Diagnosi di laboratorio della tubercolosi

La tubercolosi è una malattia facile da diagnosticare in condizioni moderne e risultati scientifici. La diagnosi di laboratorio della tubercolosi è centrale per altri metodi diagnostici, seconda solo ai metodi di ricerca a raggi X.

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Esame del sangue clinico

Nei pazienti con tubercolosi, i cambiamenti nell'analisi generale del sangue non sono patognomonici. Con forme limitate e inattive di tubercolosi, l'eritrocita è ipocromico in quantità normale. Quando massicce infiltrati o polmonite caseosa, mentre la prevalenza di linfadenite caseosa, lesioni intestinali specifici, così come per le grandi polmonare o sanguinamento postoperatorio e nota eritropenia microcitosi, oligohromaziyu, polihromaziyu. La macrocitosi, e particolarmente il poikilotsitoz si incontrano molto meno spesso, di solito con anemia severa. Numero di reticolociti nel passo tubercolosi compensata va dallo 0,1 allo 0,6%, con subcompensated - fra 0,6 1,0% e 1% è caratterizzata da reticolociti scompensati.

Quando tubercolosi in alcuni casi può essere una leucocitosi moderato (fino a 15 mila di leucociti.), Meno radiazioni, che si verificano nel 2-7% dei pazienti con forme di processo che si verificano limitate e facili da usare e di 12,5% - di tubercolosi polmonare distruttivo e progressiva .

I cambiamenti più frequenti si verificano nella formula dei leucociti. Segnare la neutrofilia relativa e assoluta, uno spostamento moderato della formula dei leucociti a sinistra prima dei promielociti. I mielociti sono molto rari nel caso di tubercolosi non complicata. Un aumento del numero di neutrofili con granulosità patologica nell'emogramma di un paziente con tubercolosi indica sempre la durata del processo: in pazienti con tubercolosi grave, quasi tutti i neutrofili contengono granulosità patologica. Quando l'epidemia tubercolare cessa, lo spostamento nucleare si avvicina rapidamente alla normalità. La granulosità patologica dei neutrofili di solito persiste più a lungo di altri cambiamenti nell'emogramma.

Anche il contenuto di eosinofili nel sangue periferico varia a seconda della fase del processo e dello stato allergico dell'organismo. Il loro numero diminuisce fino aneozinofiliya nel focolaio grave e prolungata della malattia e, viceversa, aumenta al infiltrati riassorbimento e versamento pleurico, così come le prime forme di tubercolosi primaria.

La maggior parte delle forme di tubercolosi primaria è accompagnata da linfopenia, che a volte viene osservata per un certo numero di anni, anche dopo aver cicatrizzato cambiamenti specifici. La tubercolosi secondaria nella fase di esacerbazione, a seconda della gravità del processo, può essere accompagnata da un numero normale di linfociti o linfopenia.

Occupa un posto particolare determinazione VES Ulteriori test per valutare processo tubercolare (ESR) di valore nel valutare il processo tubercolosi flusso e identificare le sue forme attive. Aumento ESR indica la presenza del processo patologico (infettivo-infiammatorio, settico suppurativa, hemoblastosis, Hodgkin et al.) Ed è indicativa della sua gravità, ma livelli normali non ESR sempre indica l'assenza di patologia. Accelerazione di eritrosedimentazione contribuire ad un aumento dei livelli ematici di globuline, fibrinogeno, colesterolo, e diminuire la viscosità del sangue. Lento eritrosedimentazione caratteristica di condizioni accompagnata emoconcentrazione, l'aumento del contenuto di acidi biliari e albumina.

L'emogramma nei pazienti con tubercolosi cambia durante il trattamento. Gli spostamenti ematologici spariscono più velocemente, più successo ha l'intervento terapeutico. Tuttavia, si dovrebbe tenere a mente l'effetto sull'emopoiesi di vari farmaci antibatterici. Spesso causano eosinofilia, in alcuni casi - leucocitosi e più spesso leucopenia fino ad agranulocitosi e reazione linfoide-reticolare. Il controllo ematologico sistematico e l'analisi corretta dei dati ottenuti sono essenziali per valutare lo stato clinico del paziente, la dinamica del processo e l'efficacia del trattamento utilizzato.

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Analisi clinica delle urine

Con la tubercolosi del sistema urinario, l'analisi delle urine è il principale metodo diagnostico di laboratorio. È possibile osservare leucocitosi, eritrocituria, proteinuria, ipoisostenuria, tubercolosi micobatterio, batteriuria non specifica.

Leucocituria - il sintomo più comune di tubercolosi del sistema urinario prima della chemioterapia e non v'è alcuna specifica solo in casi eccezionali, come ad esempio completa obliterazione del lume dell'uretere. Test Nechyporenko (determinazione del numero di leucociti in 1 ml di urina) aiuta a valutare con maggiore obiettività il nefrotuberkuloze laurea leucocituria con, e in alcuni casi per identificarlo in analisi delle urine normale. Tuttavia, si deve tenere conto del fatto che la leucocitia può verificarsi in pielonefrite acuta e cronica, cistite, uretrite, calcoli renali e ureterali.

Eritrotsiturii. Così come leucocituria. Sono considerati uno dei segni di laboratorio più frequenti della tubercolosi del sistema genito-urinario. La frequenza di ematuria dipende dalla prevalenza del processo, aumenta con il progredire del processo distruttivo della tubercolosi nel rene. L'eritrocituria senza leucocituria è più tipica nelle prime fasi della tubercolosi dei reni. L'ematuria, che predomina sulla leucocituria, è un argomento importante a favore della tubercolosi dei reni nella sua differenziazione con pielonefrite aspecifica.

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Analisi del sangue biochimica

Con la tubercolosi, i cambiamenti in alcuni parametri biochimici dipendono principalmente dalla fase del processo, dalle complicazioni e da varie malattie concomitanti. Nei pazienti con tubercolosi inattiva dei polmoni e di altri organi, le frazioni proteiche e proteiche totali del siero di sangue sono invariate e determinano il loro contenuto normale.

Nelle forme acute della malattia, così come con l'esacerbazione e la progressione delle forme croniche di tubercolosi, il coefficiente di albumina-globulina diminuisce.

Essenziale per valutare lo stato funzionale del danno organico e del fegato in tubercolosi e le sue complicanze è la determinazione del totale siero e bilirubina diretta, AST (ACT), alanina aminotransferasi (ALT). Determinazione dinamica dei livelli di aminotransferasi. Bilirubina nel trattamento di pazienti affetti da tubercolosi, in particolare nelle forme gravi, - una componente obbligatoria dell'esame biochimico dei pazienti affetti da tubercolosi e viene condotta su base mensile.

La valutazione dello stato funzionale dei reni comprende la determinazione della creatinina sierica e il calcolo della velocità di filtrazione glomerulare secondo la formula di Cockcroft-Gault. Il calcolo della velocità di filtrazione glomerulare utilizzando il campione di Reberg fornisce risultati meno accurati.

L'obiettivo principale degli studi biochimici dinamici sui pazienti affetti da tubercolosi è monitorare l'andamento del processo, individuare tempestivamente gli effetti collaterali dei farmaci e correggere adeguatamente i disordini omeostatici.

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Applicazione di metodi biochimici di indagine nella tubercolosi extrapolmonare

L'indicatore più informativo è il contenuto di acido tubercolostearico nei fluidi biologici, ma la sua definizione è associata a difficoltà tecniche (la necessità di gas cromatografia e spettrometria di massa).

Misurazione prospettica dell'attività dell'adenosina deaminasi - un enzima, determinato nei liquidi: sinoviale, pericardico, ascitico o spinale. I principali produttori di adenosina deaminasi sono linfociti e monociti. Determinazione dell'attività dell'adenosina deaminasi nei fluidi biologici facilita la diagnosi di sinovite da tubercolosi, tubercolosi dei linfonodi, meningite da tubercolosi, sieropositività da tubercolosi.

Alcuni indicatori biochimici a causa della loro non specificità sono determinati solo in fluidi biologici, vicini al fuoco della lesione. Misurare il livello degli indicatori in risposta all'iniezione sottocutanea o intradermica di tubercolina (di solito prima e 48 e 72 ore dopo). Dopo questo, il grado di incremento del livello del marker (in%) viene calcolato rispetto al livello iniziale.

Determinazione ottimale nelle urine dell'attività di un enzima organo-specifico della transamnidasi, la cui comparsa si nota nella sconfitta dei reni di varia natura. Lo studio della transamidinasi è giustificato solo in condizioni di iniezione sottocutanea di tubercolina allo scopo di esacerbare il processo infiammatorio locale. Determinare l'attività della transamidina nelle urine inizialmente e 24-72 ore dopo l'introduzione di 50 TE tubercolina. L'allargamento della fermentia in 2 volte e più consente nell'82% dei casi di differenziare la tubercolosi attiva dei reni da esacerbazione della pielonefrite cronica.

Con la tubercolosi degli organi genitali femminili, le concentrazioni di aptoglobina e dialdeide malonica nel sangue sono determinate in condizioni di un provocatorio test alla tubercolina. La tubercolina iniettata per via sottocutanea in una dose di 50 TE e 72 ore dopo ha eseguito un secondo studio biochimico. Nel caso dell'eziologia della tubercolosi, il grado di aumento del livello di aptoglobina non è inferiore al 28% e il livello di malondialdeide è pari o superiore al 39%. Viene anche utilizzata la determinazione dell'attività dell'adenosina deaminasi in un fluido peritoneale ottenuto dallo spazio di Douglas. Il punteggiato viene riesaminato 72 ore dopo l'iniezione intradermica di tubercolina a dosi di 0,1 TE e 0,01 TE nella proiezione degli organi genitali interni sulla parete addominale anteriore. A favore del processo di tubercolosi, un aumento dell'attività dell'adenosina deaminasi è del 10% o superiore rispetto a quello iniziale.

Quando l'occhio è interessato, viene esaminata la reazione focale che si verifica nell'occhio in risposta alla stimolazione antigenica. Non è auspicabile sviluppare una risposta pronunciata, accompagnata da una diminuzione delle funzioni visive. Poiché la valutazione delle reazioni focali minime è spesso difficile, per l'oggettivazione della conclusione si raccomanda di orientare in parallelo e sul grado di crescita nel siero del sangue di aptoglobina o adenosina deaminasi.

Tutti gli studi biochimici dovrebbero essere condotti insieme ad altri metodi.

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Ricerca sul sistema di coagulazione del sangue

Importanza dello stato di ricerca del sistema di coagulazione del sangue della tubercolosi è causata dalla presenza di un numero di pazienti con broncopneumopatia emottisi tubercolosi o emorragia polmonare, così come le complicanze emocoagulativi nel trattamento chirurgico della tubercolosi. Inoltre, naturalmente legati TB latente che scorre emocoagulativi intravascolare influenza il decorso della malattia e l'efficacia della chemioterapia.

Nei pazienti con tubercolosi polmonare con predominanza del componente essudativo dell'infiammazione, si osserva una diminuzione dell'attività del sangue anticoagulante. Nei pazienti con una bassa prevalenza di una lesione specifica nei polmoni con predominanza della componente produttiva dell'infiammazione, l'emocoagulazione intravascolare non è significativamente espressa. In pazienti con tubercolosi polmonare con emottisi e sistema di coagulazione stato emorragia polmonare è diverso: in pazienti con bassa perdita di sangue al gemoptoe altezza o immediatamente dopo la sua fine c'è un forte aumento nella capacità di coagulazione del sangue dovuta a grave intensificazione trombinoobrazovaniya mantenendo aumento della coagulazione "strutturale". Nei pazienti con una massiccia perdita di sangue, si osserva una diminuzione del potenziale di coagulazione a causa di una diminuzione della concentrazione di fibrinogeno. Attività del fattore XIII, conta piastrinica. Nella fase del trattamento chirurgico, i pazienti con forme limitate di tubercolosi non manifestano lievi disturbi significativi con il sistema omeostatico. Nei pazienti con processi avanzati nell'esecuzione di pneumon o pleuropneumonectomia, si sviluppa spesso una sindrome di ICD che può acquisire le forme di una "seconda malattia".

Per monitorare lo stato della coagulazione del sangue in pazienti con tubercolosi polmonare deve essere effettuata la determinazione del tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT), fibrinogeno, tempo di trombina, indice di protrombina e tempo di sanguinamento e il tempo di coagulazione.

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Ricerca ormonale

Le moderne osservazioni sperimentali e cliniche indicano la presenza di cambiamenti nello stato ormonale in una specifica infiammazione polmonare tubercolare. E 'dimostrato che la correzione delle disfunzioni dei sistemi ipofisari tiroide-ipofisi-surrene e funzione pancreatica in combinazione con la terapia anti-TB contribuiscono all'attivazione di fibrogenesi e riparazione ad un'infiammazione specifico locus.

Lo stato funzionale del sistema ipofisi-tiroide è giudicato dal contenuto nel siero del sangue di triiodotironina (T ₃ ), tiroxina (T ₄ ), pituitaria ormone stimolante la tiroide (TSH). Si è constatato che ipotiroidismo subclinico viene rilevato nel 38-45% dei pazienti con tubercolosi polmonare, e il più delle volte viene diagnosticato con diffusi e fibro-cavernoso processo forme. In queste stesse forme più drasticamente ridotti livelli sia T ₃ e T ₄, e arriva uno squilibrio di questi ormoni in forma di aumentare il rapporto di T ₄ / T _s.

