Modelli sperimentali di osteoartrite

La cartilagine è un tessuto altamente specializzato che contiene un solo tipo di cellule (condrociti), caratterizzato dall'assenza di vasi sanguigni e linfatici. La nutrizione della cartilagine viene effettuata principalmente per assorbimento dal liquido sinoviale. Il metabolismo dei condrociti è regolato da un numero di fattori solubili prodotti localmente dai condrociti e dai tessuti circostanti. La funzione dei condrociti dipende anche dalla composizione del mezzo extracellulare (tensione dell'ossigeno, concentrazione di ioni, pH, ecc.), Composizione VCM, interazione cellula e matrice, segnali fisici. Il compito principale della modellazione sperimentale è la creazione di culture nell'ambiente extracellulare senza modificare il fenotipo delle cellule mature. Il secondo compito è quello di creare colture per studiare la risposta prematura, ritardata, a breve oa lungo termine dei condrociti ai segnali chimici e / o fisici. Gli studi in vitro offrono anche l'opportunità di studiare il comportamento dei condrociti in osteoartrite. Il terzo compito è lo sviluppo di sistemi co-curativi, che consentono di studiare le interazioni di vari tessuti nell'articolazione. Il quarto compito è la preparazione di impianti cartilaginei per il successivo trapianto. Infine, il quinto compito è studiare i fattori di crescita, le citochine o gli agenti terapeutici in grado di stimolare la riparazione e / o inibirne il riassorbimento della cartilagine.

Negli ultimi dieci anni, creato diversi modelli di colture cellulari articolare cartilagine, tra i quali - monostrati, coltura in sospensione, cultura hondronov, espianti, co-coltura, la coltura di cellule immortali. Ogni coltura ha i suoi vantaggi e svantaggi e ciascuno è adatto per studiare un aspetto particolare del metabolismo dei condrociti. Pertanto, gli espianti cartilaginosi sono un modello eccellente per lo studio del turnover degli elementi della matrice, che richiede i veri recettori della superficie cellulare e le normali interazioni cellula-matrice e cellula-matrice. Allo stesso tempo, si raccomanda lo studio dei depositi nella matrice o dei meccanismi per la regolazione del metabolismo dei condrociti su una coltura di cellule isolate. Una coltura monostrata a bassa densità è necessaria per studiare il processo di differenziazione cellulare. Le colture sospese in una matrice naturale o sintetica sono un modello per analizzare la risposta adattativa dei condrociti allo stress meccanico.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Colture condrocitarie

Quando si sceglie il tessuto cartilagineo per studi in vitro, è necessario prendere in considerazione diversi punti importanti. La composizione della matrice e l'attività metabolica dei condrociti variano a seconda delle articolazioni e quest'ultima dipende anche dalla profondità del condrocita nel tessuto. Questi dati sono stati ottenuti in diversi esperimenti in cui sono state studiate sottopopolazioni isolate di condrociti dalle zone della cartilagine di diverse profondità. Un certo numero di differenze morfologiche e biochimiche sono state trovate tra i condrociti coltivati situati negli strati superficiali e profondi della cartilagine articolare. Le cellule superficiali sintetizzano una matrice fibrillare proteoglicano rara e impoverita, mentre le cellule più profonde producono una matrice ricca di fibrille e proteoglicani. Inoltre, le cellule superficiali producono proteoglicani non aggregati relativamente più piccoli e acido ialuronico e relativamente meno aggrecano e cherantan solfato rispetto ai condrociti più profondamente localizzati. Un'altra importante caratteristica distintiva del metabolismo dei condrociti isolati dalle zone della cartilagine di diverse profondità è la risposta allo stimolo esogeno. Secondo M. Aydelotte e co-autori, i condrociti di toro dalla zona superficiale della cartilagine erano più sensibili a IL-1 rispetto alle cellule della zona profonda.

Il comportamento delle cellule dipende anche dalla posizione del tessuto. I condrociti della cartilagine e orecchio bordi, presi dallo stesso animale che reagiscono in modo diverso ai fattori di crescita quali il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF), e TGF-beta. FGF ha aumentato l'incorporazione di timidina, prolina e leucina nella coltura dei condrociti della costola, ma non nell'orecchio. TGF-P aumentato l'incorporazione di timidina in condrociti della cartilagine costola e l'orecchio, ma non ha avuto effetto sulla timidina in condrociti e l'orecchio prolina. Le cellule cartilaginee ottenute da zone con il carico maggiore differiscono da quelle provenienti da siti con basso carico sulla cartilagine. Ad esempio, condrociti maturi della cartilagine del ginocchio dalla regione centrale di pecore articolare superficie tibiale osso non coperti dal menisco, che porta il maggior carico in vivo, minore aggrecan sintetizzato, decorin ma più grandi delle celle delle aree coperte dal menisco. Gli autori sottolineano inoltre l'importanza di utilizzare la cartilagine da zone articolari identiche quando si esamina la funzione sintetica delle articolazioni.

