Cellule staminali ematopoietiche del sacco vitellino

Ovviamente, i diversi potenziali proliferativi e differenziativi delle cellule staminali emopoietiche sono determinati dalle peculiarità del loro sviluppo ontogenetico, poiché anche la localizzazione delle principali aree dell'ematopoiesi cambia nell'uomo durante l'ontogenesi. Le cellule progenitrici emopoietiche del sacco vitellino fetale sono destinate alla formazione di una linea cellulare esclusivamente eritropoietica. Dopo la migrazione delle cellule staminali emopoietiche primarie al fegato e alla milza, lo spettro delle linee di attivazione si espande nel microambiente di questi organi. In particolare, le cellule staminali emopoietiche acquisiscono la capacità di generare cellule della linea linfoide. Nel periodo prenatale, le cellule progenitrici emopoietiche raggiungono la zona di localizzazione finale e popolano il midollo osseo. Durante lo sviluppo intrauterino, il sangue fetale contiene un numero significativo di cellule staminali emopoietiche. Ad esempio, alla 13a settimana di gravidanza, il livello di cellule staminali emopoietiche raggiunge il 18% del numero totale di cellule mononucleate del sangue. Successivamente si osserva una diminuzione progressiva del loro contenuto, ma anche prima della nascita la quantità di cellule staminali ematopoietiche (HSC) nel sangue del cordone ombelicale differisce di poco dalla loro quantità nel midollo osseo.

Secondo i concetti classici, il naturale cambiamento nella localizzazione dell'ematopoiesi durante lo sviluppo embrionale dei mammiferi avviene attraverso la migrazione e l'introduzione in un nuovo microambiente di cellule staminali ematopoietiche pluripotenti, dal sacco vitellino al fegato, alla milza e al midollo osseo. Poiché nelle fasi iniziali dello sviluppo embrionale il tessuto ematopoietico contiene un gran numero di cellule staminali, che diminuisce con la maturazione del feto, il tessuto ematopoietico del fegato embrionale, isolato da materiale abortivo tra le 5 e le 8 settimane di gestazione, è considerato il più promettente per l'ottenimento di cellule staminali ematopoietiche.

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Domande sull'origine delle cellule staminali emopoietiche

Non vi è dubbio che la formazione embrionale degli eritrociti abbia origine nelle isole sanguigne del sacco vitellino. Tuttavia, il potenziale di differenziazione in vitro delle cellule emopoietiche del sacco vitellino è molto limitato (si differenziano principalmente in eritrociti). Va notato che il trapianto di cellule staminali emopoietiche del sacco vitellino non è in grado di ripristinare l'emopoiesi per lungo tempo. Si è scoperto che queste cellule non sono i precursori delle cellule staminali emopoietiche adulte. Le vere cellule staminali emopoietiche compaiono prima, tra la 3a e la 5a settimana di sviluppo intrauterino, nella zona di formazione del tessuto gastrico e dell'endotelio dei vasi sanguigni (splancnopleura paraaortica, P-SP), nonché al posto dell'aorta, delle gonadi e dei reni primari, nella regione del mesonefro o cosiddetta regione AGM. È stato dimostrato che le cellule della regione AGM sono una fonte non solo di cellule staminali ematopoietiche (HSC), ma anche di cellule endoteliali dei vasi sanguigni e di osteoclasti coinvolti nei processi di formazione del tessuto osseo. Alla sesta settimana di gestazione, le cellule progenitrici emopoietiche precoci della regione AGM si spostano nel fegato, che rimane il principale organo emopoietico del feto fino alla nascita.

Poiché questo punto è estremamente importante dal punto di vista del trapianto cellulare, il problema dell'origine delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) nel processo di embriogenesi umana merita una presentazione più dettagliata. Le idee classiche secondo cui le cellule staminali ematopoietiche di mammiferi e uccelli provengono da una fonte extraembrionale si basano sugli studi di Metcalf e Moore, che furono i primi a utilizzare metodi di clonazione delle HSC e dei loro discendenti isolati dal sacco vitellino. I risultati del loro lavoro hanno costituito la base per la teoria della migrazione, secondo la quale le HSC, apparse inizialmente nel sacco vitellino, popolano sequenzialmente gli organi ematopoietici transitori e definitivi man mano che si forma in essi il corrispondente microambiente. In questo modo si è affermato il punto di vista secondo cui la generazione di HSC, inizialmente localizzata nel sacco vitellino, costituisce la base cellulare per l'ematopoiesi definitiva.