La funzione della corteccia surrenale è valutata dal livello di cortisolo nel siero del sangue e dalla funzione incrementale del pancreas dalla concentrazione dell'insulina immunoreattiva. Nella fase acuta della malattia infettiva, aumenta la necessità di aumentare il cortisolo e l'insulina endogena. L'iperinsulinemia testimonia anche l'insulino-resistenza dei tessuti corporei, che è tipica di qualsiasi processo infiammatorio attivo, in particolare, specifico. La determinazione della funzione glucocorticoide delle ghiandole surrenali con tubercolosi polmonare attiva consente di rivelare la presenza di ipercorticismo nella maggior parte dei pazienti. I livelli normali di concentrazione ematica cortisolo nel paziente con infiammazione infettiva nel periodo acuto dovrebbero essere considerati come relativo fallimento di funzione glucocorticoidi della corteccia surrenale che può servire come base per lo svolgimento di dosi terapia sostitutiva adeguata di glucocorticoidi.

Quasi un terzo dei pazienti con tubercolosi polmonare può stabilire che il livello di insulinemia in essi contenuto è piuttosto basso e si avvicina al limite inferiore della norma, mentre il 13-20% osserva un iperinsulinismo significativo. Sia l'ipo- sia l'iperinsulinismo sono fattori ad alto rischio per lo sviluppo di violazioni del metabolismo dei carboidrati a vari livelli. Questi cambiamenti nell'attività funzionale delle cellule B del pancreas richiedono un monitoraggio regolare della glicemia nei pazienti con tubercolosi e la prevenzione tempestiva del diabete mellito. Inoltre. Questo serve come ulteriore giustificazione per la convenienza dell'uso di dosi fisiologiche di insulina nella complessa terapia della tubercolosi.

In generale, più bassi livelli di ormoni tiroidei e la loro ipercortisolemia squilibrio e iperinsulinismo grande portata in pazienti con grave corso del processo tubercolare, con ingenti danni ai polmoni e gravi sintomi di tubercolosi intossicazione.

Diagnosi microbiologica della tubercolosi

Gli studi microbiologici sono necessari per identificare i pazienti con tubercolosi, verificare la diagnosi, monitorare e correggere la chemioterapia, valutare gli esiti del trattamento, in altre parole, dal momento in cui il paziente è stato registrato con la tubercolosi prima di rimuoverlo.

Tutti i programmi e i progetti epidemiologici si basano su una valutazione del numero di escreti batterici, che non può essere eseguita senza l'utilizzo di metodi di laboratorio per rilevare la tubercolosi da micobatteri. In un sondaggio sulla cosiddetta popolazione non organizzata, la percentuale di invasori batterici raggiunge 70 o più, il che rende i metodi di laboratorio un mezzo sufficientemente efficace per identificare i pazienti tubercolotici in questo gruppo di popolazione.

I metodi microbiologici tradizionali per la diagnosi della tubercolosi sono gli studi batterioscopici e culturali. I metodi moderni considerano la coltivazione del micobatterio tubercolosi in sistemi automatizzati, l'impostazione della PCR. Tuttavia, tutti questi metodi si combinano necessariamente con i metodi batteriologici classici.

Raccolta di materiale diagnostico

L'efficacia degli studi di laboratorio dipende in larga misura dalla qualità del materiale diagnostico. Il rispetto delle regole per la raccolta, la conservazione e il trasporto di materiale diagnostico e l'esatta implementazione dell'algoritmo di valutazione del paziente influiscono direttamente sul risultato e garantiscono la sicurezza biologica.

Per i test sulla tubercolosi, viene utilizzata una varietà di materiali. A causa del fatto che la tubercolosi logkih- forma più comune di lesioni tubercolari, il materiale di base per la ricerca considera di espettorato e altri tipi di tracheobronchiale staccabile: le secrezioni delle vie respiratorie superiori ottenuti dopo l'inalazione di aerosol: lavaggi bronchiali; risciacqui broncoalveolari; materiale ottenuto mediante broncoscopia, biopsia transtracheale e intrapolmonare: aspirazione da bronchi, colpi laringei, essudati, macchie da ferite, ecc.

L'efficacia della ricerca aumenta se viene eseguita una raccolta controllata di materiale da un paziente. A tal fine, viene assegnata una sala appositamente attrezzata o vengono acquistate cabine speciali. La raccolta di materiale è una procedura pericolosa, quindi è necessario raccogliere materiale per la ricerca, osservando le regole della sicurezza infettiva.

Il materiale per il test sulla tubercolosi del micobatterio viene raccolto in flaconi sterili con tappi a chiusura ermetica per impedire la contaminazione dell'ambiente e proteggere il materiale raccolto dalla contaminazione.

Le fiale per la raccolta del materiale diagnostico devono soddisfare i seguenti requisiti:

• deve essere realizzato in materiale resistente agli urti;
• dovrebbe sciogliersi facilmente durante la sterilizzazione in autoclave;
• avere un volume sufficiente (40-50 ml):
• avere un'ampia apertura per la raccolta dell'espettorato (diametro non inferiore a 30 mm);
• essere facile da maneggiare, trasparente o traslucido, in modo da poter valutare la quantità e la qualità del campione raccolto senza aprire il coperchio.

Per ottenere risultati di ricerca ottimali, è necessario osservare le seguenti condizioni:

• Raccogliere il materiale prima dell'inizio della chemioterapia;
• il materiale per lo studio deve essere raccolto prima dell'assunzione mattutina di cibo e medicine;
• per ricerca è desiderabile raccogliere almeno 3 campioni di flemma di mattina. Raccogliere l'espettorato per 3 giorni consecutivi;
• il materiale raccolto deve essere consegnato al laboratorio il prima possibile:
• nel caso in cui sia immediatamente impossibile consegnare il materiale al laboratorio, esso viene conservato in frigorifero ad una temperatura dell'aria di 4 ° C per non più di 48 ore;
• Durante il trasporto del materiale, è necessario monitorare attentamente l'integrità delle fiale.

L'espettorato correttamente raccolto è mucoso o mucopurulento. Il volume ottimale dell'espettorato testato è 3-5 ml.

L'espettorato viene raccolto sotto la supervisione di un medico. Le persone responsabili della raccolta dell'espettorato dovrebbero seguire l'implementazione di alcune regole:

• è necessario spiegare al paziente lo scopo dello studio e la necessità di tossire non con muco nasofaringeo o saliva, ma con il contenuto del tratto respiratorio profondo. Questo può essere ottenuto a seguito di una tosse produttiva che si verifica dopo diversi (2-3) respiri profondi. È anche necessario avvertire il paziente che dovrebbe sciacquarsi la bocca con acqua bollita, per rimuovere la parte principale della microflora che cresce nella cavità orale e i residui di cibo che impediscono l'esame dell'espettorato;
• un medico che partecipa alla raccolta dell'espettorato, oltre a un accappatoio e un cappello, deve indossare una maschera, guanti di gomma e un grembiule di gomma;
• in piedi dietro il paziente, si raccomanda di tenere il flacone il più vicino possibile alle sue labbra e di separare immediatamente in esso la flemma mentre tossisce, e deve essere previsto che il flusso d'aria sia diretto lontano dall'operatore sanitario:
• Al termine della raccolta dell'espettorato, l'operatore sanitario deve chiudere accuratamente la fiala con un coperchio e valutare la quantità e la qualità dell'espettorato raccolto. Quindi il flacone viene etichettato e inserito in uno speciale bix per il trasporto al laboratorio.

Se il paziente non produce catarro, la sera prima e la mattina presto il giorno della raccolta del materiale necessario per dargli un espettorante :. Un estratto di radice di marshmallow (mukaltin), bromexina, ambroxolo, ecc - o applicare un inalazione irritante utilizzando apparecchiature installate nella stanza per raccogliere espettorato. Il materiale raccolto in questo modo non è soggetto a conservazione e dovrebbe essere esaminato il giorno della raccolta. Evitare il suo "abbattimento" in laboratorio nella direzione dovrebbe fare un segno speciale.

Se non vengono effettuati studi microbiologici presso questa struttura, il materiale diagnostico raccolto deve essere consegnato centralmente al laboratorio, a condizione che il materiale sia conservato nell'intervallo tra le consegne in frigorifero o con l'uso di conservanti. Consegnare il materiale al laboratorio in scatole di trasporto, che possono essere facilmente disinfettate. Ogni campione deve essere fornito con l'etichetta appropriata e l'intero lotto deve essere compilato con un modulo di accompagnamento.

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Modalità e frequenza dell'esame dei pazienti

All'inizio, cosiddetto diagnostico, esame del paziente per tubercolosi, è necessario esaminare almeno 3 porzioni di espettorato per 2 o 3 giorni. Raccolti sotto la supervisione di personale medico, che aumenta l'efficacia della microscopia.

Lo screening primario per la tubercolosi dovrebbe essere effettuato da tutte le istituzioni diagnostiche mediche del sistema sanitario. Recentemente, i cosiddetti centri di microscopia, dotati di moderni microscopi e attrezzature per la sicurezza epidemica, sono stati organizzati sulla base di laboratori diagnostici clinici per migliorare l'efficienza dell'esame iniziale.

Nelle strutture anti-TB, viene utilizzato un test di screening che include l'esame dell'espettorato o altro materiale diagnostico per almeno 3 volte per 3 giorni. Durante il trattamento, gli studi microbiologici vengono eseguiti regolarmente almeno una volta al mese durante la fase di chemioterapia intensiva. Al passaggio alla fase di trattamento, gli studi sono condotti meno frequentemente - con un intervallo di 2-3 mesi, mentre la frequenza dello studio è ridotta a due.

Caratteristiche della collezione di materiale diagnostico per la tubercolosi extrapolmonare

Caratteristica materiale patologico con forme extrapolmonari di TBC - Mycobacterium tuberculosis bassa concentrazione in esso, che richiede una metodi più sensibili studi microbiologici, principalmente sulle tecniche di semina medie.

Con la tubercolosi del sistema genito-urinario, l'urina è il materiale di studio più accessibile. La raccolta delle urine deve essere effettuata da un'infermiera appositamente addestrata.

I genitali esterni vengono lavati con acqua con sapone o una soluzione debole di permanganato di potassio. L'apertura esterna dell'uretra viene attentamente trattata. In una fiala sterile viene raccolta una porzione media dell'urina del mattino: negli uomini, naturalmente, nelle donne, usando un catetere. L'urina della pelvi renale viene raccolta in provette sterili con cateterizzazione di uno o due reni, in quest'ultimo caso - necessariamente separatamente da ciascun rene. Una piccola quantità di questa urina viene centrifugata, il sedimento viene esaminato.

Negli uomini, spermatozoi, testicoli puntati, il segreto della prostata viene sottoposto a centrifugazione per ottenere un precipitato. Con qualsiasi localizzazione di un processo specifico nell'area genitale negli uomini, il massaggio prostatico può promuovere la secrezione di secrezioni contenenti micobatterio tubercolosi.

Il sangue mestruale nelle donne viene raccolto succhiando o usando un berretto Kafka. Il materiale ottenuto viene liberato dai globuli rossi, lavato con acqua distillata seguita da centrifugazione. Il precipitato viene esaminato.

Le allocazioni dal canale cervicale dell'utero sono raccolte in alcune capacità di Kafka o cap, cioè, è desiderabile accumulare 1-2 ml di materiale patologico.

Materiale ottenuto da interventi chirurgici sui reni, genitali. Con biopsie, raschiature dall'endometrio, omogeneizzare. Per fare ciò, viene messo in un mortaio sterile e completamente schiacciato con forbici sterili. A questa sospensione è stata aggiunta sterile sabbia di fiume in una quantità pari al suo peso, e poi riempito con 0,5-1.0 ml soluzione isotonica di cloruro di sodio, e tutto è stato triturato fino ad una massa pastosa con l'aggiunta di soluzione di cloruro di sodio isotonica (4-5 ml). Quindi la massa viene lasciata sedimentare per 1-1,5 minuti, il surnatante viene esaminato.

Tubercolosi delle ossa e delle articolazioni. Il puntale (pus di ascessi) ottenuto con una siringa sterile viene posto in piatti sterili e immediatamente consegnato al laboratorio. Pipetta sterile, precedentemente inumidita con soluzione isotonica di cloruro di sodio sterile, prendere 2-5 ml di pus, trasferirla in una bottiglia di perle e aggiungere altri 2-3 ml di soluzione di cloruro di sodio isotonico. La bottiglia viene chiusa con un tappo di sughero e scossa in un apparato di burlone per 8-10 minuti. La sospensione omogeneizzata viene esaminata.

Nelle forme fistolose della tubercolosi osteoarticolare, viene preso il pus dalla fistola. Lo scarico abbondante viene raccolto direttamente in una provetta. In caso di scarsa escrezione di pus, la fistola viene lavata con una soluzione isotonica di sodio cloruro sterile, e l'acqua di lavaggio raccolta in una provetta o un pezzo di un tampone impregnato di pus viene inviata allo studio.

Il materiale chirurgico ottenuto durante interventi chirurgici su ossa e articolazioni può essere costituito da masse, granulazioni, tessuto cicatriziale, tessuto osseo, tessuto sinoviale della membrana e altri substrati purulento-necrotici. Il suo trattamento viene eseguito, come nella tubercolosi dei reni.