Il metabolismo dei condrociti e la loro risposta ai fattori regolatori dipende anche in modo significativo dall'età del donatore, dallo sviluppo del suo scheletro e dallo stato delle articolazioni da cui vengono prelevate le cellule. Nei condrociti umani si osserva una diminuzione significativa con l'età della risposta proliferativa. La più grande diminuzione è osservata in donatori di età compresa tra 40-50 anni e oltre 60 anni. Inoltre, la gravità della risposta proliferativa ai fattori di crescita (ad es. FGF e TGF-beta) diminuisce durante l'invecchiamento. Oltre ai cambiamenti quantitativi nella proliferazione dei condrociti, ci sono anche cambiamenti qualitativi. Le cellule giovani donatrici (10-20 anni) rispondono meglio al fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) rispetto al TGF-beta, mentre il contrario è osservato nelle cellule dei donatori adulti. Per spiegare i cambiamenti dipendenti dall'età nella funzione sintetica dei condrociti e la loro risposta all'effetto dei fattori di crescita, vengono utilizzati diversi meccanismi. Tra questi, una diminuzione del numero e dell'affinità dei recettori cellulari superficiali, un cambiamento nella sintesi e la bioattività dei fattori di crescita e delle citochine, una modifica dei segnali dei postrecettori.

La condizione patologica delle articolazioni altera anche la morfologia e l'attività metabolica dei condrociti. Così, J. Kouri e co-autori (1996) hanno identificato tre sottopopolazioni di condrociti nella cartilagine con osteoartrosi. I condrociti dalla parte superficiale e superiore della cartilagine formano ammassi e sintetizzano più proteoglicani e collagene. TGF-beta e fattore di crescita insulino-simile (IGF) sono in grado di stimolare la sintesi di proteoglicani da parte dei condrociti e parzialmente neutralizzare gli effetti di IL-1 e TNF-a. Espianti di cartilagine affetti da osteoartrite e condrociti isolati dalla cartilagine di un paziente con osteoartrosi sono più sensibili alla stimolazione del TGF-beta rispetto ai condrociti della cartilagine sana. Queste differenze sono verosimilmente associate a cambiamenti fenotipici nei condrociti negli strati superiori della cartilagine articolare.

L'isolamento dei singoli condrociti è ottenuto mediante trattamento sequenziale con enzimi proteolitici di ECM. Dopo il loro rilascio dall'ECM, le cellule isolate sono ideali per studiare la sintesi dei componenti della matrice de novo. Alcuni autori usano solo la clostridium collagenasi, altri pre-incubano la cartilagine con tripsina, pronasi, DNasi e / o ialuronidasi. Il numero di cellule isolate dipende dagli enzimi utilizzati. Così, quando si elaborano uno dei 1 g di tessuto collagenasi può essere ottenuto 1,4T0 ⁶ condrociti, mentre quando utilizza pronasi, ialuronidasi e collagenasi - 4,3-10 ⁶. Durante l'elaborazione con collagenasi, aggrecan, proteine, IL-6, IL-8 rimangono nella coltura cellulare molto più che nel caso del trattamento sequenziale con vari enzimi. Ci sono diverse spiegazioni per queste differenze tra le due colture cellulari:

• recettori cellulari danneggiati o depresse dall'azione degli enzimi, TGF-beta inibisce la sintesi del DNA dei proteoglicani in condrociti appena isolate (giorno 1), mentre il DNA e la sintesi dei proteoglicani di condrociti coltivati in monostrato (7 giorni) stimolate con TGF-beta. Tuttavia, per riesprimere queste componenti della membrana, è necessario un periodo adeguato prima dell'inizio dell'esperimento.
• Le proteasi esogene possono rompere l'interazione tra cellule e matrice, mediata dalle integrine. La famiglia delle integrine promuove l'attaccamento dei condrociti alle molecole VKM (Shakibaei M. Et al., 1997) .Questa rottura può influenzare l'espressione dei geni della matrice.
• I residui dei componenti della matrice possono regolare la funzione sintetica dei condrociti. Le integrine sono in grado di riconoscere i prodotti di degradazione dell'ECM, quindi svolgono un ruolo importante nella riparazione dei tessuti dopo l'esposizione agli enzimi proteolitici. T. Larsson e co-autori (1989) hanno riportato che l'aggiunta di pro-teoglicani intatti o frammentati alla coltura cellulare stimola la sintesi di proteine e proteoglicani. Tuttavia, elevati livelli di acido ialuronico provoca una riduzione significativa l'inclusione di sintesi dei proteoglicani solfato da condrociti condrociti embrione di pollo mature cellule suine e ratto condrosarcoma. Inoltre, l'acido ialuronico è un inibitore del rilascio di proteoglicani dalle cellule anche in presenza di IL-lb, TNF-a, FGF, che indica una resistenza alla prima attività biologica di fattori di crescita e citochine. L'esatto meccanismo alla base dell'azione dell'acido ialuronico rimane poco chiaro; È noto che i condrociti contengono un recettore per l'acido ialuronico, associato ai filamenti di actina del citosol. Il legame dell'acido ialuronico al suo recettore stimola la fosforilazione delle proteine. Pertanto, questi dati dimostrano la modulazione della funzione metabolica dei condrociti mediante molecole frammentate o native di proteine della matrice attivando le cellule del recettore della membrana.
• La rapida stimolazione da parte degli enzimi della sintesi delle proteine della matrice da parte dei condrociti può essere una conseguenza di un cambiamento nella forma dei condrociti e / o nella riorganizzazione del citoscheletro.
• Alcune citochine (es. IL-8) e fattori di crescita (ad es. IGF-1, TGF-P) sono fissate nell'ECM. L'esempio più noto è il legame del TGF-beta con il decoro, che porta ad una diminuzione della capacità del primo di indurre la crescita cellulare nelle cellule ovariche nei criceti cinesi. I dati che il contenuto della decorazione della cartilagine aumenta con l'età, indicano una diminuzione della biodisponibilità del TGF-beta nell'invecchiamento. I fattori di crescita e le citochine possono essere rilasciati dai residui della matrice durante la coltura e quindi modulare la funzione dei condrociti.

