il numero di cellule CD34-positive pari a (3-5) x 10 ⁶ / kg. Con un aumento della dose di cellule trapiantate superiore a 5 × 10 ⁶ / kg, non sono stati identificati benefici statisticamente significativi. Allo stesso tempo, un contenuto di HSC molto grande nel trapianto (> 10 x 10 ⁶ / kg) è associato alla reinfusione di un numero significativo di cellule tumorali residue, che porta a una ricaduta della malattia. Non vi era alcuna relazione diretta tra il numero di cellule progenitrici allogeniche trapiantate e lo sviluppo della reazione "trapianto contro ospite".

L'esperienza mondiale accumulata di trapianto di sangue cordonale HSC conferma il loro elevato potenziale di ripopolazione. Il tasso di attecchimento del trapianto di sangue del cordone ombelicale è correlato al numero di cellule nucleate introdotte. I migliori risultati si osservano con un trapianto di 3 × 10 ⁷ / kg, mentre per il midollo osseo questa dose è 2 × 10 ⁸ / kg. Secondo i dati dei centri di coordinamento, alla fine del 2000 nel mondo sono stati effettuati 1200 trapianti di cellule del sangue del cordone ombelicale, principalmente da parenti dei donatori (83%). Ovviamente, il sangue del cordone ombelicale deve essere considerato un'alternativa al midollo osseo per il trapianto a pazienti con emooblastosi.

Tuttavia, neonatale natura Cordova fonte di tessuti emopoietici incoraggiare dovuta alla presenza di caratteristiche funzionali del suo GCW. Tuttavia, l'esperienza clinica può dare una risposta alla questione della adeguatezza di un campione di sangue del cordone ombelicale per la ricostituzione ematopoietiche adulta del destinatario con aplasia della emopoiesi. Il trapianto di cellule del sangue del cordone è utilizzata nel trattamento di molte malattie tumorali e non tumorali natura: leucemie e sindromi mielodisplastiche, linfoma non-Hodgkin di, e neuroblastoma, l'anemia aplastica, anemia congenita di Fanconi e ventilatore Diamond Black, deficit di adesione leucocitaria, la sindrome di Barr, sindrome di Gunther malattia Harlera, la talassemia .

Un'attenzione particolare e una ricerca separata meritano gli aspetti immunologici del trapianto di cellule che formano sangue del sangue del cordone ombelicale. E 'dimostrato che nel caso di trapianto di cellule staminali del sangue del cordone da donatori con risultati trapianto HLA-matched incompleti sono abbastanza soddisfacente, che, secondo gli autori, indicando un sangue del cordone immunoreattività inferiore midollo osseo.

Uno studio dettagliato della composizione cellulare del sangue del cordone ombelicale mostrava caratteristiche di entrambi spettro fenotipico delle cellule effettrici del sistema immunitario e la loro attività funzionale, permettendo di considerare sangue del cordone ombelicale come fonte di CSE con ridotti rischi di reazione "graft versus host". Tra i segni di immaturità funzionale delle cellule del sangue del cordone ombelicale immunocompetente, si dovrebbe notare uno squilibrio nella produzione di citochine e una diminuzione della sensibilità alla regolazione delle citochine della risposta immunitaria. L'inibizione risultante dell'attività dei linfociti citotossici è considerata un fattore che contribuisce alla formazione della tolleranza immunologica al tessuto emopoietico trapiantato. Nella popolazione di linfociti del sangue del cordone ombelicale, a differenza del sangue periferico e del midollo osseo di donatori adulti, predominano i linfociti e le cellule soppressive inattive e immature. Ciò indica una ridotta disponibilità di linfociti T del cordone ombelicale alla risposta immunitaria. Una caratteristica importante della popolazione monocitaria di cellule del sangue del cordone ombelicale è il basso contenuto di cellule presentanti l'antigene funzionalmente complete e attive.

Da un lato, un basso grado di maturazione di cellule effettrici del sistema immunitario in letture di sangue del cordone estende al suo uso in clinica, poiché queste caratteristiche permettono la riduzione dell'intensità di conflitto tra le cellule immuni donatore e ricevente. Ma, d'altra parte, sappiamo che l'esistenza di una correlazione tra il grado di reazione "graft versus host disease" e l'effetto antitumorale del trapianto, cioè, l'effetto dello sviluppo di "graft-versus-la leucemia". In relazione a ciò, è stato condotto uno studio sulla citotossicità antitumorale delle cellule del sangue del cordone ombelicale. I risultati indicano che, nonostante la risposta immunitaria realmente indebolito di globuli cordone alla stimolazione antigenica, attivati in primo luogo sono le cellule killer naturali e cellule killeropodobnymi attivamente coinvolte nei meccanismi di attuazione della citotossicità antitumorale. Inoltre, in sottopopolazioni di linfociti del sangue del cordone sono stati trovati con il fenotipo CD16 + CD56 + e CD16 "TCRA / p +. Si presume che queste cellule sono in una forma attivata attuare reazione" graft-versus-leucemia".