L'esame microbiologico del liquido sinoviale in una soluzione al 3% di sodio citrato (rapporto 1: 1) per prevenire la coagulazione viene eseguito immediatamente dopo la puntura.

Tubercolosi dei linfonodi. Viene esaminato anche il pus, estratto durante la puntura dei linfonodi. Come pus degli ascessi. I tessuti dei linfonodi ottenuti durante interventi chirurgici, le biopsie, vengono esaminati, come con altre forme di tubercolosi.

Lo studio delle masse delle feci sulla tubercolosi del micobatterio è estremamente raro, a causa della quasi totale assenza di risultati positivi.

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Microscopia del micobatterio

La microscopia dell'espettorato è un metodo relativamente veloce, semplice e poco costoso che dovrebbe essere usato in tutti i casi con sospetta tubercolosi. Inoltre, questo studio è condotto per valutare l'efficacia della chemioterapia e per accertare il recupero o il fallimento del trattamento in assenza di test di coltura.

Vengono utilizzati due metodi di esame microscopico:

• metodo di microscopia diretta, quando uno striscio viene preparato direttamente dal materiale diagnostico;
• metodo di microscopia di un sedimento preparato da materiale trattato con decontaminante per coltura.

Il primo metodo è utilizzato in quei laboratori in cui vengono effettuati solo studi microscopici (laboratori clinici e diagnostici della rete medica generale).

I migliori risultati dell'esame microscopico si ottengono concentrando il materiale diagnostico (ad esempio mediante centrifugazione).

Per rilevare il micobatterio tubercolosi con una probabilità del 50% quando si esegue la microscopia, 1 ml di espettorato dovrebbe contenere più di 5000 cellule microbiche. L'espettorato di pazienti con forme polmonari di tubercolosi di solito contiene una quantità significativa di batteri acido-veloci, che consente loro di essere rilevati in modo affidabile mediante batterioscopia. La sensibilità diagnostica di questo metodo può essere migliorata esaminando diversi campioni di espettorato da un paziente. Un risultato negativo di un esame batterioscopico non esclude la diagnosi di tubercolosi, in quanto l'espettorato di alcuni pazienti contiene meno micobatteri di quanti possono essere rilevati con la microscopia. Una scarsa preparazione dello striscio di espettorato può anche causare un risultato negativo di un esame batterioscopico.

Il metodo più comune per il rilevamento dei micobatteri acido-resistenti nello striscio è il colore secondo Tsiol-Nelsen. Il metodo si basa sulla penetrazione di fucsina carbolica in una cellula microbica attraverso una membrana che include uno strato ceroso-lipidico, riscaldando contemporaneamente e con una forte azione di incisione del fenolo. La successiva decolorazione dello striscio con una soluzione al 25% di acido solforico o acido cloridrico al 3% porta a una decolorazione di tutte le strutture non acide. Gli elementi scoloriti dello striscio sono colorati con una soluzione allo 0,3% di blu di metilene. I micobatteri non percepiscono i soliti coloranti all'anilina, a causa dei quali i micobatteri acido-resistenti sono macchiati di rosso cremisi e altri microbi ed elementi cellulari - in blu.

Per strisci colorati con Ziehl-Nelsenu utilizzare microscopio binoculare luce con lente immersione in olio (aumento o 90- 100 volte) e l'oculare di ingrandimento 7 o 10 volte. Esplora 100 campi visivi, sufficienti a identificare i singoli micobatteri nello striscio. Nel caso in cui il risultato di tale studio sia negativo, per conferma si consiglia di visualizzare altri 200 campi visivi. Registrare i risultati, indicando il numero di bacilli acido-veloci rilevati (KUM).

Oltre a questa tecnica, i fluorocromi a colori vengono utilizzati per la microscopia luminescente, che consente di ottenere i migliori risultati. L'uso di questo metodo aumenta l'efficienza della microscopia del 10-15%. Quando si trattano i micobatteri con coloranti luminescenti (auramina, rodamina, ecc.), Queste sostanze si legano anche alle strutture a forma di cera della cellula microbica. Quando irradiano le cellule colorate con un'eccitante fonte di luce (un certo spettro di radiazioni ultraviolette), iniziano a brillare con luce arancione o rossa brillante su uno sfondo nero o verde scuro. A causa dell'elevata luminosità e contrasto dell'immagine visibile, l'ingrandimento complessivo del microscopio può essere ridotto 4-10 volte, il campo visivo si allarga e il tempo di visualizzazione della preparazione diminuisce. Oltre a ciò, grazie alla maggiore profondità di campo, è possibile aumentare il comfort dello studio.

Quando si utilizza la microscopia a fluorescenza per visualizzare la stessa area, lo striscio impiega molto meno tempo rispetto alla microscopia ottica della colorazione Tsiol-Nelsen. Se per un giorno lavorativo un microscopio esamina circa 20-25 tali strisci, quindi con l'aiuto della microscopia a fluorescenza, può esaminare più di 60-80 campioni allo stesso tempo. I microscopisti esperti sanno che la colorazione delle cellule con una miscela di auramina e rodamina è in qualche modo specifica per i bacilli acido-resistenti, che in questo caso sembrano bastoncini d'oro. I saprofiti sono dipinti in un colore verdastro.

Un altro importante vantaggio del metodo di microscopia a fluorescenza - la capacità di rilevare mycobacterium alterata, perso sotto l'influenza di fattori negativi, tra cui chemioterapia intensiva, immobili kislotousotoychivosti e non viene rilevato in relazione a questa colorazione Ziehl-Nelsenu.

Gli svantaggi del metodo della microscopia a fluorescenza comprendono il costo relativamente elevato del microscopio e il suo funzionamento. Tuttavia, in laboratori centralizzati o in altri grandi laboratori, dove il carico supera la norma di 3 tecnici di laboratorio che lavorano con tre microscopi convenzionali, è più economico utilizzare un microscopio a fluorescenza.

I metodi batterioscopici hanno una specificità piuttosto elevata (89-100%). Circa il 97% dei risultati positivi ottenuti con qualsiasi metodo di microscopia sono confermati inequivocabilmente dai risultati della semina.

Va notato che quando l'esame microscopico dello striscio di materiale patologico, è impossibile determinare la specie appartenente al micobatterio acido-veloce identificato. Metodo microscopia permette di dare un giudizio solo sulla presenza o assenza di acido nella preparazione di microrganismi, che può essere spiegato con la presenza in natura di un gran numero di morfologicamente simile a microrganismi tubercolari micobatteri complessi acidi nontubercular resistenti.

I risultati della microscopia sono valutati in unità semiquantitative.

Per poter confrontare i risultati dei vari metodi di microscopia, coefficienti empirici vengono somministrati. Ad esempio, per confrontare i risultati di strisci colorati con coloranti fluorescenti, la luce di ricerca dati microscopio (1000 ingrandimenti), è necessario dividere il numero di bacilli acido-resistenti rilevata dal microscopio a fluorescenza, il coefficiente corrispondente con un ingrandimento di 250 volte - a 10, 450 volte - a 4, con 630 volte - a 2.

Caratteristiche della microscopia per la tubercolosi extrapolmonare

Viene eseguita la microscopia diretta, così come la microscopia degli strisci preparati dopo l'arricchimento, seguita dalla colorazione Tsiol-Nelsen o dai coloranti luminescenti. La microscopia diretta degli strisci è inefficace a causa di una bassa concentrazione di micobatteri nel materiale, e quindi è più razionale usare metodi di arricchimento. La più efficace è la centrifugazione. Se il materiale biologico è viscoso, centrifugazione viene applicato con liquefazione simultanea e omogeneizzazione del materiale, che viene effettuata con centrifughe ad alta velocità con la forza centrifuga di 3000 g e ipoclorito soluzioni. Altri metodi di arricchimento, come la micro flottazione, non sono attualmente utilizzati a causa della formazione di aerosol biologicamente pericolosi.

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Il metodo culturale di diagnosi di tubercolosi

Il metodo di semina, o metodo di coltura, è più sensibile della microscopia a smear e presenta numerosi vantaggi rispetto a quest'ultimo. Permette di rilevare diverse dozzine di micobatteri vitali nel materiale di prova e ha un grande valore diagnostico. Ciò è particolarmente importante quando si esamina il materiale da pazienti di nuova diagnosi o trattati che rilasciano una piccola quantità di micobatteri.

Rispetto alla microscopia, la ricerca sulla coltura consente di aumentare il numero di pazienti con TBC diagnosticati di oltre il 15-25%, oltre a verificare la tubercolosi nelle fasi precedenti, quando la malattia è ancora suscettibile di trattamento. Un vantaggio molto importante del test di coltura è la possibilità di ottenere una coltura dell'eccitatore che può essere identificata e studiata in relazione alla sensibilità al farmaco, alla virulenza e ad altre proprietà biologiche.

Gli svantaggi dei metodi di coltivazione includono la loro durata (il tempo di attesa dei materiali raggiunge 10 settimane). Costo più elevato, complessità dell'elaborazione del materiale diagnostico.

Principi di presunzione del trattamento del materiale diagnostico

I metodi microbiologici convenzionali non possono essere utilizzati nella conduzione di studi sulla tubercolosi. Questo è dovuto al fatto. Che il micobatterio tubercolosi cresce molto lentamente e la maggior parte dei campioni clinici contiene microrganismi pirogeni e putrefatti a crescita rapida, funghi. La loro rapida crescita su ricchi terreni nutrienti interferisce con lo sviluppo dei micobatteri e non consente di isolare l'agente causale della tubercolosi, quindi il materiale diagnostico deve essere pretrattato prima della semina. Inoltre, i micobatteri rilasciati dalle vie aeree del paziente sono solitamente circondati da una grande quantità di muco, rendendo difficile concentrarli. A questo proposito, prima di piantare l'espettorato e altri materiali simili, la loro liquefazione, è necessaria la decontaminazione.

Tutti i detergenti e i decontaminici hanno un effetto tossico più o meno pronunciato sui micobatteri. Come risultato dell'elaborazione, fino al 90% dei micobatteri può morire. Per mantenere abbastanza della popolazione micobatterica, risparmiando la necessità di utilizzare tecniche di lavorazione che consentono, da un lato, di sopprimere la rapida crescita di batteri piogeni e putrida, e dall'altro - per preservare la vitalità dei micobatteri presenti nel materiale.

A seconda del materiale, il suo grado di omogeneità e di inquinamento per la pre-elaborazione utilizzando vari decontaminante: espettorato - 4% soluzione di idrossido di sodio, soluzioni trohzameschonnogo fosfato di sodio al 10%, cloruro di benzalconio, fosfato trisodico, NALC-NaOH (N-acetil-L-cisteina idrossido di sodio) ad una concentrazione finale di 1% NaOH, nelle urine e altri materiali liquidi - soluzione di acido solforico al 3%, per i campioni contaminati, materiali contenenti grassi - soluzione di acido ossalico al 5%. Inoltre, in alcuni casi, di utilizzare enzimi, composti attivi in superficie (tensioattivi). Applicazione detergenti Tween e qualche altra morte micobatteri è accompagnato da meno cellule (40-50% sopravvive). Tuttavia, possono essere utilizzati solo per materiali liquidi. La più grande distribuzione al mondo era NALC-NaOH. Prodotto in serie. Questo metodo permette di allocare più del 85% della popolazione di cellule micobatteri. Decontaminazione tkanesoderzhaschih solidi più difficile da indovinare perché il grado di dispersione del materiale durante l'omogeneizzazione difficile. Ad esempio, le biopsie di trattamento dei linfonodi è spesso accompagnata da un aumento della frequenza di contaminazione con la flora estranei. In questo caso, si può usare l'1% di etonio.

Il materiale non omogeneo è omogeneizzato con perle di vetro in presenza di decontaminanti. I materiali liquidi sono pre-centrifugati e viene trattato solo un precipitato.

Tecniche di semina e di incubazione

Dopo il pretrattamento, il materiale viene centrifugato, facendo precipitare i micobatteri e aumentandone il contenuto nel sedimento ("arricchimento dei fanghi"). Il precipitato risultante viene neutralizzato e inoculato (inoculato) con mezzi nutrienti densi o provette con mezzi liquidi (semiliquidi). Dal resto del sedimento, vengono preparati i vetrini per l'esame microscopico. La tecnica di semina dovrebbe prevenire la contaminazione incrociata del materiale diagnostico.

Per un'interpretazione clinica affidabile dei risultati di uno studio microbiologico, è necessario osservare la seguente regola: gli studi microscopici e colturali devono essere eseguiti in parallelo dallo stesso campione del materiale diagnostico.

I tubi inoculati vengono posti in un termostato a 37 ^° C per 2 giorni in posizione orizzontale. Ciò garantisce un assorbimento più uniforme del materiale nel terreno di coltura. Dopo 2 giorni, i tubi vengono trasferiti in posizione verticale e sigillati ermeticamente con tappi in gomma o silicone per impedire l'essiccamento del materiale seminato.

Le colture vengono incubate a 37 ^su C per 10-12 settimane con regolare la visualizzazione settimanale. Per ogni anteprima, vengono registrati i seguenti parametri:

• il periodo visivamente osservato dal giorno della crescita della semina;
• tasso di crescita (numero di CFU);
• contaminazione della coltura da parte di una flora o funghi microbica estranei (tali provette vengono rimosse);
• mancanza di crescita visibile. Le provette vengono lasciate nel termostato fino alla successiva visione.

