Limiti, pericoli e complicazioni del trapianto di cellule

La medicina plastica rigenerativa si basa sull'applicazione clinica delle proprietà toti- e pluripotenti delle cellule staminali embrionali e progenitrici, che consentono di creare in vitro e in vivo linee cellulari specifiche che ripopolano i tessuti e gli organi danneggiati di una persona malata.

La reale possibilità di utilizzare le cellule staminali embrionali e le cellule staminali dei tessuti definitivi (le cosiddette cellule staminali "adulte") dell'uomo a fini terapeutici non è più in dubbio. Tuttavia, esperti delle Accademie Nazionali e Mediche degli Stati Uniti (Stem cells and the future regenerative medicine, National Academy Press) e del National Institute of Health degli Stati Uniti (Stem cells and the future research directions, Nat. Inst, of Health USA) raccomandano uno studio più approfondito delle proprietà delle cellule staminali in esperimenti su modelli biologici adeguati e una valutazione oggettiva di tutte le conseguenze del trapianto, e solo allora l'utilizzo delle cellule staminali in clinica.

È stato dimostrato che le cellule staminali fanno parte dei derivati tissutali di tutti e tre i foglietti germinali. Le cellule staminali si trovano nella retina, nella cornea, nell'epidermide, nel midollo osseo e nel sangue periferico, nei vasi sanguigni, nella polpa dentaria, nei reni, nell'epitelio gastrointestinale, nel pancreas e nel fegato. Utilizzando metodi moderni, è stato dimostrato che le cellule staminali neurali sono localizzate nel cervello e nel midollo spinale di un adulto. Questi dati sensazionali hanno attirato particolare attenzione da parte di scienziati e media, poiché i neuroni nel cervello rappresentavano un classico esempio di una popolazione cellulare statica che non viene ripristinata. Sia nelle fasi iniziali che in quelle avanzate dell'ontogenesi, neuroni, astrociti e oligodendrociti si formano nel cervello di animali ed esseri umani grazie alle cellule staminali neurali (Cellule staminali: progressi scientifici e direzioni future della ricerca. Nat. Institute of Health USA).

Tuttavia, in condizioni normali, la plasticità delle cellule staminali dei tessuti definitivi non si manifesta. Per realizzare il potenziale plastico delle cellule staminali dei tessuti definitivi, queste devono essere isolate e poi coltivate in terreni di coltura con citochine (LIF, EGF, FGF). Inoltre, i derivati delle cellule staminali attecchiscono con successo solo se trapiantati nel corpo di un animale con un sistema immunitario depresso (irradiazione γ, citostatici, busulfano, ecc.). Ad oggi, non sono state ottenute prove convincenti dell'implementazione della plasticità delle cellule staminali in animali che non siano stati esposti a radiazioni o ad altri effetti che causano immunosoppressione profonda.

In tali condizioni, il potenziale pericoloso delle cellule staminali embrionali (ESC) si manifesta innanzitutto durante il trapianto in aree ectopiche: durante l'iniezione sottocutanea di ESC in topi immunodeficienti, si formano teratocarcinomi nel sito di iniezione. Inoltre, durante lo sviluppo dell'embrione umano, la frequenza delle anomalie cromosomiche è maggiore rispetto all'embriogenesi negli animali. Allo stadio di blastocisti, solo il 20-25% degli embrioni umani è costituito da cellule con un cariotipo normale, e la stragrande maggioranza degli embrioni umani precoci ottenuti dopo fecondazione in vitro presenta un mosaicismo cromosomico caotico e molto spesso presenta aberrazioni numeriche e strutturali.

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Effetti benefici delle cellule staminali

I risultati preliminari degli studi clinici confermano l'effetto benefico delle cellule staminali sul paziente, ma non ci sono ancora informazioni sugli effetti a lungo termine del trapianto di cellule. Inizialmente, la letteratura era dominata da segnalazioni di risultati positivi del trapianto di frammenti cerebrali embrionali nella malattia di Parkinson, ma poi hanno iniziato ad apparire dati che negavano l'efficacia terapeutica del tessuto nervoso embrionale o fetale trapiantato nel cervello dei pazienti.

A metà del XX secolo, fu scoperto per la prima volta il ripristino dell'emopoiesi in animali irradiati in modo letale dopo trasfusione endovenosa di cellule del midollo osseo e, nel 1969, il ricercatore americano D. Thomas eseguì il primo trapianto di midollo osseo su esseri umani. La scarsa conoscenza dei meccanismi di incompatibilità immunologica tra le cellule del midollo osseo del donatore e del ricevente a quel tempo portò a un'elevata mortalità dovuta al frequente fallimento del trapianto e allo sviluppo della reazione del trapianto contro l'ospite. La scoperta del complesso maggiore di istocompatibilità, che include l'antigene leucocitario umano (HbA1c), e il miglioramento dei relativi metodi di tipizzazione permisero di aumentare significativamente la sopravvivenza dopo il trapianto di midollo osseo, il che portò all'uso diffuso di questo metodo di trattamento in oncoematologia. Un decennio dopo, furono eseguiti i primi trapianti di cellule staminali emopoietiche (CSE) ottenute da sangue periferico mediante leucaferesi. Nel 1988, il sangue del cordone ombelicale fu utilizzato per la prima volta come fonte di cellule staminali ematopoietiche (HSC) in Francia per curare un bambino affetto da anemia di Fanconi e, dalla fine del 2000, sono apparsi sulla stampa articoli sulla capacità delle HSC di differenziarsi in cellule di vari tipi di tessuto, ampliando potenzialmente la portata della loro applicazione clinica. Tuttavia, è emerso che il materiale trapiantato, insieme alle HSC, contiene un numero significativo di impurità cellulari non ematopoietiche di varia natura e proprietà. A questo proposito, si stanno sviluppando metodi per la purificazione del trapianto e criteri per valutarne la purezza cellulare. In particolare, viene utilizzata l'immunoselezione positiva delle cellule CD34+, che consente l'isolamento delle HSC mediante anticorpi monoclonali.

