Cellule staminali ematopoietiche

Cellule staminali ematopoietiche (CSE) da cellule progenitrici mesenchimali sono caratterizzate da multipotenzialità e danno luogo a linee cellulari, elementi finiti che formano cellule del sangue e alcune cellule tissutali specializzate del sistema immunitario.

L'ipotesi dell'esistenza di un antenato comune di tutte le cellule del sangue, così come il termine "cellule staminali", di proprietà di A. Maximov (1909) Il potenziale formazione di massa cellulare da GSK enorme -. Le cellule staminali del midollo osseo di produrre le cellule giorno 10 ° che compongono globuli della periferica stessa. L'esistenza di cellule staminali ematopoietiche è stata fondata nel 1961 in esperimenti sul recupero di emopoiesi nei topi trattati con una dose letale di radiazioni che distrugge le cellule staminali del midollo osseo. Pos cioè il trapianto di midollo osseo singenici così letale irradiato animali foci discreto di ematopoiesi sono stati rilevati nella milza di destinatari cui fonte - singole cellule progenitrici clonogeniche.

Quindi, è stata dimostrata la capacità delle cellule staminali ematopoietiche di autosostentarsi, che fornisce la funzione di emopoiesi durante l'ontogenesi. Nel processo di sviluppo embrionale, le CSE sono caratterizzate da un'alta attività migratoria, necessaria per la loro migrazione ai siti degli organi ematopoietici. Questa proprietà delle CSE viene mantenuta anche nell'ontogenesi: a causa della loro costante migrazione, si verifica un rinnovo permanente del pool di cellule immunocompetenti. L'abilità di GSK di migrare, penetrare attraverso barriere istoematologiche, l'impianto nei tessuti e la crescita clonogenica servì da base per il trapianto di midollo osseo in un numero di malattie associate alla patologia del sistema di emopoiesi.

Come tutte le risorse di cellule staminali, le cellule staminali ematopoietiche sono presenti nella loro nicchia (midollo osseo) in piccolissime quantità, il che causa alcune difficoltà nella loro allocazione. HSC umane immunofenotipica sono caratterizzati da cellule CD34 + NK capaci di migrare nel flusso sanguigno e colonizzare gli organi del sistema immunitario o per ripopolare lo stroma del midollo osseo. È necessario rendersi conto chiaramente che le CSE non sono le cellule più immature del midollo osseo, ma provengono dai predecessori, che includono le cellule negative SB34 dormienti simili ai fibroblasti. Si è constatato che le cellule con il fenotipo di CD34 sono in grado di entrare nel flusso sanguigno, dove cambiare il loro fenotipo nella CD34 +, ma la migrazione di ritorno nel midollo osseo sotto l'influenza del microambiente ancora una volta diventano elementi di cellule staminali CD34-negative. A riposo, le cellule CD34 non rispondono ai segnali stromali regolatori paracrini (fattori di crescita, citochine). Tuttavia, in situazioni che richiedono intensità amplificazione cellule staminali ematopoietiche con il CD34 fenotipo rispondere ai segnali di differenziazione formare sia ematopoietiche e cellule progenitrici mesenchimali. Ematopoiesi avviene per contatto diretto con GSK elementi cellulari dello stroma del midollo osseo presentato una complessa rete di macrofagi, cellule endoteliali reticolari, osteoblasti, fibroblasti stromali e della matrice extracellulare. Stromali del midollo osseo quadro - non solo una matrice o "scheletro" per tessuto emopoietico, porta regolazione fine dell'ematopoiesi causa di segnali regolatori paracrini di fattori di crescita, citochine e chemochine, e fornisce anche interazioni adesive necessarie per la formazione dei globuli.

Pertanto, la base del sistema di emopoiesi costantemente aggiornato è la cellula staminale emopoietica, che è in grado di auto-mantenimento prolungato, è polipotente (dal punto di vista della formazione del sangue). Durante il processo di commit, le CSE subiscono una differenziazione primaria e formano cloni di cellule che differiscono nelle loro caratteristiche citomorfologiche e immunofenotipiche. La formazione consecutiva di cellule progenitrici primitive e impegnate è completata dalla formazione di cellule progenitrici morfologicamente identificabili di varie linee ematopoietiche. Il risultato delle fasi successive di un complesso processo di ematopoiesi multi-stadio è la maturazione delle cellule e il rilascio nel sangue periferico di elementi maturi - eritrociti, leucociti, linfociti e piastrine.