Supporti nutrienti

Per la coltivazione dei micobatteri vengono utilizzati vari mezzi nutritivi; denso, semi-liquido, liquido. Tuttavia, nessuno dei noti nutrienti ha proprietà che assicurano la crescita di tutte le cellule micobatteriche. In relazione a ciò, si raccomanda di utilizzare contemporaneamente 2-3 sostanze nutritive di diversa composizione per aumentarne l'efficacia.

L'OMS raccomanda l'ambiente Levenstein-Jensen come mezzo standard per l'isolamento primario dell'agente eziologico della tubercolosi e per determinare la sua sensibilità al farmaco. Questo è un ambiente uovo denso sul quale si ottiene la crescita dei micobatteri il 20-25 ° giorno dopo aver seminato un materiale batterioscopicamente positivo. Le colture di materiale batterioscopicamente negativo richiedono un periodo di incubazione più lungo (fino a 10-12 settimane).

Nel nostro paese, la proposta di E.R. Finn uovo ambiente Finn-II. Differisce dal fatto che, invece di L-asparagina, usa il glutammato di sodio, che innesca altri modi di sintetizzare gli amminoacidi dei micobatteri. La crescita appare su questo terreno un po 'prima, e la frequenza di allocazione dei micobatteri è del 6-8% più alta rispetto al terreno di Lowenstein-Jensen.

Per migliorare l'efficacia della diagnosi batteriologica della tubercolosi extrapolmonare, è consigliabile includere i mezzi finn-II modificati nel complesso dei mezzi nutritivi. Per accelerare la crescita, un tioglicolato di sodio dello 0,05%, che riduce la concentrazione di ossigeno, viene aggiunto al terreno nutritivo Finn-II. Per proteggere l'enzima dai sistemi Mycobacterium prodotti tossici di perossidazione lipidica nel mezzo nutritivo Finn-II somministrata antiossidante α-tocoferolo acetato in una concentrazione di 0,001 mcg / ml. La semina del materiale diagnostico viene eseguita secondo una procedura standard.

Nei laboratori anti-tubercolosi della Russia vengono utilizzate altre modificazioni di mezzi nutrienti densi; proposto G.G. Mezzo nutriente mordoviano "Nuovo", sviluppato da V.A. Mezzi nutrienti ani- mici A-6 e A-9, ecc.

A causa del fatto che nel processo della chemioterapia è danni a vari sistemi metabolici di cellule microbiche, alcuni popolazione micobatterica perde la capacità di svilupparsi normalmente in mezzi nutrienti convenzionali e richiede osmoticamente bilanciata terreni di coltura (o semi-liquido).

Valutazione e registrazione dei risultati di semina di materiale diagnostico

Alcuni ceppi e specie di micobatteri crescono lentamente, la crescita può comparire anche entro il 90 ° giorno. Il numero di tali colture è ridotto, ma ciò consente di resistere alle colture in un termostato per 2,5-3 mesi.

Le colture virulente di micobatterio tubercolosi di solito crescono in ambienti densi di uova sotto forma di colonie di forma R di varie dimensioni e specie. Colonie secche, rugose, avorio, leggermente pigmentate. In altri media, la colonia di mycobacterium tuberculosis può essere più umida. Dopo un ciclo di chemioterapia o durante il trattamento, possono essere allocate colonie lisce con crescita umida (forme ad S).

Quando si isolano le colture, viene utilizzata una serie di studi speciali per distinguere la tubercolosi micobatterica da micobatteri non tubercolari e saprofiti resistenti agli acidi.

Una risposta positiva viene data dopo un esame microscopico obbligatorio dello striscio macchiato di Tsiol-Nelsen dalle colonie coltivate. Nel caso di crescita di micobatteri in strisci, si trovano bastoncini rossi brillanti che si trovano singolarmente o in gruppi che formano ammassi sotto forma di feltro o trecce. Nei giovani culture, specialmente isolati da un trattamento a lungo termine di pazienti con chemioterapia, micobatteri differire il polimorfismo espressa, fino alla presenza di asta a forma, insieme alle versioni brevi, quasi coccoide o allungati che assomigliano micelio.

Il tasso di crescita dei micobatteri è indicato dallo schema seguente: (+) - 1-20 cfu in vitro (scarsa escrezione batterica); (++) - 20-100 CFU in vitro (moderata escrezione batterica); (+++) -> 100 CFU in vitro (abbondante escrezione batterica). Nella diagnosi di laboratorio della tubercolosi, non è sufficiente rispondere se il micobatterio viene rilevato da uno o un altro metodo. Avere una comprensione dettagliata dell'estensione e della natura della popolazione micobatterica, della sua composizione e proprietà. Sono questi dati che ci permettono di interpretare correttamente lo stato del processo, pianificare le tattiche e correggere tempestivamente il trattamento.

Negli ultimi anni, per accelerare la crescita dei micobatteri, sono stati proposti terreni nutrienti su base agar con vari additivi per la crescita e l'uso di una speciale miscela di gas. Per ottenere la crescita di micobatteri su questi terreni, durante la coltivazione, viene creata un'atmosfera con un alto contenuto di anidride carbonica (4-7%). Per questo scopo vengono utilizzati speciali -incubatori di CO ₂. Tuttavia, i sistemi automatici più sviluppati per la coltivazione di micobatteri: MGIT-BACTEC-960 e MB / Bact.

Uno di questi sistemi - Sistema MGIT (crescita micobatteri tubo indica), che si riferisce allo sviluppo di alta tecnologia ed è inteso per una rapida diagnosi batteriologica di tubercolosi e Mycobacterium suscettibilità ai farmaci di prima linea, e di alcuni farmaci di seconda linea. MGIT si concentra sul suo utilizzo come parte del dispositivo VASTES-960. I microrganismi vengono coltivati in provette speciali con un mezzo nutriente liquido basato sul mezzo di Middlebrook-7H9 modificato. Per stimolare la crescita dei micobatteri e sopprimere la crescita della microflora estranea, vengono utilizzati MGIT Growth Supplement e una miscela di farmaci antibatterici PANTA.

La crescita dei microrganismi viene registrata otticamente. Si basa sulla fluorescenza che si verifica quando mi consumo di ossigeno micobatteriche durante la crescita. Ossigeno flyuorohromny colorante contenuto nel fondo di una speciale provette e coperto con uno strato di silicone. Riproduzione micobatteri porta ad una diminuzione della quantità di ossigeno nel tubo e ridurre la concentrazione che provoca un aumento della fluorescenza, che diventa visibile sotto irradiazione da tubi di luce ultravioletta e fotosensore registrato automaticamente elettrodomestico da incasso VASTES-960. L'intensità della luminescenza è registrata in unità di crescita (unità di crescita GU). I dati di crescita vengono registrati nel computer, dove possono essere salvati automaticamente. L'analisi al computer di curve di crescita in grado di fornire informazioni circa la presenza di una varietà di piscine Mycobacterium, tra cui nontubercular, e aiuta anche a valutare le proprietà di crescita dei micobatteri.

Come risultato dell'introduzione di tali sistemi, il tempo per la crescita dei micobatteri è diminuito significativamente, in media di 11 giorni su VASTES-960 e 19 giorni su MB / Bact rispetto a 33 giorni su un mezzo nutritivo denso standard. Va notato che questi sistemi richiedono personale altamente qualificato. La semina del materiale su supporto liquido è necessariamente accompagnata dalla semina sul terreno Levenstein-Jensen, che svolge il ruolo di duplicatore in quei casi in cui il micobatterio tubercolosi non dà origine ad altri mezzi.

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Determinazione della sensibilità ai farmaci dei micobatteri

La determinazione dello spettro e del grado di sensibilità dei micobatteri ai farmaci anti-tubercolari è di grande importanza clinica, così come per la valutazione epidemiologica della diffusione della tubercolosi con resistenza ai farmaci. Inoltre, il monitoraggio della resistenza ai farmaci consente di valutare l'efficacia del programma di tubercolosi nel suo complesso, essendo un indicatore integrale delle prestazioni di tutti i componenti delle attività anti-tubercolosi.

Molteplicità e tempistica della sensibilità ai farmaci:

• prima dell'inizio del trattamento una volta per determinare la strategia e le tattiche di trattamento:
• se isolati da colture malate di vari materiali (espettorato, liquido BAL, urine, essudati, liquori, ecc.), vengono esaminati tutti i ceppi isolati:
• alla fine della fase intensiva di trattamento in assenza di dinamiche cliniche e radiologiche:
• se è necessario modificare il regime di trattamento nei seguenti casi:
  • assenza di striscio di espettorato;
  • ri-isolamento della coltura dopo espettorato negativo allo striscio;
  • un drastico aumento del numero di CMU nel tampone dopo il declino iniziale. È noto che i ceppi di mycobacterium tuberculosis, che sono eterogenei in termini di sensibilità ai farmaci, sono isolati dal materiale di un paziente affetto da tubercolosi. La sensibilità dei ceppi ai farmaci anti-tubercolari può differire nello spettro di farmaci, grado, frequenza e frequenza di insorgenza di resistenza.

Il grado di resistenza ai farmaci di Mycobacterium tuberculosis è stato determinato secondo criteri stabiliti, che si concentrano sul significato clinico e la stabilità dipenderà dall'attività del farmaco anti-TB, la sua farmacocinetica, la concentrazione nella lesione. La dose terapeutica massima e così via.

La determinazione della sensibilità ai farmaci dei micobatteri è attualmente effettuata con metodi microbiologici:

• Concentrazioni assolute (metodo di diluizione su mezzi nutritivi densi o liquidi),
• proporzioni,
• coefficiente di resistenza.

Di solito, la resistenza si manifesta sotto forma di crescita visivamente osservata delle colonie del micobatterio tubercolare, ma esistono metodi che inducono la crescita nelle prime fasi della divisione cellulare dei micobatteri sotto forma di reazioni cromatiche. Questi metodi riducono il tempo di prova da 3-4 a 2 settimane.

Come unificata in Russia è stato esteso, raccomandato dal metodo di chemioterapia Comitato che delle concentrazioni assolute, che è da un punto di vista metodologico, è il più semplice, ma richiede alta precisione e standardizzazione delle procedure di laboratorio. DST costituito da una serie di tubi con un terreno nutritivo, i farmaci anti-TB modificati. L'insieme costituito da 2-3 tubi con diverse concentrazioni di ciascuno dei farmaci utilizzati, dai tubi di controllo senza farmaco per l'ambiente e una provetta contenente 1000 mcg / ml di sodio Sali tsilovokislogo o 500 ug / ml paranitrobenzoynoy nontubercular acido per rilevare la crescita dei micobatteri.

Per preparare una serie di supporti con preparazioni, viene utilizzato un mezzo Levenstein-Jensen modificato (senza amido), che viene versato in fiasche. In ciascuno dei flaconi, viene aggiunto un volume specifico di diluizione appropriata della preparazione antitubercolare. Il contenuto dei flaconi è accuratamente miscelato, versato in tubi e piegato in una posizione inclinata per 40 minuti ad una temperatura di 85 ° C. Si consiglia di avvolgere il mezzo in un riavvolgitore elettrico con controllo automatico della temperatura. Mercoledì con farmaci anti-TB

La serie 1-st può essere conservata in frigorifero a 2-4 ° C per 1 mese, con preparazioni della seconda fila - non più di 2 settimane. Lo stoccaggio di supporti con preparati a temperatura ambiente è inaccettabile. Quando si preparano soluzioni di farmaci anti-tubercolosi, viene presa in considerazione la loro attività, calcolando la concentrazione regolata per il peso molecolare della parte non specifica della preparazione, la purezza, ecc. Per determinare la sensibilità al farmaco, vengono utilizzate solo sostanze chimicamente pure.

Il principio del metodo è determinare la concentrazione di un farmaco antitubercolare che inibisce la crescita di una parte significativa della popolazione micobatterica. Se fatto correttamente, questo metodo ha una buona affidabilità.

Prima della prova, è necessario assicurarsi che la coltura isolata di mycobacterium tuberculosis non abbia microflora estranea. Dalla coltura di micobatteri in soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%, viene preparata una sospensione omogenea contenente 500 milioni di corpi microbici per ml (standard di torbidità ottica di 5 unità). La sospensione risultante viene diluita con soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% (1:10) e 0,2 mi di sospensione vengono aggiunti a ciascun tubo dell'insieme di terreni di coltura. Le provette inoculate sono state poste in un incubatore a 37 ° C e tenuti in posizione orizzontale per 2-3 giorni alla superficie inclinata del mezzo è stato uniformemente inoculato con una sospensione di Mycobacterium tuberculosis. I tubi vengono quindi trasferiti in posizione verticale e incubati per 3-4 settimane. I risultati sono registrati dopo 3-4 settimane.

Poiché il tempo di escrezione escretoria dal materiale clinico sui mezzi nutritivi è di almeno 1-1,5 mesi, i risultati della determinazione della sensibilità del farmaco con questo metodo possono essere ottenuti non prima di 2-2,5 mesi dopo la semina del materiale. Questo è uno dei principali inconvenienti del metodo.