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Complicanze della terapia con cellule staminali

Le complicanze nel trapianto di midollo osseo sono spesso di natura ematologica e associate a un lungo periodo di pancitopenia iatrogena. Complicanze infettive, anemia ed emorragie si sviluppano più frequentemente. A tale proposito, è estremamente importante selezionare la modalità ottimale di prelievo, processamento e conservazione del midollo osseo per la massima preservazione delle cellule staminali, che garantisca un ripristino rapido e stabile dell'emopoiesi. Nella caratterizzazione di un trapianto, i seguenti parametri vengono attualmente comunemente valutati: il numero di cellule mononucleate e/o nucleate, le unità formanti colonie e il contenuto di cellule CD34-positive. Sfortunatamente, questi indicatori forniscono solo una valutazione indiretta della reale capacità emopoietica della popolazione di cellule staminali del trapianto. Oggi non esistono parametri assolutamente accurati per determinare l'adeguatezza di un trapianto per il ripristino a lungo termine dell'emopoiesi nei pazienti, anche in caso di trapianto autologo di midollo osseo. Lo sviluppo di criteri generali è estremamente difficile a causa della mancanza di standard rigorosi per il processamento, la crioconservazione e i test del trapianto. Inoltre, è necessario considerare l'intera gamma di fattori che influenzano i parametri del ripristino dell'emopoiesi in ogni singolo paziente. Nel trapianto autologo di midollo osseo, i più importanti sono il numero di cicli di chemioterapia precedenti, le caratteristiche del regime di condizionamento, il periodo di malattia in cui è stato prelevato il midollo osseo e le modalità di utilizzo dei fattori stimolanti le colonie nel periodo post-trapianto. Inoltre, non va dimenticato che la chemioterapia precedente il prelievo del midollo osseo può avere un effetto negativo sulle cellule staminali del midollo osseo.

L'incidenza di gravi complicanze tossiche aumenta significativamente durante il trapianto allogenico di midollo osseo. A questo proposito, i dati statistici sul trapianto allogenico di midollo osseo nella talassemia sono di interesse. I rapporti dell'European Bone Marrow Transplantation Group hanno registrato circa 800 trapianti di midollo osseo in pazienti con talassemia major. Il trapianto allogenico nella talassemia viene eseguito nella stragrande maggioranza dei casi da fratelli HLA-identici, il che è associato a gravi complicanze e ad alta mortalità durante il trapianto di materiale cellulare staminale da donatori consanguinei parzialmente compatibili o non consanguinei compatibili. Per ridurre al minimo il rischio di complicanze infettive fatali, i pazienti vengono collocati in box asettici isolati con flusso d'aria laminare e ricevono una dieta a basso contenuto batterico o priva di batteri. Per la decontaminazione batterica dell'intestino, vengono prescritte forme non riassorbibili di antibiotici e farmaci antimicotici per os. Per la profilassi, l'amfotericina B viene somministrata per via endovenosa. La prevenzione delle infezioni sistemiche è rafforzata con amikacina e ceftazidima, prescritte il giorno prima del trapianto, e proseguita fino alla dimissione del paziente. Tutti i prodotti ematici vengono irradiati a una dose di 30 Gy prima della trasfusione. La nutrizione parenterale durante il trapianto è una condizione necessaria e inizia immediatamente dopo la riduzione naturale dell'assunzione di cibo.

Numerose complicazioni sono associate all'elevata tossicità dei farmaci immunosoppressori, che spesso causano nausea, vomito e mucosite, danni renali e polmonite interstiziale. Una delle complicazioni più gravi della chemioterapia è la malattia veno-occlusiva del fegato, che porta al decesso nel periodo immediatamente successivo al trapianto. I fattori di rischio per la trombosi delle vene del sistema portale del fegato includono l'età dei pazienti, la presenza di epatite e fibrosi epatica, nonché la terapia immunosoppressiva dopo il trapianto di midollo osseo. La malattia veno-occlusiva è particolarmente pericolosa nella talassemia, che è accompagnata da emosiderosi epatica, epatite e fibrosi, frequenti compagne della terapia trasfusionale. La trombosi delle vene del sistema portale del fegato si sviluppa 1-2 settimane dopo il trapianto ed è caratterizzata da un rapido aumento del contenuto di bilirubina e dell'attività delle transaminasi nel sangue, dalla progressione di epatomegalia, ascite, encefalopatia e dolore nella parte superiore dell'addome. Istologicamente, il materiale autoptico rivela danno endoteliale, emorragie sottoendoteliali, danno agli epatociti centrolobulari, ostruzione trombotica delle venule e delle vene centrali del fegato. Casi di arresto cardiaco fatale associati agli effetti tossici dei citostatici sono stati descritti in pazienti con talassemia.

Durante il periodo pre-trapianto, ciclofosfamide e busulfano causano spesso cistite tossico-emorragica con alterazioni patologiche delle cellule uroepiteliali. L'uso di ciclosporina A nel trapianto di midollo osseo è spesso accompagnato da nefrotossicità e neurotossicità, sindrome ipertensiva, ritenzione idrica e citolisi epatocitaria. Le disfunzioni sessuali e riproduttive sono più frequenti nelle donne. Nei bambini piccoli, lo sviluppo puberale di solito non è compromesso dopo il trapianto, ma nei bambini più grandi la patologia dello sviluppo della sfera sessuale può essere molto grave, fino alla sterilità. Le complicazioni direttamente correlate al trapianto stesso includono il rigetto di cellule allogeniche del midollo osseo, l'incompatibilità ABO e le forme acute e croniche di malattia del trapianto contro l'ospite.