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Fonti di cellule staminali ematopoietiche

Le cellule staminali emopoietiche sono considerate la fonte staminale più studiata, che è in gran parte dovuta al loro uso in clinica per il trapianto di midollo osseo. A prima vista si sa molto di queste cellule. In una certa misura questo è vero, poiché i discendenti intermedi e mature GSK - gli elementi cellulari più convenienti, ciascuno dei quali (eritrociti, leucociti, linfociti, monociti / macrofagi e piastrine) sono accuratamente studiati a tutti i livelli - dalla luce per microscopia elettronica, da caratteristiche biochimiche e immunofenotipiche prima dell'identificazione mediante analisi PCR. Tuttavia, il monitoraggio effettuato da morfologiche, ultrastrutturali, biochimiche, immunofenotipica e parametri biofisici della genomica GSK non ha dato risposte a molte problematiche, la cui soluzione è necessaria per lo sviluppo del trapianto di cellule. Non è ancora stabilita meccanismi di stabilizzazione GSK in stato dormiente, sono attivati, immettere la fase della divisione simmetrica o asimmetrica, e soprattutto - di impegno educativo funzionalmente diverse cellule del sangue, eritrociti, leucociti, linfociti e piastrine.

La presenza nelle cellule del midollo osseo con fenotipo di CD34, che sono gli antenati di cellule staminali sia mesenchimali e ematopoietiche ha sollevato il problema dell'esistenza dei primi vicino a cellule CD34-negative nella differenziazione delle cellule progenitrici e la linea stromale ematopoietiche. Con il metodo della coltura a lungo termine, è stata ottenuta una cosiddetta cellula che inizia la coltura a lungo termine (LTC-IC). La durata di tali cellule progenitrici a formare colonie attività stromali del midollo osseo sulla base di una combinazione di fattori di crescita è più di 5 settimane, considerando che la fattibilità di unità formanti colonie (CFU) impegnati nella cultura di soli 3 settimane. Si ritiene che attualmente il LTC-IC - analogo funzionale GCW come repopulyatsionnom ad un elevato potenziale di circa 20% LTC-IC sono caratterizzati da un fenotipo CD34 + CD38- e mostrano una elevata capacità di auto-rinnovamento. Tali cellule trovate nel midollo osseo umano con la frequenza 1:50 000. Tuttavia, si deve riconoscere cellule mieloidi limfoidoinitsiiruyuschie-vicini all'HSC che sono ottenute in condizioni di lungo termine (15 settimane) di coltura. Tali cellule sono designati come LTC, tra le cellule di midollo osseo umano si trovano in 10 volte inferiore alla LTC-IC, e si forma come linee di cellule mieloidi e linfoidi staminali emopoietiche.

Sebbene etichettatura cellule staminali ematopoietiche con anticorpi monoclonali, seguita da identificazione immunofenotipiche è il metodo principale per l'identificazione e la raccolta differenziata delle cellule staminali ematopoietiche con il potenziale uso clinico di GSK dedicato quindi limitata. Anticorpi bloccanti del recettore CD34 o altri antigeni marcatori di cernita immunopositive inevitabilmente altera le proprietà delle cellule isolate con esso. Più preferibile è la secrezione immuno-negativa di HSC su colonne magnetiche. Tuttavia, in questo caso, per la classificazione vengono utilizzati anticorpi monoclonali fissati su un supporto metallico. Inoltre, è importante notare che entrambi i metodi di isolamento dell'HSC si basano su caratteristiche fenotipiche e non su caratteristiche funzionali. Pertanto, molti ricercatori preferiscono utilizzare l'analisi dei parametri clonogenici GSK, che permette la dimensione e la composizione delle colonie per determinare il grado di maturazione e la direzione di differenziazione delle cellule progenitrici. È noto che nel processo di esecuzione del numero di celle e il numero dei loro tipi nella colonia diminuisce. Cellule staminali ematopoietiche e la sua cellula figlia presto, denominato "Unità monociti-megakariotsitokolonieobrazuyuschaya granulociti-eritrociti" (SFU-GEMM), creare una cultura multilineare grandi colonie contenenti, rispettivamente, granulociti, eritrociti, monociti e megacariociti. Situato sotto l'unità di linea di granulociti-lineage impegno monotsitokolonieobrazuyuschaya (SFU-GM) genera colonie di granulociti e macrofagi e unità formanti colonia granulociti (G-SFU) - solo piccole colonie di granulociti maturi. Primi eritrociti predecessore - unità burstoobrazuyuschaya dei globuli rossi (SFU-E) - è fonte di grande e più maturo rosso colonie globuli unità formatrice (SFU-E) - piccole colonie globuli rossi. Nella popolazione generale, con la crescita delle cellule in mezzi semisolidi possono identificare le cellule che formano sei tipi di colonie mieloidi: SFU-GEMM, GM-SFU, SFU-G, M-SFU, VFU-E ed E-SFU).