Interpretare i risultati della determinazione della sensibilità ai farmaci dei micobatteri sulla base di determinati criteri. Su terreni di coltura solido è considerato sensibile alla concentrazione del farmaco che è contenuto nel mezzo, se il numero di colonie di micobatteri coltivate in vitro con questo farmaco non più del 20 è con la crescita abbondante nella provetta di controllo senza farmaci. Solo in presenza di più di 20 colonie la cultura è considerata resistente a questa concentrazione. In pratica, quando si ottengono risultati di crescita in provette vicine a 20 cfu. è necessario notificare all'unità clinica che la sensibilità o la resistenza in questo caso è al limite, poiché a volte può spiegare la dinamica sfocata degli indicatori clinici.

Per vari farmaci viene stabilita una certa concentrazione, alla quale si osserva la riproduzione della proporzione critica della popolazione micobatterica. Queste concentrazioni sono chiamate "critiche". Come criterio di stabilità, viene utilizzata la crescita della popolazione di micobatteri su un mezzo nutritivo con una preparazione in concentrazione critica.

Nella pratica della TB domestica, nel determinare la resistenza ai farmaci, non si limitano a determinare solo le concentrazioni critiche. Questo è dovuto al fatto. Che il livello definizione estesa di resistenza ai farmaci consente al medico di posizionare con maggiore precisione la chemioterapia tattiche utilizzando la conoscenza di potenziare l'azione di combinazioni di farmaci, attraversano resistenza prevista o per applicare un gruppo di farmaci più efficaci utilizzati farmaci anti-TB.

Il metodo di concentrazione assoluta è il più semplice, ma è anche il più sensibile agli errori commessi quando viene eseguito. Più affidabile, soprattutto nel determinare la sensibilità ai farmaci di seconda linea, e comune al di fuori della Russia è il metodo delle proporzioni. Prende in considerazione le carenze del metodo delle concentrazioni assolute, ma in esecuzione è più laborioso.

Il metodo è molto simile al metodo di concentrazione assoluta. La preparazione delle provette con farmaci viene effettuata allo stesso modo. Come nel metodo di concentrazione assoluto. Tuttavia, la dose di semi della sospensione di mycobacterium tuberculosis è ridotta di un fattore 10. Che elimina la frequenza della resistenza spontanea di alcuni ceppi di micobatterio tubercolare a tali farmaci come l'etambutolo, la protionamide, la capreomicina. Come controllo, vengono utilizzate 2 o 3 provette con una dose di seme uguale nelle provette, successivamente diluite 10 e 100 volte. Il criterio di stabilità è la percentuale di crescita visivamente osservata di micobatterio tubercolare. Per i farmaci della 1a serie, il criterio di stabilità è l'eccesso di crescita dell'1% della popolazione iniziale, per i farmaci della seconda fila - un aumento di 1 o più del 10% dell'iniziale, a seconda della concentrazione critica scelta.

Nel 1997, un gruppo di lavoro dell'OMS e dell'Unione Internazionale per l'individuazione delle buone tubercolosi resistenza tubercolosi farmaco si è adeguata a questi criteri, offrendo micobatteri resistenti considerato, che crescono su supporti uovo solido Lowenstein-Jensen alle seguenti concentrazioni:

• diidrostreptomicina - 4 μg / ml;
• isoniazide 0,2 μg / ml:
• rifampicina 40 μg / ml:
• Etambutolo: 2 μg / ml.

Nel 2001, sono state proposte concentrazioni critiche per i seguenti farmaci di seconda linea (per una percentuale critica dell'1%):

• capreomicina - 40 mcg / ml;
• protionamide - 40 mcg / ml;
• kanamicina - 30 μg / ml;
• viomicina - 30 mcg / ml;
• cicloserina 40 μg / ml;
• acido aminosalicilico - 0,5 μg / ml;
• ofloxacina - 2 μg / ml.

I risultati della crescita vengono valutati dopo 4 settimane preliminari e dopo 6 settimane di coltivazione - come ultimo.

Per determinare la sensibilità del farmaco alla pirazinamide, che è ampiamente utilizzata nella moderna chemioterapia per la tubercolosi, la concentrazione critica raccomandata è di 200 μg / ml. Tuttavia, v'è ancora un metodo generalmente accettato per determinare la resistenza a questo farmaco su terreno nutritivo solido a causa della sua attività antibatterica è esposto solo in ambiente acido (pH <6), che è tecnicamente difficile da mantenere. Inoltre, molte colture cliniche di tubercolosi da micobatteri crescono con riluttanza in ambienti di uova con un ambiente acido.

Per valutare la qualità dei risultati dei test di sensibilità farmaco di Mycobacterium, raccomanda che ogni nuovo lotto di terreno LJ controllare la determinazione parallelo della sensibilità del ceppo H37Rv museo standard. Inoltre, ci sono alcuni criteri microbiologici che devono essere mantenuti in modo che le tecniche diano un risultato ben riproducibile e correttamente interpretato. Questi includono la vitalità della coltura di Mycobacterium tuberculosis, le regole per ottenere una sospensione e sospensione omogenea culture di regole di selezione di Mycobacterium tuberculosis, la rappresentatività della massa batterica selezionata. L'affidabilità della determinazione della resistenza ai farmaci diminuisce con un rilascio batterico estremamente scarso.

Recentemente, un metodo per determinare la sensibilità del farmaco utilizzando sistemi automatici è stato considerato promettente. I più perfetti in quest'area sono gli sviluppi basati su VASTES MGIT-960. In questo caso, la sensibilità al farmaco del micobatterio tubercolosi è determinata sulla base di un metodo modificato di proporzioni. Nel processo di determinazione, viene confrontato il tasso di crescita del tubercolosi del micobatterio in una provetta di controllo e in provette con farmaci. Per determinare la sensibilità a streptomicina, isoniazide, rifamp-picina ed etambutolo, vengono utilizzati integratori di arricchimento e antibiotici inclusi nel kit SIRE. Per determinare la sensibilità alla pirazinamide, utilizzare il kit PZA. Nel corso di provette sospensione di prova Mycobacterium tuberculosis inoculato con farmaci, nonché le provette di controllo con sospensione ricostituita 100 volte per tutti i farmaci eccetto pirazinamide, in cui la sospensione è diluizione di 10 volte. Il criterio di stabilità è l'indicatore di crescita dei micobatteri di 100 GU quando si raggiunge la crescita nella provetta di controllo 400 GU (consultare "Metodi di coltura per isolare i micobatteri"). Contabilità e interpretazione dei risultati vengono eseguiti automaticamente e vengono impostati dall'input o dal programma selezionato.

Come concentrazioni critiche, le concentrazioni finali vengono utilizzate in una provetta con un mezzo nutriente liquido. Al momento sono state sviluppate concentrazioni critiche per i farmaci di prima linea e di seconda linea. Va notato che la sensibilità dei micobatteri della tubercolosi alla cicloserina e all'acido aminosalicilico è determinata solo sui terreni nutritivi delle uova.

Sistema descritto protocollo di lavoro elaborato consente di studiare la sensibilità ai farmaci come coltura dedicato (mezzo nutriente densa), e utilizzando il Mycobacterium MGIT crescita primaria in vitro. Quest'ultima opzione riduce significativamente il tempo per la cultura, che consente di ottenere i risultati completi della cultura del Mycobacterium tuberculosis (comprese le informazioni sulla sensibilità di droga) dopo 3 settimane dalla data di raccolta del materiale, mentre il metodo tradizionale è possibile ottenere solo il 3 ° mese. Col tempo, i risultati ottenuti, quando il paziente è in una fase intensiva di trattamento, possono compensare il costo relativamente elevato della ricerca.

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Differenziazione di micobatteri

Tenendo conto che i mezzi nutrienti utilizzati non sono strettamente selettivi. La successiva differenziazione dei micobatteri isolati è riconosciuta come obbligatoria. L'esigenza di differenziazione di micobatteri è dovuta ad una serie di caratteristiche dei processi patologici causati dal genere: corso diverso ed esito della tubercolosi e micobatteriosi, la presenza della resistenza ai farmaci naturale di alcuni farmaci anti-TB.

Si riconosce che l'identificazione primaria del complesso Mycobacterium tuberculosis M. Nontubercular da micobatteri viene eseguita dalle seguenti caratteristiche: la velocità di crescita su terreno solido nutrienti, pigmentazione, la morfologia delle colonie, la presenza di resistenza agli acidi e la temperatura di crescita ottimale.

Purtroppo, non esiste un metodo di laboratorio singolo distinzione affidabile M. Tuberculosis micobatteri complesso da altri bacilli acido-resistenti, tuttavia la combinazione delle caratteristiche sopra descritte con i risultati riportati di seguito di una serie di test biochimici permette l'identificazione del complesso Mycobacterium tuberculosis con M. Probabile 95%.

Per la differenziazione di Mycobacterium tuberculosis complesso M. (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii e altri) dal micobatteri a crescita lenta usato nontubercular test biochimici di base che rilevano la presenza dei seguenti sintomi:

• la capacità di produrre acido nicotinico (test di niacina):
• attività di nitrato riduttasi;
• catalasi termostabile;
• crescita su terreno con sodio salicilato (1 mg / ml).

Come test aggiuntivi, è possibile utilizzare anche la crescita su un terreno contenente 500 μg / ml di acido paranitrobenzoico o il 5% di cloruro di sodio.

Molti laboratori batteriologici identificano questi microrganismi solo a livello del complesso, a causa delle limitate capacità dei laboratori e delle capacità metodologiche degli specialisti.

Nella maggior parte dei casi, tuttavia, in pratica per differenziare M. Tuberculosis e M. Bovis è sufficiente i seguenti test: niacina, per la presenza di nitrato, la registrazione presenza e la crescita pirazinamidazy in terreno contenente 2 ug / ml idrazide di acido tiofene-2-carbossilico. Si tiene conto che i micobatteri del complesso M. Tuberculosis sono caratterizzati dal seguente insieme di caratteri:

• crescita lenta (più di 3 settimane);
• temperatura di crescita nell'intervallo 35-37 ^° C;
• assenza di pigmentazione (avorio);
• marcato colore acido-veloce;
• un test di niacina positivo;
• un test positivo sulla nitrato reduttasi;
• assenza di catalasi termostabile (68 ^° C).
• L'assenza di crescita su un mezzo Levenstein-Jensen contenente:
  • 1000 μg / ml di salicilato di sodio,
  • 500 μg / ml di acido paranitrobenzoico,
  • 5% di cloruro di sodio:
• crescita in presenza di 1-5 μg / ml di acido tiofene-2-carbossilico.

La rilevanza della differenziazione dei micobatteri isolati aumenterà notevolmente con l'aumento della frequenza di registrazione dei casi di HIV / AIDS associati alla tubercolosi o alla micobatteriosi. Al momento non esiste la certezza assoluta della disponibilità dei laboratori regionali pratici a eseguire correttamente questo volume di lavoro.

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Diagnosi immunologica della tubercolosi

Esistono numerosi fenomeni universali, farmaci e test immunologici originariamente trovati proprio con la tubercolosi o sul modello della risposta immunitaria ai micobatteri. Questi includono BCG tubercolina, un fenomeno come cutaneo DTH (tubercolina - Pirquet e Mantoux reazione), la reazione a sottocutanei tubercolina sensibilizzati animali (fenomeno Koch). Uno dei primi anticorpi nella malattia infettiva è stato anche rilevato nella tubercolosi. Naturalmente, più profonda è la comprensione dei meccanismi dell'immunità antitubercolare e del loro controllo genetico, più ampia può essere l'uso di metodi immunologici e farmaci che influenzano l'immunità per risolvere i problemi pratici della fisiologia.

Il problema pratico più importante e difficile è attualmente considerato il rilevamento della tubercolosi nel processo di screening di massa della popolazione. Tuttavia, nonostante le numerose segnalazioni di "successi" (su materiale limitato), non esiste un metodo immunologico adeguato (riproducibile in "qualsiasi arma") e un farmaco adatto a questo scopo.

I metodi immunologici, in particolare gli studi sierologici (determinazione di antigeni, anticorpi) e i test di stimolazione della tubercolina sono ampiamente utilizzati nella pratica clinica.

In primo luogo tra gli studi immunologici usati nella diagnosi differenziale, ci sono metodi sierologici - la determinazione di antigeni e anticorpi in diversi ambienti del corpo.

La specificità degli anticorpi contro la tubercolosi dei micobatteri dipende dagli antigeni utilizzati nel saggio immunologico. Viene proposta una quantità significativa di antigeni, il primo dei quali è la tubercolina PPD:

• PAP e altri preparati complessi dal liquido di coltura;
• disintegrazione ultrasonica;
• Estratto di tritone e altri preparati complessi di pareti cellulari;
• 5-antigene (Daniel);
• 60-antigene (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• cord-factor (trialosio-6,6-di-micollato);
• fenolici e altri glicolipidi;
• lipopolisaccaride;
• antigene legante la fibronectina;
• proteine (il più spesso ricombinanti); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA, ecc.