Nei pazienti sottoposti a trapianto di midollo osseo ABO-incompatibile, le isoagglutinine ospite-donatore ABO vengono prodotte per 330-605 giorni dopo il trapianto, il che può portare a un'emolisi prolungata e aumentare drasticamente la necessità di trasfusioni di sangue. Questa complicanza viene prevenuta trasfondendo solo globuli rossi di tipo 0. Dopo il trapianto, alcuni pazienti manifestano neutropenia, trombocitopenia o pancitopenia autoimmuni, che richiedono una splenectomia per essere corrette.

Nel 35-40% dei riceventi, la malattia del trapianto contro l'ospite (GVHD) acuta si sviluppa entro 100 giorni dal trapianto allogenico di midollo osseo HLA-identico. Il grado di coinvolgimento di cute, fegato e intestino varia da rash cutaneo, diarrea e iperbilirubinemia moderata a desquamazione cutanea, occlusione intestinale e insufficienza epatica acuta. Nei pazienti con talassemia, l'incidenza di GVHD acuta di grado I dopo trapianto di midollo osseo è del 75%, mentre quella di grado II e superiore è dell'11-53%. La GVHD cronica, come sindrome sistemica multiorgano, si sviluppa solitamente entro 100-500 giorni dal trapianto allogenico di midollo osseo nel 30-50% dei pazienti. Sono interessati cute, cavità orale, fegato, occhi, esofago e vie respiratorie superiori. Si distingue tra una forma limitata di malattia del trapianto contro l'ospite cronica, quando sono colpiti la pelle e/o il fegato, e una forma diffusa, quando lesioni cutanee generalizzate si associano a epatite cronica aggressiva, lesioni degli occhi, delle ghiandole salivari o di qualsiasi altro organo. Il decesso è spesso causato da complicanze infettive derivanti da grave immunodeficienza. Nella talassemia, una forma lieve di malattia del trapianto contro l'ospite cronica si verifica nel 12% dei casi, una forma moderata nel 3% e una forma grave nello 0,9% dei riceventi di midollo osseo allogenico HLA-compatibile. Una complicanza grave del trapianto di midollo osseo è il rigetto dell'innesto, che si sviluppa 50-130 giorni dopo l'intervento chirurgico. La frequenza del rigetto dipende dal regime di condizionamento. In particolare, nei pazienti talassemici che hanno ricevuto solo metotrexato durante il periodo di preparazione, il rigetto del trapianto di midollo osseo è stato osservato nel 26% dei casi, con una combinazione di metotrexato con ciclosporina A nel 9% dei casi e con la somministrazione di sola ciclosporina A nell'8% dei casi (Gaziev et al., 1995).

Le complicanze infettive dopo il trapianto di midollo osseo sono causate da virus, batteri e funghi. Il loro sviluppo è associato a neutropenia profonda indotta da farmaci chemioterapici durante il periodo di condizionamento, danni alle barriere mucose da citostatici e reazione del trapianto contro l'ospite (GVR). A seconda del momento di sviluppo, si distinguono tre fasi delle complicanze infettive. Nella prima fase (che si sviluppa nel primo mese dopo il trapianto), predominano danni alle barriere mucose e neutropenia, spesso accompagnati da infezioni virali (herpes, virus di Epstein-Barr, citomegalovirus, varicella zoster), nonché infezioni causate da batteri Gram-positivi e Gram-negativi, funghi Candida e aspergilli. Nel periodo immediatamente successivo al trapianto (secondo e terzo mese dopo il trapianto), l'infezione più grave è il citomegalovirus, che spesso porta alla morte dei pazienti nella seconda fase delle complicanze infettive. Nella talassemia, l'infezione da citomegalovirus dopo il trapianto di midollo osseo si sviluppa nell'1,7-4,4% dei riceventi. La terza fase si osserva nel tardo periodo post-trapianto (tre mesi dopo l'intervento) ed è caratterizzata da immunodeficienza combinata grave. Infezioni causate da Varicella zoster, streptococco, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e virus epatotropici sono comuni in questo periodo. Nella talassemia, la mortalità nei pazienti dopo trapianto di midollo osseo è associata a sepsi batterica e fungina, polmonite interstiziale idiopatica e da citomegalovirus, sindrome da distress respiratorio acuto, insufficienza cardiaca acuta, tamponamento cardiaco, emorragia cerebrale, malattia epatica veno-occlusiva e malattia acuta del trapianto contro l'ospite.

Attualmente, sono stati conseguiti alcuni successi nello sviluppo di metodi per l'isolamento di popolazioni pure di cellule staminali emopoietiche dal midollo osseo. La tecnica per ottenere sangue fetale dal cordone ombelicale è stata migliorata e sono stati sviluppati metodi per isolare le cellule emopoietiche dal sangue del cordone ombelicale. La stampa scientifica riporta che le cellule staminali emopoietiche sono in grado di moltiplicarsi se coltivate in terreni con citochine. Utilizzando bioreattori appositamente progettati per l'espansione delle cellule staminali emopoietiche, la biomassa delle cellule staminali emopoietiche isolate dal midollo osseo, dal sangue periferico o dal cordone ombelicale aumenta significativamente. La possibilità di espandere le cellule staminali emopoietiche rappresenta un passo importante verso lo sviluppo clinico del trapianto cellulare.