Tuttavia, oltre ai derivati ematopoietici, qualsiasi materiale di partenza per la separazione di HSC contiene un numero significativo di cellule concomitanti. In questo contesto, è necessaria una purificazione preliminare del trapianto, in primo luogo, delle cellule attive del sistema immunitario del donatore. Di solito viene utilizzata l'immunosfezione basata sull'espressione dei linfociti di antigeni specifici, che consente di isolarli e rimuoverli utilizzando anticorpi monoclonali. In aggiunta, un trapianto di midollo osseo tecnica immunorozetochnaya T-linfociti impoverito, che si basa sulla formazione di complessi di linfociti CD4 + e anticorpi monoclonali specifici eliminata in modo efficace mediante aferesi. Questa tecnica fornisce un materiale cellulare purificato con cellule staminali ematopoietiche 40-60%.

Aumentando il numero di cellule progenitrici a causa della rimozione di cellule mature del sangue da un prodotto leucaferesi è ottenuto mediante centrifugazione controcorrente seguita da filtrazione (in presenza del chelante - citrato trisodico) attraverso una colonna contenente fibre di nylon rivestite con immunoglobulina umana. L'applicazione coerente di queste due tecniche assicura una pulizia completa del trapianto dalle piastrine, l'89% dagli eritrociti e il 91% dai globuli bianchi. A causa di una riduzione significativa delle perdite di HSC, il livello delle cellule CD34 + nella massa cellulare totale può essere aumentato al 50%.

Per le caratteristiche funzionali delle cellule staminali ematopoietiche isolate, viene utilizzata la loro capacità di creare colonie di elementi del sangue maturi in coltura. L'analisi delle colonie formate consente di identificare e quantificare i tipi di cellule progenitrici, il grado della loro confor- mazione e anche di determinare la direzione della loro differenziazione. L'attività clonogenica viene determinata in mezzi semi-solidi su gel di metilcellulosa, agar, plasma o fibrina, che riduce l'attività di migrazione delle cellule, impedendo il loro attaccamento alla superficie del vetro o della plastica. In condizioni di coltura ottimali, i cloni di una singola cellula si sviluppano entro 7-18 giorni. Se ci sono meno di 50 cellule nel clone, viene identificato come un singolo cluster, se il numero di cellule supera i 50 - come una colonia. Viene preso in considerazione il numero di cellule capaci di formare una colonia (unità formanti colonie - CFU o cellule formanti colonie - COC). Va notato che i parametri e CFU COC non corrispondono al numero di HSC in sospensione cellulare, sebbene sia correlato a quello sottolinea nuovamente la necessità di identificare l'attività funzionale (formazione di colonie) di CSE in vitro.

Tra il midollo osseo cellule staminali ematopoietiche hanno il più alto potenziale proliferativo, formando in tal modo il più grande della cultura delle dimensioni colonia. Per il numero di tali colonie, si propone di determinare indirettamente il numero di cellule staminali. Dopo la formazione di colonie in vitro superiore di 0,5 mm di diametro e con il numero di cellule 1000, gli autori hanno testato la stabilità di queste cellule di subletali dosi di 5-fluorouracile e esaminati loro capacità di ripopolare il midollo osseo letale animali irradiati. Per questi parametri isolate cellule quasi indistinguibili da GSK e ricevuti simbolo abbreviato di HPP-CFC - cellule formanti colonie ad alto potenziale proliferativo.