Come risultato di molti anni di ricerca da parte di scienziati russi e stranieri, sono stati rivelati i principali modelli di formazione di anticorpi e l'efficacia della diagnosi sierologica di tubercolosi: più è complesso l'antigene, maggiore è la sensibilità e la minore specificità dei test. La specificità varia da paese a paese a seconda dell'infezione della popolazione con M. Tuberculosis e micobatteri non tubercolari, dalla vaccinazione con BCG, ecc. Nei bambini, il valore informativo dei sierodiagnostici è inferiore rispetto agli adulti. Nella tubercolosi primaria (più spesso bambini), la definizione di IgM è più informativa. Con IgG secondario. Nei pazienti con infezione da HIV, il valore informativo della sierodiagnosi nel determinare gli anticorpi è ridotto. Determinazione dell'efficienza degli anticorpi dipende dal numero di "aspetti clinici": attività di processo (la presenza o l'assenza della presenza decadimento "isolamento" micobatteri della cavità, il grado di infiltrazione), la prevalenza del processo, la durata del suo flusso.

La sensibilità del metodo di saggio immunoenzimatico (ELISA) è di circa il 70%. L'insufficiente efficacia dello studio è dovuta alla sua bassa specificità. In precedenza, è stata considerata la possibilità di utilizzare lo screening sierologico in gruppi ad alto rischio, in particolare tra le persone con alterazioni post-tubercolari nei polmoni.

Per aumentare la specificità di ELISA, le ricerche di antigeni più specifici, compresi quelli ottenuti dall'ingegneria genetica: ESAT-6, ecc. (Vedi sopra) continuano. L'uso di antigeni strettamente specifici (38 kDa, ESAT) aumenta la specificità. Ma riduce significativamente la sensibilità dell'analisi. Insieme con IFA (sistemi di test di laboratorio sperimentale. Ad es kit ELISA Pathozyme) fornisce anche kit con filtrazione laterale immunocromatografico (Mycodot), così come altri test simili (dot-analisi sulla membrana) con una valutazione visiva del risultato del test. Durante questi test, l'analisi viene eseguita per 10-30 minuti; non richiedono attrezzature speciali, richiedono una valutazione visiva dei risultati, che è associata a una certa soggettività. Questi metodi hanno approssimativamente le stesse caratteristiche di sensibilità e specificità (70% e 90-93%, rispettivamente) dell'ELISA tradizionale.

L'uso di metodi di analisi immunitaria ha un valore definito come aggiuntivo, preso in considerazione nel complesso dei metodi usati, nella diagnosi differenziale della tubercolosi, specialmente nella diagnosi delle sue forme extrapolmonari. Il metodo ELISA più efficace è nella diagnosi della meningite da tubercolosi nello studio del liquido cerebrospinale. In questo caso, la sensibilità dell'analisi è dell'80-85% e la specificità è del 97-98%. Esistono dati sull'efficacia della rilevazione di anticorpi contro la tubercolosi da micobatteri nel liquido lacrimale nella diagnosi di uveite tubercolare.

Induzione della sintesi di interferone gamma in vitro

L'interferone gamma (IFN-γ) è un fattore specifico di difesa immunitaria realizzato attivando i sistemi enzimatici dei macrofagi. L'induzione della sintesi di IFN-γ da parte dei linfociti T sensibilizzati provoca la loro interazione con gli antigeni dei micobatteri.

Come antigeni usati come tubercolina PPD. E antigeni specifici ottenuti geneticamente ingegnerizzati, in particolare antigeni ESAT-6 (antigene secreto precoce con un peso molecolare di 6 kDa) e CFP-10 (una proteina del filtrato di coltura, 10 kDa). L'ingegneria genetica o gli antigeni ricombinanti sono assenti nelle cellule del vaccino BCG e di altri micobatteri. Quando si utilizza la tubercolina, i risultati del test di induzione IFN-γ sono paragonabili ai risultati del test cutaneo alla tubercolina (correlazione diretta). Quando si utilizzano antigeni geneticamente modificati, i risultati dei test sono più specifici e non dipendono dalla precedente vaccinazione BCG. Nel testare le persone vaccinate che non hanno avuto contatti con l'infezione da tubercolosi, la specificità del test è del 99%. La sensibilità del test tra i pazienti con tubercolosi varia dall'81 all'89%.

Test e strumenti diagnostici sono stati sviluppati basata sulla coltivazione breve termine di cellule o cellule mononucleate di sangue intero isolati dal sangue con antigeni di Mycobacterium tuberculosis in vitro con successiva determinazione della concentrazione di IFN-γ o contando il numero di linfociti T che sintetizzano IFN-γ. La concentrazione di interferone sintetizzato in una provetta viene determinata mediante ELISA utilizzando anticorpi monoclonali che legano IFN-γ. Quindi, calibrando lo standard IFN-γ, la sua concentrazione viene determinata nella provetta o nei pozzetti della piastra.

Eseguendo il test Elispot, il numero di linfociti T che sintetizzano IFN-γ. Sono contati sulla superficie di una piastra rivestita con anticorpi anti IFN-γ.

Gli sviluppatori di diagnosticum sulla base dell'induzione di IFN-γ in vitro, che è approvato dall'Agenzia statunitense per medicinali e prodotti, sostengono che è impossibile differenziare l'infezione da tubercolosi latente dalla tubercolosi attiva con l'aiuto del test. Pertanto, nelle regioni con un alto livello di infezione, il test non è direttamente diagnostico. Tuttavia, nel nostro paese può essere usato per differenziare l'infezione da tubercolosi nei bambini dall'allergia post-vaccinazione e per valutare il livello di immunità specifica nel processo di trattamento.

Attualmente è in fase di studio il sistema di test interno per determinare l'induzione della sintesi di IFN-γ da parte di specifici antigeni della tubercolosi in vitro.

Stato immunitario e decorso della tubercolosi, immunocorrection

Nel processo di trattamento della tubercolosi nell'uomo, ci sono cambiamenti nell'antigenemia e nello stato del sistema immunitario.

I dati sui cambiamenti di essudati e tessuti sono in gran parte contraddittori. L'unica cosa che può essere notata con buona ragione è che nei granulomi tubercolari, di regola, viene rilevato un numero significativo di linfociti T attivati.

È opportuno soffermarsi su due ulteriori disposizioni necessarie per comprendere il ruolo dei meccanismi immunologici nella cura della tubercolosi nell'uomo:

• I pazienti affetti da AIDS presentano un'incidenza particolarmente elevata di resistenza multipla ai farmaci;
• con più resistenza ai farmaci (e in assenza di infezione da HIV), i disturbi dell'immunità (in particolare il legame con le cellule T) sono particolarmente significativi.

Quando tubercolosi ampiamente diffusa vari metodi di immunomodulazione: è principalmente farmaci che agiscono principalmente sul immunità delle cellule T e un sistema di fagociti mononucleari (ormoni timici, isoforone, likopid, polioksidony et al.). Così come i micobatteri interi (attenuati) e i loro componenti.

Diagnosi molecolare-biologica della tubercolosi

Per i metodi di biologia molecolare nella diagnosi delle malattie infettive includono, principalmente, metodi basati sulla manipolazione con il materiale genomico di patogeni batterici e virali per identificare specifico materiale genetico - segmenti di DNA avente una sequenza nucleotidica specifica per un tipo o patogeno ceppi particolari di analizzare specifiche Sequenze di DNA in geni che determinano la sensibilità dell'agente patogeno a determinate sostanze medicinali e anche per l'analisi funzionale attività di determinati geni dell'agente patogeno. Tecniche biologiche molecolari erano ampiamente nella ricerca scientifica e l'applicazione pratica nella diagnosi e nel monitoraggio di varie infezioni batteriche e virali dopo l'apertura nel 1985, Carrie Myullisom (vincitore del premio Nobel. 1989) la reazione a catena della polimerasi.

Principi e possibilità del metodo di reazione a catena della polimerasi

La PCR consente di amplificare (moltiplicare) in vitro una sequenza nucleotidica (frammento di DNA del patogeno) per diverse ore in milioni di volte. La reazione in presenza di singole catene di DNA determina l'estrema sensibilità del test.

La sequenza nucleotidica di alcune regioni nella catena del DNA determina l'identità genetica del microrganismo, che spiega l'alta specificità della PCR.

Il valore di questa tecnica per l'individuazione e l'esame delle caratteristiche causate da Mycobacterium tuberculosis caratteristiche biologiche di un microrganismo avente crescita molto lenta: tempo di Mycobacterium tuberculosis DNA raddoppio quando la coltura è 12-24 ore.

Il principio del metodo PCR consiste nell'amplificazione - multipla, milioni di volte. Moltiplicando le sezioni di una specifica sequenza di DNA in un microvolume a tubo durante una ricorrenza ciclica delle seguenti tre fasi di reazione, ciascuna delle quali passa in un diverso regime di temperatura:

• Stadio I - denaturazione del DNA a doppio filamento al riscaldamento con una divergenza delle sue catene;
• II stadio - legame complementare (ibridazione) di primer (priming oligonucleotidi) con sezioni terminali di catene strettamente specifiche, scelte per la moltiplicazione del frammento di DNA;
• Stadio III - completamento della catena del frammento di DNA con l'aiuto di una DNA polimerasi termostabile.

Per l'amplificazione in vitro, devono esserci molecole di DNA matrice. Quattro tipi di deossinucleoside trifosfati (nucleotidi) contenenti le corrispondenti basi azotate: adenina (A), timina (T), guanina (D), citosina (C); oligonucleotidi di innesco sintetizzati artificialmente (primer) costituiti da 18-20 paia di basi; termostabile enzima DNA polimerasi avente una temperatura ottimale di 68-72 ^sul ioni magnesio C, e.

La specificità della PCR dipende dalla scelta del frammento di DNA. In accordo con ciò, vengono sintetizzati oligonucleotidi di semi laterali. La specificità dell'ibridizzazione e del completamento della catena del DNA è dovuta al principio di complementarità delle seguenti coppie di basi azotate: adenina-timina, guanina-citosina.

Per determinare la genomica tubercolare complesso micobatteri più efficiente amplificazione del target nella maggior parte dei sistemi di prova scelte frammento di DNA di IS6110, che nella maggior parte dei ceppi di genoma Mycobacterium tuberculosis ha un numero significativo (10-20) di ripetizioni, che fornisce, insieme con la specificità, l'alta sensibilità del saggio. Nello stesso momento sono descritti ceppi di Mycobacterium tuberculosis con un piccolo numero di ripetizioni o l'assenza di frammento IS6110.

Isolamento di molecole di DNA da un campione biologico

Per eseguire la PCR, le molecole di DNA del patogeno devono essere isolate dal materiale biologico in un volume minimo, con una quantità minima di DNA non specifico e vari inibitori dell'enzima-DNA polimerasi.

La preparazione dei campioni deve essere effettuata in condizioni che impediscano la contaminazione incrociata dei campioni da parte delle molecole di DNA isolate. Per fare questo, è necessario il pretrattamento della stanza con raggi ultravioletti, pavimenti e superfici di lavoro di scrivanie ed elettrodomestici con soluzioni contenenti cloro. Uso obbligatorio di guanti puliti, provette monouso e punte per pipette automatiche.

Per isolare il DNA di Mycobacterium tuberculosis da campioni clinici (fluido cerebrospinale, lavaggio bronchiale) non contenente un gran numero di cellule, detriti cellulari, o loro sali, sufficiente a centrifugare il campione a 3-4 mila. Rpm, aggiungere alla fanghi 20-30 ul di soluzione al 2% triton X-100 e riscaldata a 90 ^circa C per 30 min.

Per la preparazione dei campioni di espettorato è necessaria una diluizione efficace, per la quale una soluzione di idrossido di sodio al 4% e N-acetil-L-cisteina (NALC) vengono solitamente utilizzati in una quantità di 50-80 mg per campione, a seconda della viscosità del campione. La soluzione NALC deve essere preparata ex tempore o la polvere NALC può essere aggiunta direttamente al campione. Dopo la liquefazione, i campioni devono essere centrifugati per 15 minuti a 3,5-4,000 rpm (3000 g) in fiale da 50 ml con tappi a vite, cioè E. Nelle stesse condizioni che sono raccomandate per la preparazione pre-presentazione della flemma.

Per l'estrazione del DNA dal metodo pellet è usato più spesso basati sull'impiego di una soluzione 5-6 molare di guanidina isotiocianato reagente di lisi le particelle microporose e ossido di silicio ( "terra di diatomee") assorbitore molecola di DNA. Sostanze non specifici, compresi gli inibitori possibili, poi lavati in una soluzione 2.5 molare di isotiocianato di guanidinio e soluzione di etanolo, dopo di che la molecola di DNA viene desorbito in acqua, e questi campioni sono stati usati per eseguire la PCR. Per semplificare la tecnologia dell'estrazione del DNA, la "farina fossile" viene spesso sostituita da microparticelle magnetiche rivestite con ossido di silicio. In questo caso, viene utilizzato uno speciale supporto magnetico per microtubi invece della centrifugazione per far precipitare le particelle.

In Russia, è stato sviluppato un metodo originale per la separazione immunomagnetica dei micobatteri, seguito dall'estrazione del DNA del patogeno. Per la separazione immunomagnetica del mycobacterium tuberculosis, vengono utilizzati ferrocarticelli 3-5 micron rivestiti con ossido di silicio a cui sono attaccati anticorpi policlonali (coniglio) chimicamente collegati a micobatteri della tubercolosi. I campioni di escreato dopo lisi alcalina sono neutralizzati con una soluzione di tris-HCl acido e incubati con un assorbente immunomagnetico. Quindi, le immunoferroparticelle vengono raccolte con un'asta magnetica con punta sostituibile, trasferite su una microprovetta e precipitate. Aggiungere 20-30 μl di una soluzione di Triton X-100 al 2% e riscaldare per 30 minuti a 90 ^° C. Il surnatante viene utilizzato come modello di DNA per l'analisi PCR.