[8], [9], [10], [11],

Coltura monostrato di condrociti

Il fenotipo differenziato dei condrociti è principalmente caratterizzato dalla sintesi di collagene di tipo II e proteoglicani specifici del tessuto, nonché da un basso livello di attività mitotica. È dimostrato che con la coltivazione prolungata di cellule in un monostrato e dopo numerosi passaggi ripetuti di cellule, i condrociti perdono i loro contorni sferici, acquisendo una forma allungata, simile ai fibroblasti. Con questa metaplasia fibroblastica si modifica anche la funzione sintetica delle cellule, caratterizzata da una progressiva diminuzione della sintesi dei tipi di collagene II, IX e XI e un aumento della sintesi di collagene I, III e Utyopov. I piccoli proteoglicani non aggregati sono sintetizzati da aggrecan funzionale. Synthetzatepsin B e L è estremamente basso in celle differenziate, ma nel processo di perdita di aumenti di differenziazione. La collagenasi-1 è espressa in condrociti differenziati, con coltivazione prolungata, la sua espressione diminuisce, mentre aumenta la produzione di inibitori tissutali di metalloproteasi (TIMP).

I condrociti differenziati riesumano il collagene del fenotipo differenziato quando vengono trasferiti da una coltura monostrato ad una sospesa. Il processo di differenziazione è probabilmente correlato alla forma delle cellule. Questa proprietà viene regolarmente utilizzata da ricercatori che studiano trapianti difettosi con condrociti autologhi. Un piccolo numero di cellule ottenute da un materiale bioptico può essere moltiplicato in una coltura monostrato e quindi riposto in una matrice tridimensionale prima del trapianto. La ri-espressione di un fenotipo specifico mediante condrociti dedifferenziati trasferiti a una coltura di agarosio può essere stimolata con TGF-p, un complesso osseino-idrossiapatite e acido ascorbico.

In risposta all'effetto dei fattori di crescita e delle citochine, i condrociti vengono modificati durante il processo di differenziazione. La risposta cellulare alle citochine e ai fattori di crescita differiscono tra i condrociti indifferenziati e differenziati. IL-1 stimola la proliferazione dei fibroblasti, mentre la crescita dei condrociti indifferenziati è inibita da IL-1. La sintesi del DNA è stimolata dall'IGF-1 in condrociti allungati, ma non appiattiti. Nei condrociti differenziati, gli effetti stimolanti di IL-1β e TNF-a sui prodotti della procollagenasi sono più pronunciati rispetto a quelli indifferenziati.

Coltivazione di condrociti

La coltivazione di condrociti in sospensione in un mezzo liquido o in una matrice tridimensionale naturale o sintetica stabilizza il fenotipo del condrocita. Le cellule mantengono la loro forma sferica, sintetizzano le proteine specifiche del tessuto. Una coltura di condrociti ponderata è generalmente raccomandata per lo studio della formazione di una nuova matrice pericellulare. Colture di condrociti in polimeri assorbenti sintetici o naturali vengono utilizzate per impiantare le cellule nei difetti della cartilagine per stimolare la rigenerazione del tessuto cartilagineo dell'articolazione. L'ambiente sintetico o naturale per le cellule impiantabili deve soddisfare una serie di requisiti:

• Gli impianti dovrebbero avere una struttura porosa per l'adesione e la crescita cellulare,
• né il polimero stesso né i prodotti della sua degradazione dovrebbero causare infiammazioni o reazioni tossiche durante l' impianto in vivo,
• il portatore del trapianto dovrebbe essere in grado di legarsi a una cartilagine adiacente o all'osso subcondrale,
• una matrice naturale o sintetica deve essere capace di assorbimento, la sua degradazione deve essere bilanciata dalla rigenerazione dei tessuti,
• Per facilitare la riparazione della cartilagine, la struttura chimica e l'architettura a matrice della matrice dovrebbero aiutare a mantenere il fenotipo cellulare inserito nei condrociti e la sintesi di proteine specifiche del tessuto,
• durante l'impianto in vivo, è necessario studiare le proprietà meccaniche della matrice sintetica o naturale.