La ricerca della possibilità di una selezione più qualitativa delle cellule staminali ematopoietiche continua. Tuttavia, le cellule staminali ematopoietiche sono morfologicamente simili ai linfociti e sono relativamente uniforme raccolta di cellule con nuclei quasi sferica, cromatina e particolato slabobazofilnoy piccola quantità di citoplasma. Anche il numero esatto è difficile da determinare. Si presume che GSK nel midollo osseo di una persona si verifichi con una frequenza di 1 ogni 106 cellule contenenti nucleo.

Identificazione di cellule staminali ematopoietiche

Per migliorare l'identificazione delle cellule staminali ematopoietiche viene effettuata sequenzialmente o simultaneamente (su un sorbitano multicanale tere) ricerca membrannosvyazannyh spettro di antigeni, in cui GSK fenotipo CD34 + CD38 dovrebbe essere combinato con la mancanza di marcatori di differenziazione lineare, in particolare antigeni di cellule immunocompetenti come CD4 e immunoglobuline di superficie glicoforina.

Praticamente tutti gli schemi di fenotipizzazione delle cellule staminali ematopoietiche includono la determinazione dell'antigene CD34. Questa glicoproteina con un peso molecolare di circa 110 kDa, che porta diversi siti di glicosilazione, è espressa sulla membrana plasmatica dopo l'attivazione del corrispondente gene situato sul 1 ° cromosoma. La funzione della molecola CD34 è associata all'interazione mediata dalla L-selectina delle prime cellule precursori ematopoietiche con la base stromale del midollo osseo. Tuttavia, va ricordato che la presenza di CD34 sulla superficie cellulare consente solo effettuare una valutazione preliminare del contenuto della GSK nella sospensione cellulare, come è espresso, e altre cellule progenitrici ematopoietiche e cellule stromali del midollo osseo e cellule endoteliali.

Durante la differenziazione delle cellule progenitrici ematopoietiche, l'espressione di CD34 è permanentemente ridotta. Le cellule progenitrici commesse da eritrociti, granulociti e monociti esprimono debolmente l'antigene CD34, o è assente sulla loro superficie (fenotipo CD34). Sulla membrana superficiale delle cellule differenziate del midollo osseo e dei globuli rossi maturi, l'antigene CD34 non viene rilevato.

Va notato che nella dinamica della differenziazione di cellule progenitrici ematopoietiche non solo riduce il livello di espressione di CD34, ma parallela progressivamente aumentata espressione di CD38 antigene - glicoproteina integrale di membrana con peso molecolare di 46 kDa avente NAD-glikogidrolaznoy e ciclasi ADP-ribosil, suggerendo il suo coinvolgimento nel trasporto e sintesi di ADP-ribosio. Pertanto, è possibile doppio controllo del grado di impegno di cellule progenitrici ematopoietiche. Popolazione di cellule con fenotipo CD34 + CD38 +, dalle cellule del midollo osseo CD34-positive 90-99% comprende le cellule progenitrici con limitato proliferativo differenziazione potenziale e, mentre con il fenotipo delle cellule CD34 + CD38 può rivendicare il ruolo di GSK.

Infatti, la popolazione di cellule del midollo osseo descritta dalla formula CD34 + CD38- contiene un numero relativamente elevato di cellule staminali primitive che possono differenziarsi nelle direzioni mieloidi e linfoidi. Nel contesto della coltivazione a lungo termine con il fenotipo delle cellule CD34 + CD38- riuscire ad ottenere tutte le cellule del sangue mature: neutrofili, eosinofili, basofili, monociti, megacariociti, eritrociti e linfociti.

Relativamente recenti ha trovato che le cellule CD34-positive esprimono più di due marker - AC133 e CD90 (Thy-1), che vengono utilizzati anche per identificare le cellule staminali ematopoietiche. Thy-1 antigene è co-espresso con il recettore CD117 (c-kit) sulle cellule CD34 + di midollo osseo, cordone e sangue periferico. Questa superficie fosfatidilinozitolsvyazyvayuschy glicoproteina con un peso molecolare di 25-35 kDa che è coinvolta nei processi di adesione cellulare. Alcuni autori ritengono che l'antigene Thy-1 è un marker per le cellule CD34-positive più immature. La replica delle cellule con il fenotipo delle cellule CD34 + Thy-1 + dare origine a linee in coltura a lungo termine per formare cellule figlie. Si suggerisce che l'antigene Thy-1 blocchi i segnali regolatori che causano l'interruzione della divisione cellulare. Nonostante il fatto che le cellule CD34 + TU1 + sono in grado di auto-rinnovamento e la creazione di linee in coltura a lungo termine, il loro fenotipo non può riguardare unicamente lo HSC, come Thy-1 + contenuto nel peso totale degli elementi di cella CD34-positive è di circa il 50%, superando di gran lunga la il numero di cellule ematopoietiche.