Tuttavia, prima della propagazione in vitro delle cellule staminali emopoietiche, è necessario isolare una popolazione omogenea di cellule staminali emopoietiche. Questo obiettivo viene solitamente raggiunto utilizzando marcatori che consentono la marcatura selettiva delle cellule staminali emopoietiche con anticorpi monoclonali legati covalentemente a un marcatore fluorescente o magnetico e il loro isolamento utilizzando un separatore cellulare appropriato. Allo stesso tempo, la questione delle caratteristiche fenotipiche delle cellule staminali emopoietiche non è stata risolta definitivamente. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) considerano le cellule con antigeni CD34, AC133 e Thyl sulla loro superficie e prive di CD38, HLA-DR o altri marcatori di differenziazione (cellule con fenotipo CD34+Liir) come candidate per le cellule staminali emopoietiche. I marcatori di lignaggio (Lin) includono la glicoforina A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Le cellule con fenotipo CD34+CD45RalüW CD71low, così come CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low, sono considerate promettenti per il trapianto.

La questione del numero di cellule staminali emopoietiche sufficiente per un trapianto efficace rimane problematica. Attualmente, le fonti di cellule staminali emopoietiche sono il midollo osseo, il sangue periferico e cordonale e il fegato embrionale. L'espansione delle cellule staminali emopoietiche si ottiene coltivandole in presenza di cellule endoteliali e fattori di crescita emopoietici. In vari protocolli, mieloproteine, SCF, eritropoietina, fattori di crescita insulino-simili, corticosteroidi ed estrogeni vengono utilizzati per indurre la proliferazione delle cellule staminali emopoietiche. Utilizzando combinazioni di citochine in vitro, è possibile ottenere un aumento significativo del pool di cellule staminali emopoietiche, con un picco di produzione alla fine della seconda settimana di coltivazione.

Tradizionalmente, il trapianto di cellule staminali emopoietiche da sangue cordonale viene utilizzato principalmente per le emoblastosi. Tuttavia, la dose minima di cellule staminali emopoietiche necessaria per il successo del trapianto è di 3,7 x 10⁻¹ ^cellule nucleate per 1 kg di peso corporeo del ricevente. L'utilizzo di un numero inferiore di cellule staminali emopoietiche da sangue cordonale aumenta significativamente il rischio di fallimento del trapianto e di recidiva della malattia. Pertanto, il trapianto di cellule staminali emopoietiche da sangue cordonale viene utilizzato principalmente per il trattamento delle emoblastosi nei bambini.

Purtroppo, non esistono ancora standard per l'approvvigionamento o protocolli standardizzati per l'uso clinico delle cellule staminali del cordone ombelicale. Di conseguenza, le cellule staminali del cordone ombelicale non sono una fonte legalmente riconosciuta di cellule emopoietiche per il trapianto. Inoltre, non esistono norme etiche o legali che disciplinino le attività e l'organizzazione delle banche del sangue cordonaleb, esistenti all'estero. Per un trapianto sicuro, tutti i campioni di sangue cordonale devono essere attentamente monitorati. Prima di prelevare il sangue da una donna incinta, è necessario ottenere il suo consenso. Ogni donna incinta deve essere sottoposta a esame per la presenza di HBsAg, di anticorpi contro i virus dell'epatite C, dell'HIV e della sifilide. Ogni campione di sangue cordonale deve essere testato come standard per il numero di cellule nucleate, la presenza di CD34+ e la capacità di formare colonie. Vengono inoltre eseguiti la tipizzazione dell'HbA, la determinazione del gruppo sanguigno ABO e la sua appartenenza al fattore Rh. Le procedure di analisi necessarie includono la coltura batteriologica per la sterilità, i test sierologici per le infezioni da HIV-1 e HIV-2, l'HBsAg, l'epatite virale C, l'infezione da citomegalovirus, HTLY-1 e HTLY-II, la sifilide e la toxoplasmosi. Inoltre, viene eseguita la reazione a catena della polimerasi per rilevare le infezioni da citomegalovirus e HIV. Sembra opportuno integrare i protocolli di analisi con un'analisi delle cellule staminali embrionali (GSC) del sangue del cordone ombelicale per rilevare malattie genetiche come l'a-talassemia, l'anemia falciforme, il deficit di adenosina deaminasi, l'agammaglobulinemia di Bruton, la malattia di Hurler e la malattia di Ponter.

La fase successiva della preparazione al trapianto riguarda la conservazione delle cellule staminali emopoietiche. Le procedure più pericolose per la vitalità delle cellule durante la loro preparazione sono il congelamento e lo scongelamento. Durante il congelamento delle cellule emopoietiche, una parte significativa di esse può essere distrutta a causa della formazione di cristalli. Per ridurre la percentuale di morte cellulare vengono utilizzate sostanze speciali, i crioprotettori. Il più delle volte, il DMSO viene utilizzato come crioprotettore in una concentrazione finale del 10%. Tuttavia, il DMSO a tale concentrazione è caratterizzato da un effetto citotossico diretto, che si manifesta anche in condizioni di esposizione minima. Una riduzione dell'effetto citotossico si ottiene mantenendo rigorosamente la temperatura zero della modalità di esposizione, nonché rispettando le norme per la lavorazione del materiale durante e dopo lo scongelamento (velocità di tutte le manipolazioni, utilizzo di procedure di lavaggio multiple). Concentrazioni di DMSO inferiori al 5% non devono essere utilizzate, poiché ciò causa la morte massiva delle cellule emopoietiche durante il periodo di congelamento.