[12], [13], [14], [15], [16]

Sospensione di condrociti in fase liquida

Attaccamento cellulare per serbatoi di plastica, in cui la coltura di condrociti può essere prevenuta loro pareti rivestite con una soluzione di cellulosa metile, agarosio, idrogel (poly-2-idrossietilmetacrilato) o una miscela di collagene-agarosio. In queste condizioni, i condrociti formano gruppi e sintetizzano principalmente collageni aggrecani e tessuti specifici (tipi II, IX, XI). Di solito, vengono trovati due tipi di celle. Le cellule situate al centro conservano una forma sferica circondata da una ECM ben sviluppata, confermata da studi istochimici e ultrastrutturali. Sulla periferia i condrociti hanno contorni discoidi, sono circondati da una ECM rara; Poco si sa circa le caratteristiche funzionali di tali cellule.

La coltivazione di condrociti su microcarrier supportati in sospensione è possibile; Per microtrasferenze si usano microsfere di destrano (citodex), perle di destrano rivestite di collagene (citodex III), microsfere non vuote di collagene di tipo I (collagene). In queste condizioni di coltura, i condrociti si attaccano alla superficie del microcarrier, mantengono la loro forma sferica e producono un materiale simile alla matrice. Inoltre, l'uso del collagene favorisce la proliferazione dei condrociti e la reespressione di un fenotipo normale. Pertanto, la coltivazione di condrociti sulle microsfere del collagene può essere utilizzata per ripristinare il fenotipo cellulare prima del trapianto.

Un altro metodo di coltivazione di una sospensione di condrociti in un mezzo liquido è la loro coltivazione sotto forma di perle dense costituite da cellule (0,5-1 * 10 ^b ) ottenute per centrifugazione. Tali condrociti sono in grado di produrre una matrice contenente un gran numero di proteoglicani, il collagene di tipo II, ma non il collagene di tipo I, che è confermato da metodi istologici, immunoistochimici e quantitativi.

Sospensione di condrociti in un ECM naturale

I condrociti possono essere coltivati in sospensione in una matrice tridimensionale (agar morbido, agarosio, gel di collagene o spugna, acido ialuronico, colla di fibrina, perline di alginato).

I condrociti di agarosio coltivato mantengono il loro fenotipo normale e sintetizzano il collagene di tipo II e aggregati di nuovi aggregati tissutali specifici. Quando coltivati in agarosio, i proteoglicani sintetizzati dalle cellule vengono rilasciati nel mezzo per 50 giorni. Per confronto - nella coltura monostrato la fase cellulare è troppo piena di glicosaminoglicani già nei primi 5-6 giorni di coltivazione; se coltivato in un terreno in cui la sintesi e il rilascio di glicosaminoglicani sono intensificati, la diminuzione dipendente dal tempo dei glicosaminoglicani si verifica nei primi 8-10 giorni. Tuttavia, il comportamento dei condrociti durante la loro coltivazione in agarosio differisce da quello in condizioni in vivo. In agarosio, un gran numero di aggregati Aggregan sintetizzati contengono molecole sempre più piccole che in vivo. TGF-P stimola la sintesi di proteoglicani nell'espianto, ma riduce la sintesi di aggrecan in agarosio.

L'alginato è un polisaccaride lineare derivato da alghe brune. In presenza di cationi bivalenti, come gli ^ioni Ca ²⁺, questo polimero diventa un gel. Ogni condrociti catturati in alginato, circondato da una matrice di polisaccaridi caricati negativamente, i pori che sono paragonabili a quelli della cartilagine ialina. La matrice che si forma condrociti in biglie di alginato, costituito da due segmenti - un sottile strato di matrice di celle associata corrispondente alle matrici pericellulari e territoriali di cartilagine articolare e più remoto matrice equivalente interterritorial in tessuto nativo. Al 30 ° giorno di coltura, volume relativo e assoluto occupato da cellule, e ciascuno dei due dipartimenti del tallone alginato è quasi del tutto identici a quelli della cartilagine nativa. Per quasi 30 giorni condrociti mantengono la loro forma sferica e producono aggrecano, proprietà idrodinamiche che sono simili a quelli di molecole aggrecano nella matrice della cartilagine articolare e collagene molecola II, IX e XI tipi. Allo stesso tempo, come altre culture, sospensioni, perline alginato sulla superficie delle cellule appiattite sono presenti che generano una piccola quantità di collagene di tipo I molecole, rilasciato direttamente nell'ambiente e non incorporato nel videoregistratore. Nelle perline di alginato si osserva una moderata proliferazione dei condrociti. Dopo 8 mesi di coltivazione in gel di alginato condrociti maturi non perdono l'attività metabolica e continua a sintetizzare tessuto-specifica collagene di tipo II e aggrecan.

N. Tanaka e coautori (1984) hanno studiato le proprietà di diffusione di varie molecole naturali nell'alginato e hanno scoperto che molecole più grandi di 70 kD non si diffondono attraverso l'alginato. Pertanto, la coltivazione di cellule nell'alginato è adatta per studiare la regolazione della biosintesi della matrice e l'organizzazione della ECM. La disponibilità di cellule coltivate nell'alginato consente di studiare l'effetto dei fattori regolatori peptidici e degli agenti farmacologici sui livelli trascrizionale, posttranscriptional e traslazionale.