Le cellule progenitrici emopoietiche del sacco vitellino appartengono alla categoria delle cellule progenitrici emopoietiche più precoci. Il loro fenotipo è descritto dalla formula AA4.1+CD34+c-kit+. A differenza delle cellule staminali ematopoietiche mature del midollo osseo, non esprimono antigeni Sca-1 e molecole MHC. Sembrerebbe che la comparsa di antigeni marcatori sulle membrane superficiali delle cellule staminali ematopoietiche del sacco vitellino durante la coltura corrisponda al loro differenziamento durante lo sviluppo embrionale con la formazione di linee emopoietiche assegnate: il livello di espressione degli antigeni CD34 e Thy-1 diminuisce, l'espressione di CD38 e CD45RA aumenta e compaiono le molecole HLA-DR. Con la successiva specializzazione in vitro indotta da citochine e fattori di crescita, inizia l'espressione di antigeni specifici per le cellule progenitrici emopoietiche di una determinata linea cellulare. Tuttavia, i risultati dello studio dell'emopoiesi embrionale in rappresentanti di tre classi di vertebrati (anfibi, uccelli e mammiferi) e, in particolare, l'analisi dell'origine delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) responsabili dell'emopoiesi definitiva nell'ontogenesi postnatale, contraddicono i concetti classici. È stato stabilito che nei rappresentanti di tutte le classi considerate, durante l'embriogenesi si formano due regioni indipendenti in cui si originano le HSC. La regione "classica" extraembrionale è rappresentata dal sacco vitellino o dai suoi analoghi, mentre la zona intraembrionale di localizzazione delle HSC, recentemente identificata, include il mesenchima paraaortico e la regione AGM. Oggi si può sostenere che negli anfibi e negli uccelli le HSC definitive provengano da fonti intraembrionali, mentre nei mammiferi e nell'uomo il coinvolgimento delle HSC del sacco vitellino nell'emopoiesi definitiva non può ancora essere completamente escluso.

L'emopoiesi embrionale nel sacco vitellino è, in realtà, eritropoiesi primaria, caratterizzata dalla conservazione del nucleo in tutte le fasi della maturazione eritrocitaria e dalla sintesi di emoglobina di tipo fetale. Secondo i dati più recenti, l'ondata di eritropoiesi primaria termina nel sacco vitellino all'ottavo giorno di sviluppo embrionale. Segue un periodo di accumulo di cellule progenitrici eritroidi definitive - BFU-E, che si formano esclusivamente nel sacco vitellino e compaiono per la prima volta al nono giorno di gestazione. Nella fase successiva dell'embriogenesi, si formano già le cellule progenitrici eritroidi definitive - CFU-E, così come (!) i mastociti e le CFU-GM. Questa è la base del punto di vista secondo cui le cellule progenitrici definitive originano nel sacco vitellino, migrano con il flusso sanguigno, si stabiliscono nel fegato e danno rapidamente inizio alla prima fase dell'emopoiesi intraembrionale. Secondo questi concetti, il sacco vitellino può essere considerato, da un lato, la sede dell'eritropoiesi primaria e, dall'altro, la prima fonte di cellule progenitrici emopoietiche definitive nello sviluppo embrionale.

È stato dimostrato che cellule formanti colonie ad alto potenziale proliferativo possono essere isolate dal sacco vitellino già dall'ottavo giorno di gestazione, ovvero molto prima della chiusura del sistema vascolare dell'embrione e del sacco vitellino. Inoltre, le cellule ad alto potenziale proliferativo ottenute dal sacco vitellino in vitro formano colonie le cui dimensioni e composizione cellulare non differiscono dai corrispondenti parametri di crescita colturale delle cellule staminali del midollo osseo. Allo stesso tempo, quando si ritrapiantano cellule formanti colonie del sacco vitellino ad alto potenziale proliferativo, si formano significativamente più cellule figlie formanti colonie e cellule progenitrici multipotenti rispetto all'utilizzo di cellule progenitrici dell'emopoiesi del midollo osseo.

Una conclusione definitiva sul ruolo delle cellule staminali emopoietiche del sacco vitellino nell'ematopoiesi definitiva potrebbe essere fornita dai risultati del lavoro in cui gli autori hanno ottenuto una linea di cellule endoteliali del sacco vitellino (G166), che ha supportato efficacemente la proliferazione delle sue cellule con le caratteristiche fenotipiche e funzionali delle HSC (AA4.1+WGA+, bassa densità e deboli proprietà adesive). Il contenuto di queste ultime è aumentato di oltre 100 volte quando coltivato su uno strato feeder di cellule C166 per 8 giorni. Macrofagi, granulociti, megacariociti, cellule blastiche e monociti, così come cellule precursori dei linfociti B e T sono stati identificati in colonie miste cresciute su un sottostrato di cellule C166. Le cellule del sacco vitellino che crescono su un sottostrato di cellule endoteliali hanno la capacità di autoriprodursi e hanno resistito fino a tre passaggi negli esperimenti degli autori. Il ripristino dell'ematopoiesi con il loro aiuto in topi maturi con immunodeficienza combinata grave (SCID) è stato accompagnato dalla formazione di tutti i tipi di leucociti, nonché di linfociti T e B. Tuttavia, gli autori nei loro studi hanno utilizzato cellule del sacco vitellino di un embrione di 10 giorni, in cui i sistemi vascolari extra- e intraembrionali sono già chiusi, il che non ci permette di escludere la presenza di cellule staminali ematopoietiche intraembrionali tra le cellule del sacco vitellino.