La presenza di impurità eritrocitarie nella miscela di sospensione delle cellule staminali emopoietiche crea il rischio di sviluppare una reazione di incompatibilità per gli antigeni eritrocitari. Allo stesso tempo, quando gli eritrociti vengono rimossi, la perdita di cellule emopoietiche aumenta significativamente. A questo proposito, è stato proposto un metodo di isolamento non frazionato delle cellule staminali emopoietiche. In questo caso, una soluzione di DMSO al 10% e un raffreddamento a velocità costante (GS/min) a -80 °C vengono utilizzati per proteggere le cellule nucleate dagli effetti dannosi delle basse temperature, dopodiché la sospensione cellulare viene congelata in azoto liquido. Si ritiene che questo metodo di crioconservazione determini una lisi parziale degli eritrociti, quindi i campioni di sangue non richiedono frazionamento. Prima del trapianto, la sospensione cellulare viene scongelata, lavata per rimuovere l'emoglobina libera e il DMSO in una soluzione di albumina umana o nel siero sanguigno. La conservazione dei precursori emopoietici con questo metodo è effettivamente superiore rispetto al frazionamento del sangue del cordone ombelicale, ma rimane il rischio di complicazioni trasfusionali dovute alla trasfusione di eritrociti ABO-incompatibili.

L'istituzione di un sistema bancario per la conservazione di campioni di cellule staminali ematopoietiche testate e tipizzate per l'HLA potrebbe risolvere i problemi sopra menzionati. Tuttavia, ciò richiede l'elaborazione di norme etiche e legali, attualmente solo in fase di discussione. Prima di creare una rete bancaria, è necessario adottare una serie di regolamenti e documenti sulla standardizzazione delle procedure di raccolta, frazionamento, analisi e tipizzazione, nonché sulla crioconservazione delle cellule staminali ematopoietiche. Una condizione imprescindibile per il funzionamento efficace delle banche di cellule staminali ematopoietiche è l'organizzazione di una base informatica per l'interazione con i registri della World Marrow Donor Association (WMDA) e del National Marrow Donor Program degli Stati Uniti (NMDP).

Inoltre, è necessario ottimizzare e standardizzare i metodi di espansione in vitro delle cellule staminali ematopoietiche (HSC), principalmente delle cellule emopoietiche da sangue cordonale. L'espansione delle HSC da sangue cordonale è necessaria per aumentare il numero di potenziali riceventi compatibili con il sistema HLA. A causa dei piccoli volumi di sangue cordonale, il numero di HSC in esso contenute non è solitamente in grado di garantire il ripopolamento del midollo osseo nei pazienti adulti. Allo stesso tempo, per eseguire trapianti non correlati, è necessario avere accesso a un numero sufficiente di campioni di HSC tipizzati (da 10.000 a 1.500.000 per ricevente).

Il trapianto di cellule staminali emopoietiche non elimina le complicanze che accompagnano il trapianto di midollo osseo. L'analisi mostra che con il trapianto di cellule staminali da sangue cordonale, si sviluppano forme gravi di malattia del trapianto contro l'ospite acuta nel 23% dei riceventi e forme croniche nel 25%. Nei pazienti oncoematologici, si osservano recidive di leucemia acuta durante il primo anno dopo il trapianto di cellule staminali da sangue cordonale nel 26% dei casi.

Negli ultimi anni, i metodi di trapianto di cellule staminali emopoietiche periferiche si sono sviluppati intensamente. Il contenuto di cellule staminali emopoietiche (HSC) nel sangue periferico è così esiguo (1 HSC ogni 100.000 cellule del sangue) che il loro isolamento senza una preparazione specifica non ha senso. Pertanto, al donatore viene inizialmente somministrato un ciclo di farmaci che stimolano il rilascio di cellule emopoietiche dal midollo osseo nel sangue. A tale scopo, vengono utilizzati farmaci tutt'altro che innocui come la ciclofosfamide e il fattore stimolante le colonie di granulociti. Tuttavia, anche dopo la procedura di mobilizzazione delle HSC nel sangue periferico, il contenuto di cellule CD34+ non supera l'1,6%.

Per la mobilizzazione delle cellule staminali emopoietiche in ambito clinico, viene utilizzata più frequentemente la S-SEC, caratterizzata da una tolleranza relativamente buona, fatta eccezione per la comparsa pressoché naturale di dolore osseo. È importante notare che l'utilizzo di moderni separatori di sangue consente l'isolamento efficace delle cellule staminali emopoietiche. Tuttavia, in normali condizioni di emopoiesi, è necessario eseguire almeno 6 procedure per ottenere un numero sufficiente di cellule staminali emopoietiche con una capacità di ripopolamento paragonabile a quella della sospensione di midollo osseo. Ciascuna di queste procedure richiede la lavorazione di 10-12 litri di sangue sul separatore, il che può causare trombocitopenia e leucopenia. La procedura di separazione prevede l'introduzione di un anticoagulante (citrato di sodio) nel donatore, il che non esclude tuttavia l'attivazione piastrinica da contatto durante la centrifugazione extracorporea. Questi fattori creano le condizioni per lo sviluppo di complicanze infettive ed emorragiche. Un altro svantaggio del metodo è la notevole variabilità della risposta alla mobilizzazione, che richiede il monitoraggio del contenuto di HSC nel sangue periferico dei donatori, necessario per determinarne il livello massimo.

Il trapianto autogeno di cellule staminali emopoietiche, a differenza del trapianto allogenico, elimina completamente lo sviluppo di reazioni di rigetto. Tuttavia, uno svantaggio significativo dell'autotrapianto di cellule staminali emopoietiche, che ne limita le indicazioni, è l'elevata probabilità di reinfusione di cellule clonali leucemiche durante il trapianto. Inoltre, l'assenza dell'effetto "graft versus tumor" immunomediato aumenta significativamente la frequenza di recidive di emopatie maligne. Pertanto, l'unico metodo radicale per eliminare l'emopoiesi clonale neoplastica e ripristinare la normale emopoiesi policlonale nelle sindromi mielodisplastiche rimane la polichemioterapia intensiva con trapianto di emopoiesi allogenica.