I condrociti sono anche coltivati in una matrice di fibre di collagene I e II tipi. S. Nehrer e coautori (1997) hanno confrontato il funzionamento dei condrociti canini in matrici polimeriche porose di collagene-proteoglicano contenenti collageni di diverso tipo. Hanno trovato importanti differenze nella morfologia della funzione biosintetica dei condrociti coltivati in matrici di collagene contenenti i tipi di collagene I e II. Le cellule nella matrice di collagene di tipo II arrotolavano la loro forma sferica, mentre nel collagene di tipo I avevano una morfologia simile ai fibroblasti. Inoltre, nella matrice del collagene di tipo II, i condrociti producevano più glicosaminoglicani. J. Van Susante et al (1995) hanno confrontato le proprietà dei condrociti coltivati nell'alginato e nel gel di collagene (tipo I). Gli autori hanno riscontrato un aumento significativo del numero di cellule nel gel di collagene, ma dal 6 ° giorno di coltivazione le cellule hanno perso un caratteristico fenotipo, trasformandosi in cellule simili ai fibroblasti. Nel gel di alginato è stata osservata una diminuzione del numero di cellule, ma i condrociti hanno mantenuto il loro normale fenotipo. La quantità di collagene gel proteoglicani per cella era significativamente superiore nel alginato, ma la diminuzione è stata osservata nel elementi di matrice gel di sintesi, partendo dal 6 ° giorno di coltura, mentre in sintesi alginato continuato a crescere.

Una solida matrice tridimensionale di fibrina è una sostanza naturale che supporta i condrociti pesati in esso in un fenotipo differenziato. La matrice di fibrina 3D può anche essere utilizzata come supporto per il trapianto di condrociti. I vantaggi della fibrina sono l'assenza di citotossicità, la capacità di riempire lo spazio, l'abilità adesiva. Da studi istologici e biochimici, autoradiografia, microscopia elettronica, condrociti nel gel di fibrina sono stati trovati per mantenere la loro morfologia, moltiplicare e produrre una matrice anche dopo 2 settimane di coltura. Tuttavia, G. Homminga e co-autori (1993) hanno riferito che, dopo 3 giorni di coltivazione, inizia la disintegrazione della fibrina, la dedifferenziazione dei condrociti progredisce.

Sospensione di condrociti in un ECM artificiale (sintetico)

Gli impianti di cartilagine per chirurgia ricostruttiva o ortopedica possono essere ottenuti coltivando condrociti isolati in vitro in una matrice biocompatibile sintetica.

I condrociti di acido poliglicolico colto proliferano e mantengono la morfologia e il fenotipo normali entro 8 settimane. Il complesso dell'acido condrocitario-poliglicolico è costituito da cellule, glicosaminoglicani, collagene e ha una capsula di collagene esterna. Tuttavia, in tali impianti ci sono due tipi di molecole di collagene - I e II. Gli impianti dedifferenziati da una serie di passaggi di condrociti hanno un numero maggiore di glicosaminoglicani e di collageni rispetto agli impianti da condrociti principalmente indifferenziati.

L. Freed e coautori (1 993 b) hanno confrontato il comportamento delle colture di condrociti umani e di toro in acido poliglicolico fibroso (HPHC) e in acido polilattico (PPLC). Dopo 6-8 settimane di coltivazione di condrociti di toro nell'HSVG o PPLC, gli autori hanno osservato la proliferazione cellulare e la rigenerazione della matrice cartilaginea. In HSBC, i condrociti erano sferici, situati in lacune circondate da una matrice cartilaginea. Dopo 8 settimane di coltura in vitro, il tessuto rigenerato conteneva fino al 50% di sostanza secca (4% della massa cellulare, 15% di glicosaminoglicani e 31% di collagene). PPLC le cellule avevano una forma a fuso, una piccola quantità di glicosaminoglicani e collagene. Nell'HSBC, la crescita delle cellule era 2 volte più intensa rispetto alla PTCA. In condizioni in vivo, i condrociti coltivati in HPVC e PPLC da 1 a 6 mesi hanno prodotto un tessuto istologicamente simile alla cartilagine. Gli impianti contenevano glicosaminoglicani, collageni di tipo I e II.

I condrociti di toro fetale sono stati coltivati in polietilene idrofobo e idrofilo poroso ad alta densità. Dopo 7 giorni di incubazione in entrambi i substrati, le cellule hanno mantenuto una forma sferica, contenente principalmente collagene di tipo II. Dopo 21 giorni di coltivazione, si è scoperto che la matrice idrofila contiene più collagene di tipo II rispetto alla matrice idrofobica.

Il tessuto cartilagineo può anche essere ottenuto coltivando in un monostrato su filtri Millicell-CM. Il pre-rivestimento dei filtri con collagene è necessario per l'attacco di condroiti. L'esame istologico della coltura dimostra l'accumulo di condrociti nell'ECM contenente i proteoglicani e il collagene di tipo II. Il collagene di tipo I in tale coltura non viene rilevato. I condrociti nel tessuto cartilagineo risultante hanno una forma sferica, ma sulla superficie del tessuto sono un po 'appiattiti. Lo spessore del tessuto appena formato aumentava nel tempo e dipendeva dalla densità iniziale del monostrato di cellule. In condizioni di coltura ottimali, lo spessore del tessuto cartilagineo ha raggiunto i 110 μm, l'organizzazione delle sue cellule e del collagene negli strati superficiali e profondi è simile a quella della cartilagine articolare. VKM contiene circa 3 volte più collagene e proteoglicani. Dopo 2 settimane di coltivazione, è stato notato l'accumulo di matrix-sa, che ha permesso di estrarre il tessuto dal filtro e usarlo per il trapianto.