Allo stesso tempo, l'analisi del potenziale di differenziazione delle cellule emopoietiche delle fasi precoci dello sviluppo, isolate prima dell'unificazione dei sistemi vascolari del sacco vitellino e dell'embrione (8-8,5 giorni di gestazione), ha rivelato la presenza di precursori delle cellule T e B nel sacco vitellino, ma non nel corpo dell'embrione. Nel sistema in vitro, con il metodo di coltura a due stadi su un monostrato di cellule epiteliali e sottoepiteliali del timo, le cellule mononucleate del sacco vitellino si sono differenziate in linfociti pre-T e linfociti T maturi. Nelle stesse condizioni di coltura, ma su un monostrato di cellule stromali del fegato e del midollo osseo, le cellule mononucleate del sacco vitellino si sono differenziate in linfociti pre-B e linfociti B IglVT maturi.

I risultati di questi studi indicano la possibilità di sviluppo di cellule del sistema immunitario dal tessuto extraembrionale del sacco vitellino e la formazione di linee di cellule T e B primarie dipende da fattori del microambiente stromale degli organi emopoietici embrionali.

Altri autori hanno anche dimostrato che il sacco vitellino contiene cellule con potenziale per la differenziazione linfoide e che i linfociti risultanti non differiscono nelle caratteristiche antigeniche da quelli degli animali sessualmente maturi. È stato stabilito che le cellule del sacco vitellino di un embrione di 8-9 giorni sono in grado di ripristinare la linfopoiesi nel timo atomocitario con la comparsa di linfociti maturi CD3+CD4+ e CD3+CD8+ dotati di un repertorio specifico di recettori delle cellule T. Pertanto, il timo può essere popolato da cellule di origine extraembrionale, ma è impossibile escludere la probabile migrazione di cellule precursori dei linfociti T precoci da fonti intraembrionali di linfopoiesi nel timo.

Allo stesso tempo, il trapianto di cellule emopoietiche del sacco vitellino in riceventi adulti irradiati non sempre si traduce in un ripopolamento a lungo termine delle zone di localizzazione del tessuto emopoietico depleto, e le cellule del sacco vitellino in vitro formano colonie spleniche significativamente inferiori rispetto alle cellule della regione AGM. In alcuni casi, utilizzando cellule del sacco vitellino di un embrione di 9 giorni, è ancora possibile ottenere un ripopolamento a lungo termine (fino a 6 mesi) del tessuto emopoietico nei riceventi irradiati. Gli autori ritengono che le cellule del sacco vitellino con fenotipo CD34+c-kit+ non solo non differiscano da quelle della regione AGM nella loro capacità di ripopolare gli organi emopoietici depleti, ma anche di ripristinare l'ematopoiesi in modo più efficace, poiché il sacco vitellino ne contiene quasi 37 volte di più.

È importante notare che gli esperimenti hanno utilizzato cellule ematopoietiche del sacco vitellino con antigeni marcatori delle cellule staminali ematopoietiche (c-kit+ e/o CD34+ e CD38+), iniettate direttamente nel fegato o nella vena addominale della prole di topi femmina a cui era stata somministrata busulfano al 18° giorno di gravidanza. In questi animali neonati, la mielopoiesi è stata nettamente soppressa a causa dell'eliminazione delle cellule staminali ematopoietiche causata dal busulfano. Dopo il trapianto di cellule staminali ematopoietiche del sacco vitellino, nel sangue periferico dei riceventi sono stati rilevati elementi formati contenenti il marcatore del donatore, la glicerofosfato deidrogenasi, per 11 mesi. È stato scoperto che le cellule staminali ematopoietiche del sacco vitellino ripristinano il contenuto di cellule di linea linfoide, mieloide ed eritroide nel sangue, nel timo, nella milza e nel midollo osseo, e il livello di chimerismo era più elevato nel caso di somministrazione intraepatica piuttosto che endovenosa di cellule del sacco vitellino. Gli autori ritengono che le cellule staminali ematopoietiche del sacco vitellino di embrioni in fase iniziale (fino a 10 giorni) richiedano un'interazione preliminare con il microambiente ematopoietico del fegato per popolare con successo gli organi ematopoietici dei riceventi adulti. È possibile che vi sia una fase unica di sviluppo nell'embriogenesi, in cui le cellule del sacco vitellino, inizialmente migrando verso il fegato, acquisiscono poi la capacità di popolare lo stroma degli organi ematopoietici dei riceventi maturi.