Ma anche in questo caso, il trattamento per la maggior parte delle emoblastosi è mirato esclusivamente ad aumentare la durata di sopravvivenza dei pazienti e a migliorarne la qualità di vita. Secondo diversi studi di ampia portata, la sopravvivenza libera da recidiva a lungo termine dopo allotrapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSC) viene raggiunta nel 40% dei pazienti oncoematologici. Quando si utilizzano cellule staminali di un fratello/sorella HLA-compatibile, i risultati migliori si osservano nei pazienti giovani con una breve storia di malattia, una conta delle cellule blastiche fino al 10% e una citogenetica favorevole. Sfortunatamente, la mortalità associata alla procedura di allotrapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSC) nei pazienti con malattie mielodisplastiche rimane elevata (nella maggior parte dei casi, circa il 40%). I risultati di un lavoro decennale del National Bone Marrow Donor Program negli Stati Uniti (510 pazienti, età mediana 38 anni) indicano che la sopravvivenza libera da recidiva a due anni è del 29%, con una probabilità di recidiva relativamente bassa (14%). Tuttavia, la mortalità associata alla procedura di allotrapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSC) da donatore non consanguineo è estremamente elevata e raggiunge il 54% in un periodo di due anni. Risultati simili sono stati ottenuti in uno studio europeo (118 pazienti, età mediana 24 anni, sopravvivenza libera da recidiva a due anni 28%, recidiva 35%, mortalità 58%).

Durante cicli di chemioterapia intensiva con successivo ripristino dell'emopoiesi con cellule emopoietiche allogeniche, si verificano spesso complicanze immunoematologiche e trasfusionali. Queste sono in gran parte dovute al fatto che i gruppi sanguigni umani sono ereditati indipendentemente dalle molecole MHC. Pertanto, anche se il donatore e il ricevente sono compatibili per i principali antigeni HLA, i loro eritrociti possono presentare fenotipi diversi. Si distingue tra incompatibilità "maggiore", quando il ricevente presenta anticorpi preesistenti contro gli antigeni eritrocitari del donatore, e incompatibilità "minore", quando il donatore presenta anticorpi contro gli antigeni eritrocitari del ricevente. Sono possibili casi di una combinazione di incompatibilità "maggiore" e "minore".

I risultati di un'analisi comparativa dell'efficacia clinica dell'allotrapianto di cellule staminali emopoietiche del midollo osseo e del sangue del cordone ombelicale in emoblastosi indicano che nei bambini dopo l'allotrapianto di cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale, il rischio di sviluppare una reazione del trapianto contro l'ospite è significativamente ridotto, ma si osserva un periodo più lungo di recupero del numero di neutrofili e piastrine con una maggiore incidenza di mortalità a 100 giorni dal trapianto.

Lo studio delle cause di mortalità precoce ha permesso di chiarire le controindicazioni al trapianto allogenico di CSE, tra cui le più importanti sono:

• la presenza di test positivi per l'infezione da citomegalovirus nel ricevente o nel donatore (senza trattamento preventivo);
• malattia acuta da radiazioni;
• la presenza o anche solo il sospetto della presenza di un'infezione micotica in un paziente (senza effettuare una profilassi sistemica precoce con farmaci fungicidi);
• emoblastosi, in cui i pazienti hanno ricevuto un trattamento a lungo termine con citostatici (a causa dell'elevata probabilità di arresto cardiaco improvviso e insufficienza multiorgano);
• trapianto da donatori HLA non identici (senza profilassi della reazione acuta del trapianto contro l'ospite con ciclosporina A);
• epatite virale cronica C (a causa dell'elevato rischio di sviluppare una malattia veno-occlusiva del fegato).

Pertanto, il trapianto di CSE può causare gravi complicazioni, che spesso portano al decesso. Nel periodo iniziale (fino a 100 giorni dopo il trapianto), queste includono complicazioni infettive, malattia del trapianto contro l'ospite acuta, rigetto del trapianto (fallimento delle CSE del donatore), malattia epatica veno-occlusiva, nonché danni tissutali causati dalla tossicità del regime di condizionamento, caratterizzato da un'elevata velocità di rimodellamento (cute, endotelio vascolare, epitelio intestinale). Le complicazioni del periodo post-trapianto tardivo includono malattia del trapianto contro l'ospite cronica, recidive della malattia di base, ritardo di crescita nei bambini, disfunzione dell'apparato riproduttivo e della tiroide e danni oculari.

Recentemente, in relazione alle pubblicazioni sulla plasticità delle cellule del midollo osseo, è emersa l'idea di utilizzare le cellule staminali ematopoietiche (HSC) per trattare infarti e altre patologie. Sebbene alcuni esperimenti su animali supportino questa possibilità, le conclusioni sulla plasticità delle cellule del midollo osseo devono essere confermate. Questa circostanza dovrebbe essere presa in considerazione dai ricercatori che ritengono che le cellule del midollo osseo umano trapiantate si trasformino facilmente in cellule del muscolo scheletrico, del miocardio o del sistema nervoso centrale. L'ipotesi che le HSC siano una fonte cellulare naturale per la rigenerazione di questi organi richiede prove concrete.

In particolare, sono stati pubblicati i primi risultati di uno studio randomizzato aperto condotto da V. Belenkov (2003). Il suo scopo era studiare l'effetto di C-SvK (ovvero la mobilizzazione di cellule staminali ematopoietiche autologhe nel sangue) sullo stato clinico, emodinamico e neuroumorale di pazienti con insufficienza cardiaca cronica da moderata a grave, nonché valutarne la sicurezza rispetto alla terapia standard (inibitori dell'enzima di conversione dell'angiotensina, beta-bloccanti, diuretici, glicosidi cardiaci). Nella prima pubblicazione dei risultati dello studio, gli autori del programma osservano che l'unico argomento a favore di O-SvK è costituito dai risultati del trattamento di un paziente, che ha mostrato un indiscutibile miglioramento di tutti i parametri clinici ed emodinamici rispetto alla terapia con questo farmaco. Tuttavia, la teoria della mobilizzazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) nel flusso sanguigno con successiva rigenerazione miocardica nella zona post-infarto non è stata confermata: anche in un paziente con dinamica clinica positiva, l'ecocardiografia da stress con dobutamina non ha rivelato la comparsa di zone di miocardio vitale nell'area della cicatrice.