Sims ed altri (1996) studiarono la coltivazione di condrociti in una matrice polimerica incapsulata di gel di polietilene-ossido che permette ad un gran numero di cellule di essere trasportate per iniezione. Sei settimane dopo l'iniezione nel tessuto sottocutaneo di topi atimici, si formò una nuova cartilagine, che morfologicamente era caratterizzata da opalescenza bianca simile alla cartilagine ialina. I dati di studi istologici e biochimici hanno indicato la presenza di condrociti attivamente proliferanti, che producono ECM.

Espianto

L'esame del tessuto cartilagineo viene utilizzato per studiare i processi di ana- e catabolismo in esso, l'omeostasi, il riassorbimento e la riparazione. I condrociti negli espianti di tessuto cartilagineo supportano il fenotipo e la composizione normali dell'ECM, simili a quelli della cartilagine articolare in vivo. Dopo 5 giorni di coltivazione in presenza di siero, si ottiene un livello costante di sintesi e degradazione naturale. Riassorbimento può accelerare coltura tissutale e nella cultura principale con l'aggiunta di siero utilizzando un numero di agenti, per esempio, IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, derivati dell'acido retinoico o radicali di ossigeno attivo. Per studiare la riparazione della cartilagine, il suo danno è indotto dai mediatori solubili dell'infiammazione (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) o dalla rottura fisica della matrice.

Il metodo delle colture organotipiche è un modello per studiare gli effetti in vitro di fattori esterni isolati sui condrociti e sulla matrice circostante. In vivo, i condrociti si trovano raramente nell'ECM e non si contattano l'un l'altro. La cultura della cartilagine articolare espiantata mantiene questa organizzazione strutturale, così come le particolari interazioni tra i condrociti e il loro ambiente extracellulare circostante. Questo modello è anche usato per studiare l'effetto dello stress meccanico, agenti farmacologici, fattori di crescita, citochine, ormoni sul metabolismo della cartilagine.

Un altro vantaggio dell'espianto di tessuto cartilagineo è l'assenza di danno condrocitario da parte di enzimi proteolitici o un fattore meccanico, che è inevitabile quando le cellule sono isolate. I recettori e altre proteine di membrana e glicoproteine sono protetti da fattori dannosi.

[17], [18], [19], [20], [21]

Cultura dei condroni

Chondron è un'unità strutturale, funzionale e metabolica della cartilagine articolare, costituita da un condrocita, la sua matrice pericellulare e una capsula a filamenti compatti, ed è responsabile dell'omeostasi della matrice. I condroni vengono estratti meccanicamente dalla cartilagine e raccolti da diverse successive omogeneizzazioni a bassa velocità. Isolata dalle zone di diversa profondità cartilagine hondrony può essere suddiviso in quattro categorie: singola hondron, hondrony doppia, multipla (tre o più) hondrony linearmente disposti (colonna hondronov) congestione hondronov.

I condroni singoli si trovano solitamente negli strati intermedi della cartilagine intatta, accoppiati - sul bordo degli strati medi e profondi, i condri multipli posizionati linearmente sono tipici degli strati profondi della cartilagine intatta. Infine, i cluster di condroni consistono in gruppi organizzati casualmente di condoni singoli e accoppiati che mantengono lo stato aggregato dopo l'omogeneizzazione. Gli accumuli di condroni sono grandi frammenti di cartilagine, di solito contenenti diversi condroni e fibrille di collagene radialmente localizzate, cioè una caratteristica tipica dell'organizzazione degli strati profondi della matrice. I condri sono immobilizzati in un agarosio trasparente, che consente di studiare la loro struttura, la composizione molecolare e l'attività metabolica. Il sistema chondron - agarosio è considerato un micromodello di cartilagine, che differisce dal tradizionale sistema di agarosio condrocitario in quanto viene mantenuto un microambiente naturale, non è necessario eseguire la sua sintesi e il suo assemblaggio. La cultura dei condroni è un modello per lo studio delle interazioni tra cellule e matrice nella cartilagine articolare in condizioni normali e patologiche.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Cultura di condrociti immortali

Per creare linee cellulari permanenti, vengono utilizzati DNA ricombinante o virus contenenti oncogeni che possono rendere la cellula "immortale". I condrociti immortali hanno la capacità di proliferazione infinita, mantenendo un fenotipo stabile. F. Mallein-Gerin et al (1995) hanno dimostrato che l'oncogene è proliferazione SV40T indotta di condrociti topo che quindi continuano ad esprimere stabilmente il collagene II, IX e XI tipi, così come proteina comune e aggrecan vincolante. Tuttavia, tale linea cellulare acquisisce la capacità di sintetizzare il collagene di tipo I quando coltivata in una coltura monostrato o in un gel di agarosio.