A questo proposito, va notato che il chimerismo delle cellule del sistema immunitario viene osservato abbastanza spesso dopo il trapianto di cellule del midollo osseo in riceventi maturi irradiati: nel sangue di questi ultimi, tra i linfociti B, T e i granulociti del ricevente, si trovano cellule del fenotipo del donatore in quantità piuttosto grandi, e ciò continua per almeno 6 mesi.

Le cellule emopoietiche nei mammiferi vengono rilevate per la prima volta con metodi morfologici al settimo giorno di sviluppo embrionale e sono rappresentate da isole emopoietiche all'interno dei vasi del sacco vitellino. Tuttavia, la differenziazione emopoietica naturale nel sacco vitellino è limitata agli eritrociti primari che trattengono i nuclei e sintetizzano l'emoglobina fetale. Ciononostante, si riteneva tradizionalmente che il sacco vitellino fosse l'unica fonte di cellule staminali ematopoietiche (HSC) che migrano verso gli organi emopoietici dell'embrione in via di sviluppo e forniscono l'emopoiesi definitiva negli animali adulti, poiché la comparsa di HSC nel corpo dell'embrione coincide con la chiusura dei sistemi vascolari del sacco vitellino e dell'embrione stesso. Questo punto di vista è supportato dai dati secondo cui le cellule del sacco vitellino, clonate in vitro, danno origine a granulociti e macrofagi e, in vivo, a colonie spleniche. Successivamente, nel corso di esperimenti di trapianto, è stato stabilito che le cellule emopoietiche del sacco vitellino, che nel sacco vitellino stesso sono in grado di differenziarsi solo in eritrociti primari, nel microambiente epatico di topi SCID neonati e adulti, il timo depleto o il feeder stromale acquisiscono la capacità di ripopolare gli organi emopoietici con il ripristino di tutte le linee emopoietiche anche negli animali riceventi adulti. In linea di principio, questo ci permette di classificarle come vere e proprie HSC, ovvero come cellule che funzionano nel periodo postnatale. Si presume che il sacco vitellino, insieme alla regione AGM, funga da fonte di HSC per l'ematopoiesi definitiva nei mammiferi, ma il loro contributo allo sviluppo del sistema emopoietico non è ancora chiaro. Anche il significato biologico dell'esistenza di due organi emopoietici con funzioni simili nell'embriogenesi precoce dei mammiferi non è chiaro.

La ricerca di risposte a questi interrogativi continua. In vivo, è stato possibile dimostrare la presenza nel sacco vitellino di embrioni di 8-8,5 giorni di vita di cellule che ripristinano la linfopoiesi in topi SCID irradiati subletalmente con una marcata carenza di linfociti T e B. Le cellule emopoietiche del sacco vitellino sono state iniettate sia per via intraperitoneale che direttamente nel tessuto splenico ed epatico. Dopo 16 settimane, nei riceventi sono stati rilevati linfociti T CD4+ e CD8+ TCR/CD34 e linfociti B B-220+IgM+ marcati con i geni antrx del donatore. Allo stesso tempo, gli autori non hanno trovato cellule staminali capaci di tale ripristino del sistema immunitario nel corpo di embrioni di 8-8,5 giorni di vita.

Le cellule emopoietiche del sacco vitellino presentano un elevato potenziale proliferativo e sono capaci di autoriproduzione prolungata in vitro. Alcuni autori identificano queste cellule come HSC in base alla generazione prolungata (quasi 7 mesi) di cellule progenitrici eritroidi, che differiscono dai progenitori midollari della linea eritroide per un periodo di passaggio più lungo, colonie più grandi, una maggiore sensibilità ai fattori di crescita e una proliferazione più prolungata. Inoltre, in appropriate condizioni di coltura in vitro delle cellule del sacco vitellino, si formano anche cellule progenitrici linfoidi.