Presso l'Istituto di Oncologia, Accademia delle scienze mediche dell'Ucraina cellule ematopoietiche crioconservate dal sangue del cordone ombelicale sono state somministrate a pazienti affetti da tumore con ipoplasia persistente emopoiesi a causa della chemioterapia e la radioterapia. In questi pazienti, il trapianto di cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone efficacemente ripristinato oppressione sangue, come evidenziato dalla persistente elevazione di elementi formati maturi nel sangue periferico, nonché un aumento degli indicatori caratterizzare lo stato di immunità cellulare e umorale. La stabilità dell'effetto di ripopolamento dopo il trapianto di cellule ematopoietiche del sangue del cordone ombelicale consente di continuare la radioterapia e la chemioterapia senza interrompere il corso del trattamento. Ci sono prove di una maggiore efficienza trapianto allogenico di pazienti affetti da cancro del sangue del cordone di cellule staminali: il rischio annuale di recidiva di un tumore nel loro uso è stata del 25% contro il 40% nei pazienti con un gene di midollo osseo allogenico trapiantato.

Il meccanismo di azione delle cellule staminali del cordone crioconservati dovrebbe essere considerato come il risultato di una stimolazione umorale di destinatari ematopoiesi causati dalla capacità unica di cellule neonatali a autocrina produzione di fattori di crescita ematopoietici, come conseguenza della attecchimento temporanea delle cellule del donatore (come conferma - un significativo aumento del contenuto di sangue periferico emoglobina fetale destinatario 7-15 giorno dopo la trasfusione rispetto ai dati di base). Assenza di destinatari di reazioni post-trasfusionale del sangue del cordone - risultato della sua relativa tolleranza delle cellule del sistema immunitario, così come il criterio di fiducia l'utilità del materiale biologico crioconservato.

Cellule progenitrici T linfociti killer sangue del cordone capace di attivazione sotto l'influenza della stimolazione di citochine esogene che è utilizzata per sviluppare nuove ex vivo e in vivo metodi per indurre cellule linfoidi citotossici antitumorali per il successivo trapianto immunoterapia. Inoltre, l '"immaturità" del genoma delle cellule del sangue del cordone immunocompetente consente loro di essere utilizzate per migliorare l'attività antitumorale mediante metodi di modellizzazione molecolare.

Oggi, il sangue del cordone ombelicale ha trovato ampia applicazione principalmente in ematologia pediatrica. Nei bambini con leucemia acuta allotrapianto di cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone rispetto al allotrapianti di midollo osseo, riduce significativamente l'incidenza di reazione "graft versus host". Tuttavia, vi è un periodo più lungo di neutropenia e trombocitopenia e, sfortunatamente, un più alto livello di mortalità post-trapianto di 100 giorni. Un periodo di ripresa dei granulociti del sangue periferico e piastrine più potrebbe essere dovuto alla differenziazione insufficiente di singole sottopopolazioni di cellule CD34 positive di sangue del cordone ombelicale, come dimostra il basso livello di assorbimento di rodamina radioattivi e bassa espressione di antigeni CD38 sulla loro superficie.

Allo stesso tempo, il trapianto di cellule staminali ematopoietiche del sangue ombelicale di pazienti adulti, eseguiti a causa della mancanza sia un correlato donatore di midollo osseo compatibile, nonché opportunità per mobilitare autologo HSC mostrato alta sopravvivenza annuale libera da recidive in pazienti di età inferiore ai 30 anni (73%) . L'espansione della fascia di età dei destinatari (18-46 anni) ha determinato una riduzione del tasso di sopravvivenza al 53%.