Più promettente per l'identificazione delle cellule staminali ematopoietiche è AC133, un marcatore antigene di cellule progenitrici ematopoietiche, la cui espressione è stata rilevata per la prima volta su cellule epatiche embrionali. AC133 è una glicoproteina transmembrana che compare sulla superficie della membrana cellulare nei primi stadi della maturazione della GSK - è possibile che sia ancora prima dell'antigene CD34. Negli studi di A. Petrenko e V. Grishchenko (2003), è stato riscontrato che AC133 esprime fino al 30% delle cellule CD34-positive del fegato embrionale.

Pertanto, il profilo ideale fenotipica di cellule staminali ematopoietiche da oggi concetti, la somma di struttura di cella, nei circuiti che devono essere presenti CD34 Antigeni configurazione, AC133 e Thy-1, ma non c'è spazio per proiezioni molecolare CD38, HLA-DR e marcatori di differenziazione lineare GPA , CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

GSK variazione fenotipica ritratto può essere una combinazione di CD34 + CD45RalowCD71low, poiché le proprietà delle cellule descritte da questa formula non differiscono dai parametri funzionali delle cellule con fenotipo CD34 + CD38. Inoltre, HSC umana può essere identificato da segni fenotipici CD34 + Thy-l + CD38Iow / 'c-kit / basso - soltanto 30 di queste cellule ripristinare completamente ematopoiesi in topi irradiati letale.

Dalla analisi delle caratteristiche fenotipiche generali delle cellule del midollo osseo effettivamente iniziato 40 anni di intensa attività di ricerca GSK contemporaneamente in grado sia di auto-rinnovamento e la differenziazione di altri elementi cellulari, che permette di giustificare l'uso di trapianto di midollo osseo per il trattamento di varie patologie del sistema emopoietico. Recentemente scoperti nuovi tipi di cellule staminali non sono ancora stati ampiamente utilizzati nella pratica clinica. Tuttavia, le cellule staminali da cordone ombelicale (cavo) sangue e nel fegato fetale possono espandersi significativamente trapianto di cellule non solo in ematologia, ma anche in altri campi della medicina, e diversi da HSC midollo osseo come quantitativi caratteristiche di prestazione e di qualità.

Spostamenti di massa di cellule staminali ematopoietiche necessaria per il trapianto sono generalmente ottenuti da midollo osseo, sangue periferico e il cavo, così come fegato embrionale. Inoltre, le cellule progenitrici ematopoietiche può essere ottenuta tramite propagazione in vitro di ESC e la loro successiva differenziazione in ematopoietiche mirati elementi cellulari. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) giustamente sottolineano differenze significative proprietà immunologiche e la possibilità di ripristinare l'emopoiesi GSK diversa origine, a causa di rapporto diseguale contenute nei loro fonti di pluripotenti precoce e progenitori successivamente impegnati. Inoltre, le cellule staminali ematopoietiche, derivati da varie fonti di gambo, caratterizzato quantitativamente e qualitativamente molto diverse associazioni cellule non ematopoietiche.

Una fonte tradizionale di cellule staminali ematopoietiche è il midollo osseo. Una sospensione delle cellule del midollo osseo viene ottenuta dall'osso addominale o dallo sterno mediante lisciviazione in anestesia locale. La sospensione così ottenuta è eterogenea e contiene una miscela di HSC, elementi di cellule stromali, cellule progenitrici impegnate delle linee mieloidi e linfoidi, nonché elementi del sangue maturi. Il numero di cellule con i fenotipi CD34 + e CD34 + CD38 tra le cellule mononucleate del midollo osseo è da 0,5 a 3,6 e da 0 a 0,5%, rispettivamente. Il sangue periferico dopo mobilizzazione indotta da G-CSF di HSC contiene 0,4-1,6% di CD34 + e 0-0,4% di CD34 + CD38.