Un problema difficile è l'isolamento del DNA del mycobacterium tuberculosis da campioni di biopsia. Per la biopsia enzimatica, l'enzima proteinasi K viene utilizzato ad una concentrazione finale di 200-500 mg / l ad una temperatura di 56 ^° C durante la notte. Inoltre, viene utilizzato uno dei metodi noti. L'eccesso di DNA non specifico nell'analisi PCR delle biopsie causa spesso l'inibizione della reazione, che richiede l'estrazione ripetuta del DNA.

Metodi per il rilevamento dei risultati

Dopo il completamento della reazione, i frammenti di DNA amplificati del patogeno sono identificati con vari metodi.

Il metodo di elettroforesi su gel è ben noto. Il frammento di DNA risultante è identificato da un controllo positivo contenente il frammento di DNA specifico desiderato, o secondo una dimensione nota (il numero di coppie nucleotidiche) del frammento, che viene determinato utilizzando un marcatore molecolare standard.

In presenza di un colorante specifico, il bromuro di etidio è incluso nel DNA a doppio filamento. Il frammento di DNA sintetizzato viene rilevato come una banda luminosa sotto l'azione dell'ultravioletto.

La dimensione del frammento di DNA, determinata mediante elettroforesi dalla distanza dall'inizio, deve corrispondere a un marcatore di peso molecolare noto o a un controllo positivo.

Altri metodi per determinare risultati PCR basati sulla ibridazione di una catena singola prodotti di PCR con un oligonucleotide complementare ad esso - sonda di DNA marcata con biotina, seguita da rivelazione tramite reazioni enzimatiche, ad esempio legandosi a fosfatasi alcalina streptavidina-biotina.

Sulla base di questo tipo di rilevamento, sono stati creati analizzatori PCR in cui il rilevamento dei risultati della PCR viene eseguito automaticamente come risultato della lettura della densità ottica nei campioni dopo la manifestazione della reazione enzimatica.

Gli svantaggi di questi metodi sono le possibilità di contaminazione intralaboratoria da frammenti piuttosto brevi di molecole di DNA. Quando le molecole entrano in nuovi campioni, diventano una matrice per la PCR e portano a risultati falsi positivi.

A questo proposito, per prevenire risultati falsi positivi, vengono introdotte regole severe per la separazione e l'isolamento dei locali: per estrarre il DNA da campioni biologici; locali per il rilevamento dei risultati (elettroforesi) dalla zona pulita. Queste premesse sono una zona di probabile contaminazione. Un'altra area isolata è una stanza pulita per l'introduzione dei campioni di DNA da testare in provette con una miscela di reazione per PCR. Infine, si presume che il dispositivo principale - l'amplificatore del DNA - debba essere collocato in una stanza separata, possibilmente ufficio.

Per evitare la contaminazione dei prodotti delle reazioni precedenti - alcuni test di sistema Likon-amp PCR invece dezoksinukleozidtimidina contiene dezoksinukleoziduridin che, quando in vitro circuito integrato sintesi invece nella posizione corretta, cioè, La base azotata di timina presente nel DNA nativo è sostituita dall'uracile. La glicosilasi del DNA uracile, aggiunta alla miscela di reazione al materiale in analisi, distrugge solo i frammenti contaminanti con deossiuridina, ma non il DNA nativo da analizzare. Lt; / RTI & gt; Il successivo riscaldamento a 94 ^° C inattiva questo enzima e non interferisce con l'amplificazione nella PCR.

Esiste un sistema di test basato sull'amplificazione isotermica dell'rRNA, per il quale viene eseguita prima la trascrizione inversa e la sintesi delle molecole di DNA. Che, a sua volta, è una matrice per la successiva sintesi di molecole di RNA. Gli ampliconi di RNA vengono rilevati utilizzando una sonda di DNA colorato con acridina quando vengono ibridati in una soluzione di provetta di reazione. Questo metodo, oltre all'elevata sensibilità, ha il vantaggio di analizzare in una provetta, che impedisce la contaminazione. Secondo gli autori, la sensibilità di questo metodo nei campioni respiratori raggiunge il 90% con una specificità del 99-100%.

Nuovi metodi di rilevamento sono implementati in real-time PCR. Questi metodi differiscono principalmente in quella PCR e il rilevamento dei suoi risultati viene effettuato simultaneamente in un tubo chiuso. Questo non solo semplifica tecnicamente la tecnica di analisi, ma impedisce anche la contaminazione delle stanze di laboratorio e dei campioni di prova con prodotti della precedente PCR.

Con la PCR in tempo reale, il rilevamento dei risultati è dovuto alla fluorescenza derivante dall'ibridazione di una sonda di DNA fluorogenico con uno specifico frammento di DNA amplificato durante la PCR. Struttura sonde di DNA fluorogeniche costruiti in modo che il marcatore fluorescente è rilasciato come risultato di una reazione enzimatica o distanziato dalla molecola inibitore di fluorescenza solo sotto specifica ibridazione con la molecola di DNA desiderato da amplificato durante la PCR. Con l'aumento del numero di molecole ibridate con la sonda, l'aumento della fluorescenza al livello rilevabile è proporzionale al numero di molecole del prodotto amplificato. Poiché ad ogni numero ciclo di PCR molecola di DNA viene moltiplicata per metà, il numero di cicli in cui viene determinata la fluorescenza aumenta e inversamente proporzionale al numero di molecole di DNA nel campione iniziale. Se la reazione è di introdurre il calibratore diverse concentrazioni differenti note di molecole corrispondenti frammento di DNA di Mycobacterium tuberculosis, utilizzando il programma di computer può essere calcolato e la quantità di DNA genomico nel materiale di prova.

Ogni campione standard è duplicato. Il criterio quantitativo è il numero minimo di cicli di PCR necessari per l'insorgenza e la crescita della fluorescenza determinata. Sull'ascissa: il numero di cicli; l'ordinata è il valore di fluorescenza. Le concentrazioni di DNA sono inversamente proporzionali al numero di cicli richiesti per l'aspetto della fluorescenza. Nella colonna di destra (21-32), i numeri dei cicli per le concentrazioni corrispondenti sono contrassegnati. Differenze tra concentrazioni 10 volte di frammenti di DNA 10 ² -10 ⁶ ml - 3.2-3.4 cicli. Per due pazienti, le concentrazioni dei frammenti di IS6110 erano circa 10 ³ / ml e 10 ⁴ / ml. Tenendo conto del numero di ripetizioni (6-20) dei frammenti analizzati nel genoma di Mycobacterium tuberculosis, il numero di micobatteri nei campioni clinici è rispettivamente di circa 100 e 1000 cellule.

L'uso della PCR nella diagnosi della tubercolosi

Il metodo PCR è più utilizzato per la diagnosi accelerata della tubercolosi: rilevamento del micobatterio tubercolare nei campioni clinici: espettorato. Irrigazione bronchiale, essudato pleurico, urina, liquido cerebrospinale, osteolisi puntata, aspirati del tratto genitale femminile e vari campioni bioptici. Studiando circa 500 campioni di espettorato e vampate bronchiali da 340 pazienti con diagnosi confermata di tubercolosi polmonare nei Paesi Bassi, è stata studiata la sensibilità comparativa della PCR, coltura e microscopia a striscio. La sensibilità dell'analisi era 92,6.88,9 e 52,4%, rispettivamente. La specificità di tutti i metodi era circa del 99%.

È stata confrontata l'efficacia del rilevamento del micobatterio tubercolosi mediante microscopia a striscio, semina sul terreno Levenstein-Jensen, sistema di analisi VASTES e analisi PCR. PCR ha mostrato una sensibilità del 74,4%, microscopia - 33,8%, semina su un mezzo denso - 48,9% e VASTES - 55,8%. Il tempo medio di rilevamento per la semina su un mezzo Levenstein-Jensen è di 24 giorni. Vasti - 13 giorni, PCR - 1 giorno.

Vengono inoltre discusse le possibilità di utilizzare la PCR come metodo sensibile e rapido per monitorare l'efficacia del trattamento della tubercolosi.

Rilevazione di Mycobacterium tuberculosis DNA tramite PCR con la chemioterapia efficace determinato per un tempo più lungo - in media 1,7 mesi rispetto a striscio definito al microscopio a fluorescenza, e di 2,5 mesi rispetto al esame batteriologico.

Diagnosi di forme extrapolmonari di tubercolosi

L'importanza della PCR come metodo sensibile è particolarmente importante per le forme extrapolmonari, poiché è con queste forme che i metodi clinico-radiologici e i metodi batteriologici tradizionali per determinare i micobatteri della tubercolosi nei materiali diagnostici sono inefficaci.

Nello studio dei campioni di urina, i risultati dell'analisi PCR sono risultati positivi in 16 su 17 pazienti con tubercolosi attiva del sistema urinario e negativi in 4 pazienti con tubercolosi renale inattiva e 39 pazienti con malattie non tubercolari del sistema urinario.

L'efficacia dell'analisi PCR nello studio degli aspirati del midollo osseo in pazienti con febbre di origine sconosciuta è stata dimostrata in casi di sospetta tubercolosi. Per diagnosticare la linfadenite tubercolare, sono stati studiati 102 bambini con aspirazioni da puntura e un campione bioptico di 67 bambini con sospetta linfoadenite tubercolare. Sono stati ottenuti risultati positivi: 71,6% in PCR in tempo reale. Microscopia a fluorescenza - 46,3%. Ricerca sulla cultura - 41,8%. Nello studio di 50 biopsie linfonodali in pazienti con "cat scratch", tutti i risultati sono stati negativi. Quindi, è stata dimostrata la specificità al 100% dell'analisi PCR. Nello stesso lavoro, con la biopsia puntura dei linfonodi, è stata dimostrata la possibilità di rilevamento di M. Avium.

La diagnosi di tubercolosi dell'infertilità dell'area genitale femminile, come è noto, è uno dei problemi più difficili della diagnosi. In uno studio di PCR su biopsie endometriali, aspirati endometriali e campioni di liquidi dallo spazio di Douglas, 14 (56%) su 25 pazienti esaminati per via laparoscopica con tubercolosi sospetta hanno ottenuto risultati positivi. Usando microscopia a striscio e coltura, sono stati ottenuti 1 e 2 risultati, rispettivamente. Questi casi erano anche positivi alla PCR. La maggior parte dei risultati positivi alla PCR erano correlati a casi con segni caratteristici di tubercolosi secondo lo studio istologico; un numero minore - con sospetto di tubercolosi secondo i dati della laparoscopia. Solo un risultato positivo dell'analisi PCR è stato ottenuto in assenza di dati laparoscopici per la tubercolosi.

Durante la diagnosi di forme extrapolmonari di tubercolosi, i medici spesso hanno una domanda sulla possibilità di rilevare un patogeno durante il test dei campioni di sangue con il metodo PCR. I dati letterari indicano che il rilevamento del DNA dalla tubercolosi del micobatterio da campioni di sangue è possibile con forme di vasta portata dell'infezione da HIV. Il DNA di mycobacterium tuberculosis è stato rilevato solo con tubercolosi generalizzata di vari organi in pazienti con rene trapiantato e immunosoppressione.

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Identificazione di specie di micobatteri

Il metodo PCR può essere molto efficace per una rapida identificazione di micobatteri di complessi tubercolosi e alcune specie di micobatteri nontubercular che riceve la loro crescita iniziale. In questo caso, l'uso della PCR può salvare 7-10 giorni, necessari per la successiva identificazione culturale di un risultato positivo. Il test PCR è tecnicamente molto semplice, poiché non richiede una preparazione complicata del campione del materiale clinico per ottenere un'alta sensibilità. Nello studio 80 positivo in questo sistema di test (società MB Vasto. Organon) tutte le colture positive di PCR erano rigorosamente specifico e tenuto premuto per 1 giorno. Per identificare altre specie di micobatteri nella preparazione del DNA del patogeno cultura ibridato con sonde di DNA specifiche marcate con acridina e ceppi identificati dalla comparsa di chemiluminescenza tramite strisce chemiluminometer o nitrocellulosa con una valutazione visiva dopo ibridazione. Con l'aiuto di un tale set, viene identificato un numero limitato di specie: il complesso del micobatterio tubercolare. M. Avium, M. Avium complex, M. Kansasii e M. Gordonae.

A.Telenti et al. Anche sviluppato un metodo relativamente semplice ed economico per l'identificazione delle specie di specie clinicamente importanti di micobatteri mediante PCR e successivo trattamento con due enzimi di restrizione (enzimi avente proprietà tagliare una molecola di DNA in punti specifici). Il frammento di DNA è amplificato. Codificante una proteina heat shock (65 kDa), e poi trattato nel risultante frammento di PCR di DNA di 439 coppie di nucleotidi separatamente due enzimi - BSTE II e Hae III. Quindi analizzato usando elettroforesi su gel di agarosio ottenuta due prodotti, determinando le loro dimensioni (numero di coppie di basi) utilizzando un insieme standard di frammenti di DNA (molecolari marcatori del DNA) in lunghezza da 100 a 1000 coppie di basi. In ciascuno dei tipi specifici (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) rilevare due o tre frammenti di DNA di dimensioni diverse per ciascun enzima di restrizione. La combinazione di diverse dimensioni del DNA ottenute consente di differenziare queste specie tra di loro.