È importante sottolineare che attualmente non vi sono dati sufficienti per raccomandare un'ampia implementazione della terapia cellulare sostitutiva nella pratica clinica quotidiana. Sono necessari studi clinici ben progettati e di alta qualità per determinare l'efficacia delle diverse opzioni di terapia cellulare rigenerativa, svilupparne indicazioni e controindicazioni, nonché linee guida per l'uso combinato della terapia plastica rigenerativa e del trattamento chirurgico o conservativo tradizionale. Non esiste ancora una risposta alla domanda su quale specifica popolazione di cellule del midollo osseo (staminali emopoietiche o stromali) possa dare origine a neuroni e cardiomiociti, e non è chiaro quali condizioni vi contribuiscano in vivo.

In molti Paesi si stanno svolgendo lavori in questi ambiti. Nel riassunto del simposio sull'insufficienza epatica acuta dei National Institutes of Health degli Stati Uniti, tra i metodi di trattamento più promettenti, oltre al trapianto di fegato, vengono menzionati il trapianto di epatociti xeno- o allogenici e la connessione extracorporea di bioreattori con cellule epatiche. Esistono prove dirette che solo gli epatociti estranei funzionalmente attivi siano in grado di fornire un supporto efficace al fegato del ricevente. Per l'uso clinico di epatociti isolati, è necessario creare una banca cellulare, che ridurrà significativamente il tempo tra l'isolamento delle cellule e il loro utilizzo. Il metodo più accettabile per creare una banca di epatociti isolati è la crioconservazione delle cellule epatiche in azoto liquido. L'utilizzo di tali cellule in clinica in pazienti con insufficienza epatica acuta e cronica ha rivelato un effetto terapeutico piuttosto elevato.

Nonostante i risultati ottimistici e incoraggianti del trapianto di cellule epatiche nella sperimentazione e nella pratica clinica, permangono ancora molti problemi ben lungi dall'essere risolti. Tra questi, un numero limitato di organi adatti al prelievo di epatociti isolati, metodi insufficientemente efficaci per il loro isolamento, l'assenza di metodi standardizzati per la conservazione delle cellule epatiche, idee poco chiare sui meccanismi di regolazione della crescita e della proliferazione delle cellule trapiantate, l'assenza di metodi adeguati per valutare l'attecchimento o il rigetto di epatociti allogenici. Questo include anche la presenza di immunità al trapianto quando si utilizzano cellule allogeniche e xenogeniche, sebbene inferiore rispetto al trapianto di fegato ortotopico, ma che richiede l'uso di immunosoppressori, l'incapsulamento degli epatociti isolati o il loro trattamento speciale con enzimi. Il trapianto di epatociti porta spesso a un conflitto immunitario tra il ricevente e il donatore sotto forma di reazione di rigetto, che richiede l'uso di citostatici. Una soluzione a questo problema potrebbe essere l'uso di vettori microporosi polimerici per isolare le cellule epatiche, il che ne migliorerebbe la sopravvivenza, poiché la membrana della capsula protegge efficacemente gli epatociti nonostante l'immunizzazione dell'ospite.

Tuttavia, nell'insufficienza epatica acuta, tale trapianto di epatociti risulta inefficace a causa del tempo relativamente lungo necessario alle cellule epatiche per attecchire in un nuovo ambiente e raggiungere lo stadio di funzionalità ottimale. Una potenziale limitazione è la secrezione di bile durante il trapianto ectopico di epatociti isolati e, quando si utilizzano bioreattori, una significativa barriera fisiologica è rappresentata dalla discrepanza di specie tra le proteine umane e quelle prodotte dagli epatociti xenogenici.

In letteratura sono riportati dati secondo cui il trapianto locale di cellule staminali stromali del midollo osseo facilita un'efficace correzione dei difetti ossei e, in questo caso, il ripristino del tessuto osseo procede in modo più intensivo rispetto alla rigenerazione riparativa spontanea. Diversi studi preclinici su modelli sperimentali dimostrano in modo convincente la possibilità di utilizzare i trapianti di cellule stromali del midollo osseo in ortopedia, sebbene siano necessari ulteriori studi per ottimizzare queste metodiche, anche nei casi più semplici. In particolare, non sono ancora state individuate le condizioni ottimali per l'espansione ex vivo delle cellule stromali osteogeniche e la struttura e la composizione del loro vettore ideale (matrice) rimangono poco sviluppate. Il numero minimo di cellule necessarie per la rigenerazione ossea volumetrica non è stato determinato.

È stato dimostrato che le cellule staminali mesenchimali presentano plasticità transgerminale, ovvero la capacità di differenziarsi in tipi cellulari fenotipicamente non correlati alle cellule della linea originale. In condizioni di coltivazione ottimali, le linee cellulari staminali stromali policlonali del midollo osseo possono resistere a più di 50 divisioni in vitro, il che consente di ottenere miliardi di cellule stromali da 1 ml di aspirato midollare. Tuttavia, la popolazione di cellule staminali mesenchimali è eterogenea, il che si manifesta sia nella variabilità nelle dimensioni delle colonie, sia nella diversa velocità della loro formazione, sia nella diversità morfologica dei tipi cellulari, da cellule fusiformi simili a fibroblasti a grandi cellule piatte. L'eterogeneità fenotipica si osserva dopo sole 3 settimane di coltivazione delle cellule staminali stromali: alcune colonie formano noduli di tessuto osseo, altre formano cluster di adipociti e altre, più raramente, formano isole di tessuto cartilagineo.