Una più alta percentuale di cellule CD34 + CD38 immunofenotipo e sangue del cordone CD34 + - e 0-0,6 OD-2,6%, e il loro numero massimo viene rilevata tra cellule epatiche fetali ematopoietiche - e 2,3 0,2-12,5 -35,8%, rispettivamente.

Tuttavia, la qualità del materiale dell'innesto dipende non solo dalla quantità contenuta in esso delle cellule CD34 +, ma anche sulla loro attività funzionale, che può essere stimato dal livello di formazione di colonie in vivo (ripopolamento osseo in animali letale irradiati) e in vitro - di crescita di colonie su supporti semisolidi . Si è constatato che la colonia di formatura e l'attività proliferativa delle cellule progenitrici emopoietiche con il fenotipo CD34 + CD38 HLA-DR, isolata da fegato fetale, midollo osseo fetale e sangue del cordone, e supera notevolmente la capacità proliferativa delle cellule formanti colonie ematopoietiche del midollo osseo e del sangue periferico di un adulto. Analisi quantitativa e qualitativa di GSK origine diversa rivelato differenze significative del loro contenuto relativo alla sospensione cellulare, e la funzionalità. Il numero massimo di cellule CD34 + (24,6%) osservate nei materiali di innesto derivati dal midollo osseo fetale. Il midollo osseo di un essere umano adulto contiene il 2,1% di elementi di cellule CD34-positivi. Tra le cellule mononucleari di sangue periferico umano adulto solo lo 0,5% ha un fenotipo CD34 +, mentre il sangue del cordone loro ammontare raggiunge 2%. Così colonia capacità di formazione di CD34 + cellule del midollo osseo fetale di 2,7 volte superiore alla capacità di crescita clonale di ematopoietiche del midollo osseo di cellule umane adulte e cellule ematiche del cordone formare colonie considerevolmente maggiori rispetto elementi ematopoietiche isolate da sangue periferico di adulti: 65,5 a 40 e , 8 colonie / 105 celle, rispettivamente.

Le differenze nell'attività proliferativa e nella capacità di formazione delle colonie delle cellule staminali ematopoietiche sono associate non solo a diversi gradi della loro maturità, ma anche al loro microambiente naturale. E 'noto che l'intensità della proliferazione e differenziazione delle cellule staminali velocità determinata dall'influenza regolamentazione integrale del sistema multicomponenti di fattori di crescita e citochine che vengono prodotte da entrambe le cellule staminali e elementi cellulari del microambiente matrice stromale. Utilizzando le popolazioni cellulari purificate e media liberi siero al fine di coltura cellulare dando fattori di crescita caratterizzati che hanno un effetti stimolatori e inibitori sulle cellule staminali di vari livelli, cellule progenitrici e cellule di commesso in una particolare direzione lineare. I risultati degli studi condotti testimoniano in modo convincente che il GSK, ottenuto da fonti con diversi livelli di sviluppo ontogenetico, differiscono sia fenotipicamente che funzionalmente. Per GSK, rimanendo nelle prime fasi di ontogenesi, caratterizzato da un elevato potenziale di auto-riproduzione e alta attività proliferativa. Tali cellule si distinguono per una lunghezza telomerica più lunga e sono soggette a impegnarsi con la formazione di tutte le linee cellulari ematopoietiche. La reazione del sistema immunitario all'origine embrionale HSC è in ritardo, poiché tali cellule esprimono lievemente le molecole di HLA. C'è una chiara gradazione del contenuto relativo di cellule staminali emopoietiche e la loro capacità di auto-rinnovarsi e il numero di linee formano tipi di impegni: cellule CD34 + di fegato fetale> cellule CD34 + di sangue del cordone ombelicale> CD34 + cellule del midollo osseo. E 'importante che tali differenze non sono univoci per intra ed il neo postanatalnomu primo periodo dello sviluppo umano, ma anche in tutta l'ontogenesi - proliferativa e formare colonie l'attività delle cellule staminali emopoietiche derivate dal midollo osseo o dal sangue periferico di un adulto, inversamente proporzionale all'età del donatore.