La tecnologia dei microarrays biologici del DNA è in fase di sviluppo. Che aiuterà a identificare più di 100 specie di micobatteri in uno studio.

L'identificazione delle specie può anche essere effettuata mediante amplificazione PCR della regione variabile di rRNA 16S seguita da sequenziamento di amplicone se confrontata con la corrispondente struttura primaria, che consente di identificare più di 40 specie di micobatteri.

Con l'aiuto della PCR, si può anche eseguire un'identificazione di specie all'interno del complesso di tubercolosi del micobatterio, compresa la differenziazione di M. Bovis e M. Bovis BCG. Per fare questo, viene analizzata la presenza o l'assenza di alcuni geni nelle regioni genomiche di RD1. RD9 e RD10. L'RD1 è assente in M. Bovis BCG, ma è presente in specie virulente, incluso M. Bovis.

Determinazione della sensibilità al farmaco di Mycobacterium tuberculosis mediante PCR

I compiti dei metodi genetici molecolari per determinare la suscettibilità o resistenza ai farmaci della tubercolosi del micobatterio sono ridotti alla rilevazione di mutazioni in alcune sequenze nucleotidiche di geni noti. I metodi principali si basano sulla lettura diretta (sequenziamento) di queste sequenze dopo l'amplificazione o sull'ibridazione di frammenti di DNA marcati con biotina amplificati durante la PCR con sonde di DNA. Entrambe le alternative includono l'identificazione delle sostituzioni nucleotidiche nelle sequenze che utilizzano sonde di DNA portano all'assenza o ibridazione incompleta di una membrana di nitrocellulosa utilizzando coniugato enzimatico (streptavidina-fosfatasi alcalina) - Metodo LIPA-Rif-TB.

Metodo per misurare la fluorescenza in un fissato localmente su microsezioni DNA sonde complementari alle mutazioni note nelle regioni geniche PCR amplificate responsabili della resistenza o sensibilità ai farmaci, chiamati mikrobiochipov metodo. L'algoritmo principale per eseguire questa ricerca è il seguente. Dopo aver isolato il DNA da un campione clinico o coltura di micobatteri è necessario procedere ad amplificazione PCR di frammenti pertinenti del gene rpoB responsabile della sensibilità al farmaco rifampicina o geni katG e Inha codificanti proteine di Mycobacterium sono responsabili di sensibilità a isoniazide. I risultati della PCR vengono valutati mediante elettroforesi su gel di agarosio, in cui vengono confermati i corrispondenti frammenti di DNA della lunghezza desiderata. Quindi, viene eseguito un secondo ciclo di PCR per introdurre un'etichetta fluorescente nel DNA. I risultati della PCR sono nuovamente confermati dall'elettroforesi su gel. Successivamente, l'ibridazione è stata effettuata (notte di incubazione), seguito dal lavaggio del materiale risultante sul biochip, che è un gran numero di fisso in una piastrina di vetro corti filamenti di DNA (sonde) che sono complementari a sequenze nucleotidiche del tipo Mycobacterium tuberculosis sensibile ai farmaci nei punti di possibili mutazioni. Così come alle sequenze mutanti responsabili della resistenza ai farmaci. Posizione di sonde di DNA su piastra - rigorosamente definita, e il livello di fluorescenza osservata in seguito a ibridazione per determinare il risultato usando un dispositivo di lettura speciale è installato. A questo proposito, i risultati dell'analisi sono determinati mediante uno speciale programma per computer.

Negli ultimi anni sono stati sviluppati metodi alternativi per determinare la sensibilità ai farmaci della tubercolosi dei micobatteri sulla base della tecnologia PCR in tempo reale, che consente di condurre questi studi in un test a tubo chiuso.

In fig. 13-13 mostra il risultato dell'analisi di isolati clinici di Mycobacterium tuberculosis nel determinare la resistenza alla rifampicina mediante PCR in tempo reale: 218 - campione di controllo (sensibili alla rifampicina); 93 - controllo positivo per la mutazione di Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - controllo positivo per la mutazione di Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - campioni sperimentali. Risultato del calcolo delle curve cinetiche di amplificazione su 4 canali: canale 1: 393 - controllo positivo per la mutazione di Ser-Trp TCG-TGG; canale 2: 4482 - controllo positivo per la mutazione di Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - campioni sperimentali; canale 4: curve cinetiche di amplificazione di tutti i campioni che partecipano all'esperimento. Controllo positivo della reazione di amplificazione. Conclusioni: I risultati delle analisi hanno rivelato i seguenti mutazioni che determinano la resistenza alla rifampicina: in campioni 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG. Lo stesso principio è stato utilizzato per determinare la resistenza al farmaco per isoniazide per i geni katG e inhA, che determina le mutazioni più frequenti.

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Identificazione del ceppo di mycobacterium tuberculosis

Il metodo più accuratamente studiata di identificazione di ceppi di Mycobacterium tuberculosis è una tecnica chiamata rflp (RFLP RFLP,. O nella versione inglese) e che si basano su fragmentirovanin (limitazione) di enzima Mycobacterium tuberculosis DNA Pvu II ed i frammenti ottenuti successiva ibridazione con alcune sequenze specifiche di DNA il suo elemento ripetuto IS6110. La variabilità intraspecifica è realizzata a causa del diverso numero di ripetizioni di IS6110 e della loro posizione sul DNA. Così come la varietà di distanze tra alcuni punti di attacco dell'enzima di restrizione enzimatica (siti di restrizione) e l'elemento IS6110. Questa tecnologia è molto complicata e richiede molto tempo. Dopo il trattamento con DNA estratto da una coltura di Mycobacterium tuberculosis, elettroforesi su gel viene eseguita con un enzima di restrizione, e poi trasferito frammenti di DNA di diversa lunghezza su una membrana di nitrocellulosa, ibridazione è stata effettuata con frammenti di IS6110 elementi e rilevata mediante reazioni enzimatiche. Il modello specifico risultante di bande caratterizza il DNA di uno specifico ceppo di Mycobacterium tuberculosis. Con l'aiuto dell'analisi computerizzata, viene rivelata l'identità o la parentela dei ceppi. Nonostante il fatto che il metodo RFLP sia il più discriminatorio, ad es. Rivela il maggior numero di differenze nei ceppi analizzati, è inefficace con un piccolo numero (meno di 5) ripetizioni IS6110 osservate in alcuni ceppi. In fig. 13-14 mostra i risultati della tipizzazione RFLP dei ceppi.

Un'alternativa può essere il metodo di spoligotyping - analisi del polimorfismo delle sequenze di DNA del distanziatore - intermedio tra le ripetizioni dirette della regione DR. Quando si esegue la spoligotipizzazione dei ceppi, la PCR viene eseguita con primer che delimitano la regione DR, dopo di che si formano frammenti di lunghezza diversa che si ibridano con le regioni intermedie variabili del DNA. Viene presentata l'analisi delle sequenze di spaziatori della regione DR. Secondo i ricercatori, più semplice, produttivo e adatto allo screening primario dei ceppi e alle analisi epidemiologiche preliminari, nonché alla ricerca diretta del materiale clinico.

Ovviamente, il metodo più efficace e tecnologicamente accessibile è VNTR (abbreviazione di parole inglesi), o il metodo per determinare il numero variabile di ripetizioni esatte in tandem nel DNA del micobatterio tubercolosi. Questo metodo si basa solo sull'utilizzo della PCR e non richiede ulteriori manipolazioni. Poiché il numero di ripetizioni in tandem in diversi ceppi e in diversi loci è diverso, i frammenti di diverse dimensioni sono determinati e analizzati sul risultante elettroforegramma dei prodotti PCR. Secondo i ricercatori, l'uso di VNTR raggiunge un grado maggiore di discriminazione dei ceppi rispetto al metodo RFLP.

Negli ultimi anni è stata prestata molta attenzione alla distribuzione dei ceppi di Mycobacterium tuberculosis della famiglia W-Beijing (a volte chiamata ceppo di Pechino), che sono in gran parte resistenti ai farmaci.

Requisiti di base per la qualità della ricerca molecolare biologica

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Documenti normativi di base per la PCR

Ordini ministero russo della Sanità: №45 dal 2000/02/07 g .. Numero 109 dal 21.03.2003 g .. Numero 64 dal 21.02.2000, le linee guida: 1.3.1888-04 "Organizzazione del lavoro in studi che utilizzano materiale PCR infettati con patogeni biologici agenti di gruppi III-IV di patogenicità "; 1.3.1794-03 "Organizzazione del lavoro nello studio del materiale PCR, infetto da microrganismi dei gruppi di patogenicità I-II". . 2003; 3.5.5.1034-01 "Decontaminazione del materiale, infetta i batteri I-IV gruppi di patogenicità quando si utilizza la PCR," 2001 L'appendice 11 alle istruzioni unificate per i metodi di esame microbiologico per l'identificazione, la diagnosi e il trattamento della tubercolosi.

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Il personale

La diagnostica clinica di laboratorio, i medici batteriologici, i virologi, i biologi del laboratorio diagnostico clinico, nonché gli specialisti con formazione medica secondaria, che hanno superato la specializzazione e la formazione avanzata nell'ordine stabilito, possono effettuare studi di biologia molecolare.

Disposizione dei locali di laboratorio

Sono richieste le seguenti sale di laboratorio:

• L'area di manipolazione dei campioni è un laboratorio adatto a lavorare con agenti infettivi dei gruppi di patogenicità III-IV, secondo le Istruzioni metodiche 13.1888-04.
• Zona per la preparazione di miscele di reazione PCR - sala laboratorio, che fornisce protezione dalla contaminazione interna del laboratorio - zona "pulita".
• • Se si utilizza l'elettroforesi o l'ibridazione per analizzare i prodotti della PCR. Camera laboratorio in cui i frammenti di DNA moltiplicate vengono estratti dai tubi e amplificazione, rispettivamente, può entrare nell'ambiente, in conformità con i requisiti dei laboratori PCR (1.3.1794-03 orientamenti, Indicare 1.3.1888-04) deve essere pienamente è isolato dai locali indicati nei paragrafi precedenti. Dovrebbe essere escluso dalla zona di movimento a zona elettroforesi per la manipolazione del campione e una zona "pulita" di qualsiasi personale, attrezzature, materiali e oggetti, nonché il trasferimento di aria attraverso il sistema di ventilazione, o come risultato di bozze. Questa zona non è richiesta per il rilevamento fluorimetrico dei prodotti PCR.
• La stanza per la documentazione e l'elaborazione dei risultati è dotata di computer e attrezzature per ufficio necessarie. Questa stanza può contenere apparecchiature che consentono di rilevare i prodotti della PCR senza aprire la provetta. - rivelatori PCR fluorescenti e termociclatori per la PCR in tempo reale.

I requisiti sanitari ed epidemiologici per il trattamento primario dell'espettorato sono simili ai requisiti microbiologici standard per lavorare con la tubercolosi dei micobatteri.

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Completamento di attrezzature di laboratorio per la diagnostica PCR

Il laboratorio include attrezzature per le seguenti stanze.

• spazio per la preparazione del campione, contiene le seguenti apparecchiature: laminare della classe II di protezione "SP-1.2": termostato a stato solido con copertura di riscaldamento per provette del tipo "Eppendorf"; microcentrifuga a 13.000 rpm; una centrifuga (Vortex); frigorifero con una gamma di temperature da -20 ^о С a +10 ^о С; pipette a volume variabile della serie "Rroline"; una pompa con una fiaschetta OM-1; un treppiede per pipette; stazione di lavoro per treppiedi 200x0,5 ml; stazione per treppiede 50x1,5 ml; Supporti per la conservazione di provette 80x1,5 ml;
• Sala preparazione miscela di reazione: camera di protezione Scatola PCR ("Laminar-C. 110 cm); centrifuga - Vortex; Pipette a volume variabile della serie Proline; un treppiede per pipette; stazione di lavoro per treppiedi 200x0,2 ml; Supporti per la conservazione di provette 80x1,5 ml; frigorifero con una gamma di temperature da -20 ^о С a + 10 ^о С;
• spazio per elettroforesi: telecamera per elettroforesi orizzontale; alimentazione elettrica; transilluminatore;
• Amplificatori di DNA o analizzatore di acido nucleico (PCR in tempo reale) con un computer e un software; può essere inserito in qualsiasi stanza libera. Se viene utilizzata la tecnologia PCR in tempo reale. Non è necessario spazio per l'elettroforesi.

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Controllo di qualità esterno

Per essere certi di ottenere risultati oggettivamente affidabili, i laboratori dovrebbero partecipare al sistema di valutazione esterna della qualità della ricerca di laboratorio.

I partecipanti al sistema di controllo qualità ricevono; 12 fiale con sospensioni liofilizzate di cellule batteriche, due delle quali contengono E. Coli E. Coli, 3 fiale con mycobacterium tuberculosis (ceppo avirulent) ad una concentrazione di 10 ² / ml; 3 fiale con cellule di un ceppo simile in una concentrazione di 10 ⁴ / ml; 2 fiale con micobatterio non-tubercolare M. Avium-intracellulare e M. Kansasii in concentrazione di 10 ⁵ / ml.

I test distribuiti per la valutazione della qualità esterna sono pre-testati in due laboratori indipendenti con una vasta esperienza in questo campo.

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