I dati presentati ci permettono generalmente di considerare il sacco vitellino come una fonte di cellule staminali ematopoietiche (HSC), meno impegnate e quindi dotate di un potenziale proliferativo maggiore rispetto alle cellule staminali del midollo osseo. Tuttavia, nonostante il sacco vitellino contenga cellule progenitrici ematopoietiche pluripotenti che mantengono a lungo diverse linee di differenziazione ematopoietica in vitro, l'unico criterio per la completezza delle HSC è la loro capacità di ripopolare a lungo termine gli organi ematopoietici del ricevente, le cui cellule ematopoietiche sono distrutte o geneticamente difettose. Pertanto, la domanda chiave è se le cellule ematopoietiche pluripotenti del sacco vitellino possano migrare e popolare gli organi ematopoietici e se sia opportuno rivedere i lavori noti che dimostrano la loro capacità di ripopolare gli organi ematopoietici di animali maturi con la formazione delle principali linee ematopoietiche. Fonti intraembrionali di GSC definitive sono state identificate negli embrioni di uccelli già negli anni '70, il che ha già messo in dubbio le idee consolidate sull'origine extraembrionale delle GSC, anche in rappresentanti di altre classi di vertebrati. Negli ultimi anni, sono apparse pubblicazioni sulla presenza di aree intraembrionali simili contenenti GSC nei mammiferi e nell'uomo.

Va sottolineato ancora una volta che le conoscenze fondamentali in questo ambito sono estremamente importanti per la pratica del trapianto cellulare, poiché aiuteranno non solo a determinare la fonte preferenziale di cellule staminali ematopoietiche (HSC), ma anche a stabilire le caratteristiche dell'interazione delle cellule ematopoietiche primarie con un organismo geneticamente estraneo. È noto che l'introduzione di cellule staminali ematopoietiche di fegato fetale umano in un embrione di pecora in fase di organogenesi porta alla nascita di animali chimera, di cui il 3-5% delle cellule ematopoietiche umane è stabilmente determinato nel sangue e nel midollo osseo. Allo stesso tempo, le HSC umane non modificano il loro cariotipo, mantenendo un elevato tasso di proliferazione e la capacità di differenziazione. Inoltre, le HSC xenogeniche trapiantate non entrano in conflitto con il sistema immunitario e i fagociti dell'organismo ospite e non si trasformano in cellule tumorali, il che ha costituito la base per lo sviluppo intensivo di metodi per la correzione intrauterina di patologie genetiche ereditarie utilizzando HSC o ESC transfettate con geni deficitari.

Ma in quale fase dell'embriogenesi è più appropriato effettuare tale correzione? Per la prima volta, le cellule determinate per l'ematopoiesi compaiono nei mammiferi subito dopo l'impianto (6° giorno di gestazione), quando i segni morfologici di differenziazione ematopoietica e i presunti organi ematopoietici sono ancora assenti. In questa fase, le cellule disperse dell'embrione di topo sono in grado di ripopolare gli organi ematopoietici dei riceventi irradiati con la formazione di eritrociti e linfociti che differiscono dalle cellule ospiti rispettivamente per il tipo di emoglobina o glicerofosfato isomerasi, nonché per un ulteriore marcatore cromosomico (Tb) delle cellule donatrici. Nei mammiferi, come negli uccelli, contemporaneamente al sacco vitellino, prima della chiusura del letto vascolare comune, le cellule ematopoietiche compaiono direttamente nel corpo dell'embrione, nella splancnopleura paraaortica. Cellule emopoietiche con fenotipo AA4.1+ sono state isolate dalla regione AGM e caratterizzate come cellule emopoietiche multipotenti che formano linfociti T e B, granulociti, megacariociti e macrofagi. Fenotipicamente, queste cellule progenitrici multipotenti sono molto simili alle cellule staminali ematopoietiche (HSC) del midollo osseo di animali adulti (CD34+c-kit+). Il numero di cellule AA4.1+ multipotenti tra tutte le cellule della regione AGM è piccolo: non costituiscono più di 1/12 della sua parte.

Nell'embrione umano è stata identificata anche una regione intraembrionale contenente cellule staminali ematopoietiche (HSC) omologhe alla regione AGM degli animali. Inoltre, nell'uomo, oltre l'80% delle cellule multipotenti ad alto potenziale proliferativo è contenuto nel corpo dell'embrione, sebbene tali cellule siano presenti anche nel sacco vitellino. Un'analisi dettagliata della loro localizzazione ha mostrato che centinaia di tali cellule sono raccolte in gruppi compatti situati in stretta prossimità dell'endotelio della parete ventrale dell'aorta dorsale. Fenotipicamente, si tratta di cellule CD34CD45+Lin. Al contrario, nel sacco vitellino, così come in altri organi emopoietici dell'embrione (fegato, midollo osseo), tali cellule sono singole.