W. Horton e co-autori (1988) descrissero una linea di cellule immortali con un basso livello di espressione di mRNA di tipo II di collagene. Queste cellule sono state ottenute trasformandole con un retrovirus di topo contenente I-myc- e y-ra-oncogeni. Questo tipo di cellule è un modello unico per lo studio delle interazioni della matrice articolare in assenza di collagene di tipo II, nonché per la regolazione della sintesi del collagene di tipo II.

La coltura di condropiti con geni mutati o cancellati è un modello conveniente per studiare la loro funzione fisiologica. Questo modello è particolarmente adatto per studiare il ruolo di molecole specifiche in organizzazioni a matrice di cartilagine o studiare gli effetti di vari fattori normativi sul metabolismo della cartilagine. I condrociti gene remota sintetizzato tipo collagene collagene IX fibrille più ampio rispetto al normale, indicando che il collagene di tipo IX regola il diametro delle fibrille. Come notato nel Capitolo 1, è stata recentemente rilevata una mutazione del gene COLAI che codifica per il collagene di tipo II in famiglie con osteoartrosi generalizzata primaria. Per studiare l'effetto di mutante collagene di tipo II nella matrice articolare R. Dharmrvaram et al (1997) eseguita trasfezione ( "contaminazione" un acido nucleico estraneo) difettoso COL ₂ AI (arginina in posizione 519 è sostituita da cisteina) in condrociti fetali umani in vitro.

Sistema di coculture. Nell'articolazione, la cartilagine interagisce con le cellule di altri tipi contenute nella membrana sinoviale, nel liquido sinoviale, nei legamenti, nell'osso subcondrale. Il metabolismo dei condrociti può essere influenzato da vari fattori solubili sintetizzati da queste cellule. Quindi, la cartilagine articolare dell'artrite viene distrutta dagli enzimi proteolitici e dai radicali liberi, che sono prodotti dalle cellule sinoviali. Pertanto, i modelli sono stati sviluppati per studiare interazioni complesse tra cartilagine e tessuti circostanti, che sono chiamati coculture.

S. Lacombe-Gleise ed altri (1995) erano condrociti coltivati coniglio e osteoblasti nel sistema di co-coltura (Costar), in cui le cellule sono state separate membrana microporosa (0,4 micron) consente lo scambio tra i due tipi di cellule senza alcun contatto diretto. Questo studio ha dimostrato la capacità degli osteoblasti di stimolare la crescita dei condrociti attraverso i mediatori solubili.

AM Malfait e co-autori (1994) hanno studiato la relazione tra monociti di sangue periferico e condrociti. Questo modello è utile per studiare i processi mediati dalle citochine, nelle artropatie infiammatorie (artrite reumatoide, spondilite sieronegativa, ecc.). Gli autori del modello hanno separato le cellule da una membrana legante le proteine con pori di 0.4 μm di diametro. Lo studio ha trovato che i monociti lipopolisaccaride stimolate elaborati iFNO IL-1-a, che inibisce la sintesi di condrociti aggrecano e contribuito alla degradazione degli aggregati aggrecano già sintetizzati.

K. Tada et al (1994) creato un modello di co-coltura in cui le cellule endoteliali in collagene (I-type) gel sono stati messi nella camera interna della camera esterna separata da condrociti posti in un filtro con una dimensione dei pori di 0,4 micron. In uno stato di completo isolamento dalla camera esterna, le cellule endoteliali umane formavano tubi in un gel di collagene in presenza di EGF o TGF-a. Con la coltivazione simultanea di entrambi i tipi di cellule TGF, la formazione dipendente dei tubi da parte delle cellule endoteliali è stata inibita. L'inibizione del condrocita di questo processo è stata parzialmente eliminata dagli anticorpi anti-TGF-beta. Si può presumere che il TGF-beta prodotto dai condrociti deprima la vascolarizzazione della cartilagine stessa.

S. Groot e coautori (1994) coltivavano simultaneamente i condrociti dalle zone ipertrofiche e proliferative dell'osso di un topo fetale di 16 giorni con frammenti di tessuto cerebrale. Dopo 4 giorni di coltura, sono stati osservati transdifferenziazione dei condrociti negli osteoblasti e l'insorgenza della formazione di osteoidi. Dopo 11 giorni di coltivazione, una parte della cartilagine è stata sostituita da tessuto osseo e la matrice ossea è stata parzialmente calcificata. Alcuni neuropeptidi e neurotrasmettitori prodotti dal tessuto cerebrale, influenzano il metabolismo degli osteoblasti o hanno recettori su di essi. Tra questi, la norepinefrina, il peptide intestinale vasoattivo, il peptide associato al gene della calcitonina, la sostanza P e la somatostatina possono essere isolati . Colti con condrociti, pezzi di tessuto cerebrale possono produrre alcuni di questi fattori, che possono indurre il processo di transdifferenziazione dei condrociti negli osteoblasti.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