Analisi quantitativa di cellule con CD34 + midollo osseo e sangue del cordone fenotipo mostrava superiore (3,5 volte) i loro contenuti nel midollo osseo, ma sangue del cordone ombelicale ha mostrato una prevalenza significativa di cellule con profilo fenotipica delle cellule CD34 + HLA-DR .Izvestno, marcatori chtokletkikrovisimmunologicheskimi CD34 + HLA-DR proliferano più attivo di cellule con immunofenotipo CD34 + HLA-DR +, come confermato in studi sperimentali della crescita della coltura a lungo termine di cellule ematopoietiche in vitro. Progenitori primitivi con fenotipo CD34 + CD38 contenuta nel cordone ombelicale e del midollo osseo, ma le cellule del sangue del cordone ombelicale con il picchetto posto CD34 + CD38 presentare una maggiore attività clonogenica di cellule ematopoietiche dello stesso fenotipo, isolate da midollo osseo del donatore adulto. Inoltre, le cellule del sangue del cordone ombelicale con CD34 + CD38 dell'immunofenotipo proliferano in risposta alla stimolazione con citochine (IL-3, IL-6, G-CSF) e riprodurre 7 volte più colonie nelle colture a lungo termine rispetto alle cellule del midollo osseo.

Banche di cellule staminali del cordone ombelicale

Per un corretto sviluppo del nuovo campo della medicina pratica - trapianto di cellule staminali del cordone ombelicale, nonché di effettuare trapianti di cellule staminali del midollo osseo ematopoietiche, è necessario disporre di una vasta rete di banche del sangue, che sono già stabiliti negli Stati Uniti e in Europa. Le reti intrastatali di banche del sangue cordonale sono unite dall'associazione di Netcord Banks. La convenienza di creare un'associazione internazionale di banche del sangue del cordone ombelicale è determinata dal fatto che per eseguire trapianti non correlati è necessario un gran numero di campioni di cordone ombelicale tipizzato, che consente di selezionare un donatore HLA-identico. Solo l'istituzione di un sistema di banche con la conservazione di campioni di sangue di diversi tipi di HLA può davvero risolvere il problema di trovare il donatore necessario. L'organizzazione di un tale sistema di banche del sangue del cordone ombelicale richiede lo sviluppo preliminare di norme etiche e legali, attualmente in discussione a livello internazionale.

Per creare banche del sangue del cordone ombelicale in Ucraina, è necessario elaborare una serie di disposizioni e documenti.

Prima di tutto, si tratta di standardizzare i metodi di campionamento, frazionamento e congelamento del sangue del cordone ombelicale. È necessario regolare le regole di raccolta sangue del cordone ombelicale negli ospedali, in conformità con i requisiti di etica medica, per determinare la quantità minima di sangue del cordone ombelicale, che fornisce un trapianto di successo. Esso deve essere comparato e standardizzazione dei criteri di valutazione della qualità e il numero di cellule progenitrici ematopoietiche, nonché i metodi HLA-battitura e metodi di diagnosi delle malattie genetiche e infettive che possono essere trasmessi dalla infusione di sangue del cordone ombelicale impostato criteri generali di selezione donatori sani. Vale anche la pena discutere della creazione di strutture di stoccaggio separate per siero, cellule e DNA derivato dal sangue cordonale.

È assolutamente necessario organizzare una rete informatica di dati sul sangue cordonale per l'attuazione della relazione con i registri dei donatori di midollo osseo. Per sviluppare ulteriormente il trapianto cellulare, dovrebbero essere sviluppati protocolli speciali per confrontare i risultati del trapianto di sangue cordonale e del midollo osseo dai parenti HLA-identici e dai donatori non collegati. Nella soluzione dei problemi etici e legali dell'applicazione clinica delle cellule del sangue del cordone ombelicale, può essere d'aiuto la standardizzazione della documentazione, compreso il consenso informato dei genitori e la notifica della madre o dei parenti sulle malattie genetiche e / o infettive del bambino.

La condizione determinante per lo sviluppo del trapianto di cellule in Ucraina sarà l'adozione del programma nazionale per la donazione di cellule staminali e lo sviluppo della cooperazione internazionale con altri paesi attraverso l'Associazione Mondiale di midollo osseo del donatore (WMDA), il programma di midollo osseo del donatore nazionale degli Stati Uniti (NMDP) ed altri registri.

Generalizzando la storia ancora a corto di trapianto di cellule staminali del sangue del cordone ombelicale, si nota che la prima ipotesi della possibilità di applicazione clinica di sangue del cordone ombelicale, realizzato nei primi anni '70, sono stati confermati nei 80 anni i risultati di studi sperimentali su animali, e nel 1988 il primo trapianto nel mondo di cellule che formano sangue del cordone ombelicale a un uomo era già stato condotto, dopo di che fu creata la rete mondiale di banche del sangue del cordone ombelicale. Dopo 10 anni, il numero di pazienti con cellule ematopoietiche trapiantate, ombelicale avvicina sangue del cordone a 800. Tra loro erano pazienti con varie malattie tumorali (leucemia, linfoma, tumori solidi) e non tumorali (immunodeficienza congenita, anemia, malattie associate a disturbi metabolici) natura.