Di conseguenza, nell'embrione umano la regione AGM contiene cluster di cellule emopoietiche strettamente associate all'endotelio ventrale dell'aorta dorsale. Questo contatto è rintracciabile anche a livello immunochimico: sia le cellule dei cluster emopoietici che le cellule endoteliali esprimono il fattore di crescita endoteliale vascolare, il ligando Flt-3, i loro recettori FLK-1 e STK-1, nonché il fattore di trascrizione delle cellule staminali leucemiche. Nella regione AGM, i derivati mesenchimali sono rappresentati da un denso filamento di cellule rotondeggianti localizzate lungo l'intera aorta dorsale ed esprimono tenascina C, una glicoproteina della sostanza fondamentale attivamente coinvolta nei processi di interazione e migrazione intercellulare.

Le cellule staminali multipotenti della regione AGM dopo il trapianto ripristinano rapidamente l'emopoiesi nei topi maturi irradiati e garantiscono un'ematopoiesi efficace a lungo termine (fino a 8 mesi). Gli autori non hanno trovato cellule con tali proprietà nel sacco vitellino. I risultati di questo studio sono confermati dai dati di un altro lavoro, che ha dimostrato che negli embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo (10,5 giorni), la regione AGM è l'unica fonte di cellule che corrispondono alla definizione di HSC, ripristinando l'ematopoiesi mieloide e linfoide nei riceventi maturi irradiati.

La linea stromale AGM-S3 è stata isolata dalla regione AGM, le cui cellule supportano la generazione di cellule progenitrici impegnate (CFU-GM, BFU-E, CFU-E) e unità formanti colonie di tipo misto in coltura. Il contenuto di queste ultime durante la coltura su un sottostrato feeder di cellule della linea AGM-S3 aumenta da 10 a 80 volte. Pertanto, il microambiente della regione AGM contiene cellule basali stromali che supportano efficacemente l'ematopoiesi, quindi la regione AGM stessa potrebbe ben fungere da organo ematopoietico embrionale, una fonte di cellule staminali ematopoietiche definitive, ovvero le cellule staminali ematopoietiche che formano il tessuto ematopoietico di un animale adulto.

L'immunofenotipizzazione estesa della composizione cellulare della regione AGM ha mostrato che contiene non solo cellule emopoietiche multipotenti, ma anche cellule dedite alla differenziazione mieloide e linfoide (linfociti T e B). Tuttavia, l'analisi molecolare di singole cellule CD34+c-kit+ della regione AGM mediante reazione a catena della polimerasi ha rivelato l'attivazione solo dei geni della beta-globina e della mieloperossidasi, ma non dei geni linfoidi che codificano per la sintesi di CD34, Thy-1 e 15. L'attivazione parziale di geni specifici di lignaggio è caratteristica delle fasi ontogenetiche precoci della generazione di HSC e cellule progenitrici. Considerando che il numero di cellule progenitrici impegnate nella regione AGM di un embrione di 10 giorni è 2-3 ordini di grandezza inferiore rispetto al fegato, si può sostenere che al 10° giorno dell'embriogenesi l'ematopoiesi nella regione AGM è appena iniziata, mentre nell'organo ematopoietico principale del feto durante questo periodo le linee ematopoietiche si sono già sviluppate.

Infatti, a differenza delle cellule staminali emopoietiche precedenti (9-11 giorni) del sacco vitellino e della regione AGM, che ripopolano il microambiente emopoietico del neonato, ma non dell'organismo adulto, le cellule progenitrici emopoietiche del fegato embrionale di 12-17 giorni non necessitano più di un microambiente postnatale precoce e popolano gli organi emopoietici di un animale adulto non peggio di un neonato. Dopo il trapianto di cellule staminali emopoietiche embrionali (HSC) epatiche, l'ematopoiesi nei topi riceventi adulti irradiati presentava un carattere policlonale. Inoltre, utilizzando colonie marcate, è stato dimostrato che il funzionamento dei cloni trapiantati è completamente subordinato alla successione clonale riscontrata nel midollo osseo adulto. Di conseguenza, le cellule staminali ematopoietiche embrionali (HSC) marcate nelle condizioni più delicate, senza prestimolazione con citochine esogene, possiedono già le principali caratteristiche delle cellule staminali ematopoietiche adulte: non necessitano di un microambiente postembrionale precoce, entrano in uno stato di dormienza profonda dopo il trapianto e vengono mobilizzate nella formazione clonale in modo sequenziale, in conformità con il modello di successione clonale.