Il trapianto di tessuto nervoso embrionale è stato inizialmente utilizzato per trattare malattie degenerative del sistema nervoso centrale. Negli ultimi anni, elementi cellulari di neurosfere ottenuti da cellule staminali neurali sono stati trapiantati al posto del tessuto cerebrale embrionale (Poltavtseva, 2001). Le neurosfere contengono precursori di neuroni e neuroglia, il che fa sperare nel ripristino delle funzioni cerebrali perse dopo il trapianto. Dopo il trapianto di neurosfere disperse nella regione striatale del cervello di ratto, è stata osservata la loro proliferazione e differenziazione in neuroni dopaminergici, eliminando l'asimmetria motoria nei ratti con emiparkinsonismo sperimentale. Tuttavia, in alcuni casi, si sono sviluppati tumori dalle neurosfere, che hanno portato alla morte degli animali (Bjorklund, 2002).

In clinica, studi approfonditi su due gruppi di pazienti, in cui né i pazienti né i medici che li osservavano sapevano (studio in doppio cieco), che un gruppo di pazienti era stato trapiantato con tessuto embrionale con neuroni produttori di dopamina, e il secondo gruppo di pazienti era stato sottoposto a un intervento fittizio, hanno prodotto risultati inaspettati. I pazienti trapiantati con tessuto nervoso embrionale non si sentivano meglio rispetto ai pazienti del gruppo di controllo. Inoltre, 5 pazienti su 33 hanno sviluppato discinesia persistente 2 anni dopo il trapianto di tessuto nervoso embrionale, condizione non presente nei pazienti del gruppo di controllo (Cellule staminali: progressi scientifici e direzioni future della ricerca. Nat. Institute of Health. USA). Uno dei problemi irrisolti della ricerca clinica sulle cellule staminali neurali del cervello rimane l'analisi delle reali prospettive e dei limiti del trapianto dei loro derivati per la correzione dei disturbi del sistema nervoso centrale. È possibile che la neuronogenesi nell'ippocampo indotta da un'attività epilettica prolungata, che porta alla sua riorganizzazione strutturale e funzionale, possa essere un fattore nello sviluppo progressivo dell'epilessia. Questa conclusione merita un'attenzione particolare, poiché evidenzia le possibili conseguenze negative della generazione di nuovi neuroni nel cervello maturo e della formazione di connessioni sinaptiche aberranti da parte di questi.

Non va dimenticato che la coltivazione in terreni di coltura con citochine (mitogeni) avvicina le caratteristiche delle cellule staminali a quelle delle cellule tumorali, poiché in esse si verificano cambiamenti simili nella regolazione del ciclo cellulare, determinando la capacità di una divisione illimitata. È sconsiderato trapiantare derivati precoci di cellule staminali embrionali in un individuo, poiché in questo caso il rischio di sviluppare neoplasie maligne è molto elevato. È molto più sicuro utilizzare la loro progenie più radicata, ovvero le cellule precursori di linee differenziate. Tuttavia, al momento, non è ancora stata sviluppata una tecnica affidabile per ottenere linee stabili di cellule umane che si differenziano nella direzione desiderata.

L'utilizzo di tecnologie di biologia molecolare per la correzione di patologie ereditarie e malattie umane mediante la modifica delle cellule staminali è di grande interesse per la medicina pratica. Le caratteristiche del genoma delle cellule staminali consentono di sviluppare schemi di trapianto unici per correggere malattie genetiche. Tuttavia, esistono diverse limitazioni in questo ambito che devono essere superate prima dell'applicazione pratica dell'ingegneria genetica delle cellule staminali. Innanzitutto, è necessario ottimizzare il processo di modificazione ex vivo del genoma delle cellule staminali. È noto che la proliferazione a lungo termine (3-4 settimane) delle cellule staminali ne riduce la trasfezione, pertanto sono necessari diversi cicli di trasfezione per raggiungere un elevato livello di modificazione genetica. Tuttavia, il problema principale è legato alla durata dell'espressione genica terapeutica. Finora, in nessuno studio il periodo di espressione effettiva dopo il trapianto di cellule modificate ha superato i quattro mesi. Nel 100% dei casi, nel tempo, l'espressione dei geni trasfettati diminuisce a causa dell'inattivazione dei promotori e/o della morte delle cellule con genoma modificato.

Un problema importante è il costo dell'utilizzo delle tecnologie cellulari in medicina. Ad esempio, il fabbisogno annuo stimato per finanziare solo le spese mediche di un'unità di trapianto di midollo osseo progettata per eseguire 50 trapianti all'anno è di circa 900.000 dollari.

Lo sviluppo delle tecnologie cellulari in medicina clinica è un processo complesso e articolato in più fasi, che richiede una cooperazione costruttiva tra centri scientifici e clinici multidisciplinari e la comunità internazionale. Allo stesso tempo, le questioni relative all'organizzazione scientifica della ricerca nel campo della terapia cellulare richiedono particolare attenzione. Le più importanti sono lo sviluppo di protocolli di ricerca clinica, il controllo dell'affidabilità dei dati clinici, la creazione di un registro nazionale degli studi, l'integrazione in programmi internazionali di studi clinici multicentrici e l'implementazione dei risultati nella pratica clinica.

In conclusione dell'introduzione ai problemi del trapianto cellulare, vorrei esprimere la speranza che l'unificazione degli sforzi dei principali specialisti ucraini provenienti da vari campi della scienza garantisca progressi significativi nella ricerca sperimentale e clinica e consenta nei prossimi anni di trovare modi efficaci per fornire assistenza alle persone gravemente malate che necessitano di trapianti di organi, tessuti e cellule.

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