Nel sangue del cordone ombelicale, il contenuto di progenitori cellulari precoci e impegnati è superiore a quello del sangue periferico di un adulto. Per il numero di unità formanti colonie di granulociti-macrofagi e il loro potenziale proliferativo, il sangue del cordone ombelicale supera significativamente il sangue periferico degli adulti anche dopo la somministrazione di fattori di crescita. Nelle colture cellulari a lungo termine in vitro, vi era una maggiore attività proliferativa e vitalità delle cellule del sangue del cordone ombelicale rispetto alle cellule del midollo osseo. I momenti critici nella trapianto di cellule staminali del cordone ombelicale sono numeri e nucleate cellule ematopoietiche potenziali, la presenza di infezione da citomegalovirus, donatore HLA-compatibile e il destinatario, peso corporeo e dell'età del paziente.

Tuttavia, il trapianto di cellule staminali del sangue del cordone ombelicale deve essere considerato un'alternativa al trapianto di midollo osseo per il trattamento di gravi malattie del sangue, specialmente nei bambini. Problemi clinici di trapianto di cellule del sangue del cordone ombelicale gradualmente risolti - esistono tecniche di campionamento già abbastanza efficienti, separazione e crioconservazione di cellule del sangue del cordone, purché le condizioni per la formazione di banche del sangue del cordone, i metodi di prova sono migliorate cellule nucleate. La separazione ottimale con un prelievo su larga scala di cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone ombelicale durante la creazione di banche deve essere considerata una soluzione di gelatina al 3% e una soluzione di amido idrossietilico al 6%.

Perehrestenko P. Et al (2001) giustamente sottolineano che il trapianto di cellule staminali del sangue del cordone deve prendere il suo posto nelle misure terapeutici complessi per superare la depressione di ematopoiesi di varia origine, come GSK sangue del cordone differiscono in un certo numero di vantaggi significativi, tra i quali importante è la relativa facilità di raccolta, nessun rischio per il donatore, bassa contaminazione delle cellule neonatali da parte dei virus e un costo relativamente basso di trapianto. Alcuni autori suggeriscono che il trapianto di cellule del sangue del cordone ombelicale meno frequentemente di cellule di midollo osseo è accompagnata da complicazioni associate con la reazione di "trapianto contro l'ospite", che è dovuto, secondo loro, una debole espressione nelle cellule del sangue del cordone di antigeni HLA-DR e la loro immaturità. Tuttavia, la principale popolazione di cellule nucleate di sangue del cordone ombelicale sono linfociti T (cellule SDZ-positive), il cui contenuto è di circa il 50%, che è il 20% in meno rispetto al sangue periferico di un adulto, ma le differenze fenotipiche delle sottopopolazioni di cellule T da questi le fonti sono insignificanti.

Tra i fattori che influenzano direttamente la sopravvivenza del trapianto di cellule staminali del sangue del cordone ombelicale, dobbiamo notare l'età dei pazienti (i migliori risultati si vedono in recipienti di età fino a 5 anni), la diagnosi precoce della malattia e una forma di leucemia (efficienza è significativamente più alto nella leucemia acuta). Di grande importanza sono la dose di cellule del sangue del cordone ombelicale nucleate, nonché la loro compatibilità HLA con il ricevente. Non è l'analisi degli incidenti della efficacia clinica del trapianto di sangue del cordone ombelicale GSK in Oncologia ed Ematologia propone i migliori risultati del trattamento con trapianto correlati: un anno di sopravvivenza libera da malattia, in questo caso raggiunge il 63%, mentre il trapianto di estranei - solo il 29%.

Pertanto, la presenza di un gran numero di cellule staminali nel sangue del cordone e neonatali cellule staminali ematopoietiche alta capacità repopulyatsionnaya li rendono adatti per il trapianto allogenico in pazienti con neoplasie ematologiche. Si noti tuttavia che la ricapitolazione di ematopoiesi dopo trapianto di cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone "è allungato nel tempo": ripristino del contenuto in neutrofili del sangue periferico di solito avviene verso la fine della 6a settimana, e fenomeno trombocitopenia scompaiono, di solito dopo 6 mesi. Inoltre, le cellule ematopoietiche immature di sangue del cordone ombelicale non esclude conflitto immunologica: grave corso della reazione "graft versus host" acuta e cronica osservata rispettivamente in 23 e 25% dei destinatari. Le recidive di leucemia acuta entro la fine del primo anno dopo il trapianto di cellule del sangue del cordone ombelicale sono rilevate nel 26% dei casi.

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