Ovviamente, è necessario soffermarsi più in dettaglio sul fenomeno della successione clonale. L'eritropoiesi è svolta da cellule staminali emopoietiche che hanno un elevato potenziale proliferativo e la capacità di differenziarsi in tutte le linee di cellule precursori delle cellule del sangue. A normale intensità di emopoiesi, la maggior parte delle cellule staminali emopoietiche si trova in uno stato dormiente e viene mobilitata per la proliferazione e la differenziazione, formando sequenzialmente cloni che si sostituiscono a vicenda. Questo processo è chiamato successione clonale. Prove sperimentali della successione clonale nel sistema emopoietico sono state ottenute in studi con cellule staminali ematopoietiche (HSC) marcate mediante trasferimento genico retrovirale. Negli animali adulti, l'emopoiesi è mantenuta da molti cloni emopoietici funzionanti simultaneamente, derivati dalle HSC. Sulla base del fenomeno della successione clonale, è stato sviluppato un approccio di ripopolamento per l'identificazione delle HSC. Secondo questo principio si distingue tra cellule staminali emopoietiche a lungo termine (LT-HSC), in grado di ripristinare il sistema emopoietico per tutta la vita, e HSC a breve termine, che svolgono questa funzione per un periodo di tempo limitato.

Considerando le cellule staminali emopoietiche dal punto di vista dell'approccio di ripopolamento, la peculiarità delle cellule emopoietiche del fegato embrionale risiede nella loro capacità di creare colonie di dimensioni significativamente maggiori rispetto a quelle che si formano con le cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale o del midollo osseo, e questo vale per tutti i tipi di colonie. Questo fatto, di per sé, indica un potenziale proliferativo più elevato delle cellule emopoietiche del fegato embrionale. Una proprietà unica delle cellule progenitrici emopoietiche del fegato embrionale è un ciclo cellulare più breve rispetto ad altre fonti, il che è di grande importanza dal punto di vista dell'efficacia del ripopolamento degli organi emopoietici durante il trapianto. L'analisi della composizione cellulare della sospensione emopoietica ottenuta da fonti di un organismo maturo indica che in tutte le fasi dell'ontogenesi, le cellule nucleari sono rappresentate prevalentemente da cellule definitivamente differenziate, il cui numero e fenotipo dipendono dall'età ontogenetica del donatore di tessuto emopoietico. In particolare, le sospensioni di cellule mononucleate del midollo osseo e del sangue del cordone ombelicale sono costituite per oltre il 50% da cellule mature della serie linfoide, mentre il tessuto emopoietico del fegato embrionale contiene meno del 10% di linfociti. Inoltre, le cellule della linea mieloide nel fegato embrionale e fetale sono rappresentate principalmente dalla serie eritroide, mentre nel sangue del cordone ombelicale e nel midollo osseo prevalgono elementi granulocitari-macrofagici.

È inoltre importante che il fegato embrionale contenga un set completo dei primi precursori emopoietici. Tra questi ultimi, vanno menzionate le cellule eritroidi, granulopoietiche, megacariopoietiche e le cellule formanti colonie multilineari. I loro precursori più primitivi, le cellule LTC-IC, sono in grado di proliferare e differenziarsi in vitro per 5 settimane o più e mantengono l'attività funzionale anche dopo l'attecchimento nel corpo del ricevente durante il trapianto allogenico e persino xenogenico in animali immunodeficienti.

L'opportunità biologica della predominanza di cellule eritroidi nel fegato embrionale (fino al 90% del numero totale di elementi emopoietici) è dovuta alla necessità di fornire massa eritrocitaria al volume ematico in rapido aumento del feto in via di sviluppo. Nel fegato embrionale, l'eritropoiesi è rappresentata da precursori eritroidi nucleari di vario grado di maturità contenenti emoglobina fetale (α2μ7), che, grazie alla sua maggiore affinità per l'ossigeno, ne garantisce l'efficace assorbimento dal sangue materno. L'intensificazione dell'eritropoiesi nel fegato embrionale è associata a un aumento locale della sintesi di eritropoietina (EPO). È interessante notare che la sola presenza di eritropoietina è sufficiente per la realizzazione del potenziale emopoietico delle cellule emopoietiche nel fegato embrionale, mentre una combinazione di citochine e fattori di crescita costituiti da EPO, SCF, GM-CSF e IL-3 è necessaria per l'attivazione eritropoietica delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) del midollo osseo e del sangue cordonale. Allo stesso tempo, le cellule progenitrici emopoietiche precoci isolate dal fegato embrionale, che non presentano recettori per l'EPO, non rispondono all'eritropoietina esogena. Per l'induzione dell'eritropoiesi in una sospensione di cellule mononucleate del fegato embrionale, è necessaria la presenza di cellule più avanzate sensibili all'eritropoietina con fenotipo CD34+CD38+, che esprimono il recettore per l'EPO.

In letteratura, non esiste ancora un consenso unanime sullo sviluppo dell'emopoiesi nel periodo embrionale. Il significato funzionale dell'esistenza di fonti extra- e intraembrionali di cellule progenitrici emopoietiche non è stato stabilito. Tuttavia, non vi è dubbio che nell'embriogenesi umana il fegato sia l'organo centrale dell'emopoiesi e, tra la sesta e la dodicesima settimana di gestazione, costituisca la principale fonte di cellule staminali emopoietiche che popolano milza, timo e midollo osseo. Le GDR garantiscono lo svolgimento delle corrispondenti funzioni nei periodi pre- e postnatali dello sviluppo.

Va sottolineato ancora una volta che il fegato embrionale, rispetto ad altre fonti, è caratterizzato dal più elevato contenuto di cellule staminali ematopoietiche (HSC). Circa il 30% delle cellule CD344 del fegato embrionale presenta il fenotipo CD38. Allo stesso tempo, il numero di cellule progenitrici linfoidi (CD45+) nelle fasi precoci dell'emopoiesi nel fegato non supera il 4%. È stato dimostrato che, durante lo sviluppo del feto, dalla 7a alla 17a settimana di gestazione, il numero di linfociti B aumenta progressivamente con un "step" mensile dell'1,1%, mentre il livello di HSC diminuisce in modo permanente.

L'attività funzionale delle cellule staminali emopoietiche dipende anche dal periodo di sviluppo embrionale della loro fonte. Lo studio dell'attività formante colonie di cellule epatiche di embrioni umani a 6-8 e 9-12 settimane di gestazione durante la coltura in un mezzo semiliquido in presenza di SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 ed EPO ha mostrato che il numero totale di colonie è 1,5 volte superiore quando si seminano HSC di fegato embrionale nelle fasi precoci di sviluppo. Allo stesso tempo, il numero di cellule progenitrici della mielopoiesi come CFU-GEMM nel fegato a 6-8 settimane di embriogenesi è più di tre volte superiore al loro numero a 9-12 settimane di gestazione. In generale, l'attività formante colonie delle cellule epatiche emopoietiche di embrioni nel primo trimestre di gestazione era significativamente superiore a quella delle cellule epatiche fetali nel secondo trimestre di gravidanza.

I dati sopra riportati indicano che il fegato embrionale all'inizio dell'embriogenesi si distingue non solo per un maggiore contenuto di cellule progenitrici emopoietiche precoci, ma le sue cellule emopoietiche sono caratterizzate da un più ampio spettro di differenziazione in diverse linee cellulari. Queste caratteristiche dell'attività funzionale delle cellule staminali emopoietiche del fegato embrionale possono avere un certo significato clinico, poiché le loro caratteristiche qualitative consentono di aspettarsi un pronunciato effetto terapeutico anche con il trapianto di un piccolo numero di cellule ottenute nelle fasi precoci della gestazione.

Tuttavia, il problema della quantità di cellule staminali emopoietiche necessarie per un trapianto efficace rimane aperto e rilevante. Si sta tentando di risolverlo sfruttando l'elevato potenziale di auto-riproduzione delle cellule staminali emopoietiche del fegato embrionale in vitro, quando stimolate da citochine e fattori di crescita. Con una perfusione costante di cellule staminali emopoietiche embrionali precoci in un bioreattore, dopo 2-3 giorni è possibile ottenere una quantità di cellule staminali emopoietiche in uscita 15 volte superiore al livello iniziale. A titolo di confronto, va notato che sono necessarie almeno due settimane per ottenere un aumento di 20 volte della produzione di cellule staminali emopoietiche da sangue cordonale umano nelle stesse condizioni.

Pertanto, il fegato embrionale si differenzia da altre fonti di cellule staminali emopoietiche per un contenuto più elevato di cellule progenitrici emopoietiche sia impegnate che precoci. In coltura con fattori di crescita, le cellule epatiche embrionali con fenotipo CD34+CD45Ra1 CD71l0W formano colonie 30 volte superiori rispetto a cellule del sangue cordonale simili e 90 volte superiori rispetto alle cellule staminali emopoietiche del midollo osseo. Le differenze più pronunciate nelle fonti specificate riguardano il contenuto di cellule progenitrici emopoietiche precoci che formano colonie miste: la quantità di CFU-GEMM nel fegato embrionale supera rispettivamente di 60 e 250 volte quella presente nel sangue cordonale e nel midollo osseo.

È inoltre importante che fino alla 18a settimana di sviluppo embrionale (il periodo di inizio dell'emopoiesi nel midollo osseo), oltre il 60% delle cellule epatiche sia coinvolto nell'attuazione della funzione emopoietica. Poiché il feto umano non possiede timo e, di conseguenza, timociti fino alla 13a settimana di sviluppo, il trapianto di cellule emopoietiche da fegato embrionale di 6-12 settimane di gestazione riduce significativamente il rischio di sviluppare una reazione "graft versus host" e non richiede la selezione di un donatore istocompatibile, poiché rende relativamente facile ottenere il chimerismo emopoietico.