L'influenza di fattori esterni sulla cultura dei condrociti

L'effetto della tensione dell'ossigeno sul metabolismo dei condrociti

Nella maggior parte dei casi, le colture di condrociti si sviluppano in condizioni di tensione dell'ossigeno atmosferico. Tuttavia, è noto che i condrociti in vivo esistono in condizioni ipossiche e la tensione dell'ossigeno varia a seconda delle diverse condizioni patologiche. Durante il processo di maturazione, si osservano cambiamenti significativi nel flusso sanguigno delle epifisi. Poiché la vascolarizzazione varia in diverse aree della piastra di crescita, varia anche la tensione dell'ossigeno in esse. C. Brighton e R. Heppenstall (1971) hanno dimostrato che nella placca della tibia nei conigli, la tensione dell'ossigeno nella zona ipertrofica è inferiore a quella della cartilagine circostante. Le misurazioni di alcuni parametri metabolici hanno mostrato che i condrociti sono in grado di reagire rapidamente ai cambiamenti locali nella concentrazione di ossigeno. Prima di tutto, con una bassa tensione di ossigeno, il suo consumo di condrociti diminuisce. Con una diminuzione della tensione dell'ossigeno dal 21 allo 0,04%, l'utilizzo del glucosio aumenta, l'attività dell'enzima glicolitico e la sintesi dell'acido lattico aumentano. Anche con una bassa tensione di ossigeno, la quantità assoluta di ATP, ADP e AMP rimane stabile. Questi dati indicano la direzionalità del metabolismo dei condrociti per massimizzare il risparmio energetico. Tuttavia, l'attività sintetica, e quindi i processi di riparazione, cambiano in condizioni di ipossia.

L'alta tensione dell'ossigeno influenza anche il metabolismo dei condrociti, causando una diminuzione della sintesi di proteoglicani e del DNA, la degradazione della matrice della cartilagine. Questi effetti, di regola, sono accompagnati dalla produzione di radicali liberi dell'ossigeno.

Influenza della concentrazione di ioni e pressione osmotica dell'ambiente sulla funzione dei condrociti

Nella cartilagine nativa, la concentrazione di ioni differisce significativamente da quella degli altri tessuti: il contenuto di sodio nel mezzo extracellulare è 250-350 mmol, e la sua osmolarità è 350-450 mosmol. Quando si isola condrociti da un videoregistratore e di incubazione in un supporto standard (DMEM (Minimal Essential Media Dulbecco - mezzo essenziale minimo di Dulbecco) osmolarita - 250-280,7 mOsm) cambia bruscamente che circonda l'ambiente della cellula. Inoltre, la concentrazione di calcio e potassio nei mezzi standard è molto inferiore rispetto al tessuto nativo e la concentrazione di anioni è molto più alta.

L'aggiunta di saccarosio al mezzo porta ad un aumento della sua osmolarità e induce un aumento intracellulare transitorio della concentrazione di H ⁺ e anioni di calcio nel citosol. Tali cambiamenti intracellulari possono influenzare i processi di differenziamento dei condrociti e la loro attività metabolica. J. Urban ed altri (1993) trovarono che l'incorporazione di ³⁵ 8-solfato e ³ H-prolina con condrociti isolati incubati in terreno DMEM standard per 2-4 ore era solo il 10% di quello nel tessuto nativo. L'intensità della sintesi ha raggiunto il massimo con osmolarità del mezzo extracellulare di 350-400 mosmol sia nei condrociti appena isolati che negli espianti del tessuto cartilagineo. Inoltre, il volume dei condrociti è aumentato del 30-40% dopo aver posizionato cellule isolate in un mezzo DMEM standard di detta osmolarità. Tuttavia, nella coltivazione dei condrociti sotto osmolarità non fisiologica per 12-16 ore, le cellule si adattano a nuove condizioni, riducendo l'intensità della biosintesi in proporzione all'osmolarità del mezzo extracellulare.

P. Borgetti et al (1995) hanno studiato l'effetto della osmolarità del mezzo extracellulare sulla crescita, la morfologia e la biosintesi di condrociti suina. Gli autori hanno dimostrato caratteristiche biochimiche e morfologiche simili di condrociti coltivati in terreni con osmolarità di 0,28 e 0,38 di mosmolo. Quando 0,48 mOsm osmolarità del fluido durante le prime 4-6 ore di coltura è stata osservata diminuzione della proliferazione cellulare e la sintesi proteica, ma successivamente verificato ripristinare questi parametri che eventualmente hanno raggiunto i valori di controllo. Quando coltura di condrociti in un mezzo con cellule osmolarità 0,58 mOsm perdere la loro capacità di supportare intensità fisiologica processi proliferativi e dopo 6 giorni il numero di condrociti è significativamente ridotta. Con osmolarità del mezzo, 0,58 mosmol, si osserva una profonda inibizione della sintesi proteica. Inoltre, quando coltivate in mezzi con un'osmolarità mOsm 0,28-0,38 condrociti conservano fenotipo fisiologico ad un'osmolarità superiore (mOsm 0,48-0,58) cambiamenti significativi nella morfologia cellulare, come perdita manifestato fenotipo caratteristico condrociti conversione in cellule simili ai fibroblasti, oltre alla perdita di cellule, la capacità di assemblare i proteoglicani della matrice. I risultati di questo studio indicano la capacità dei condrociti di rispondere alle limitate oscillazioni dell'osmolalità nell'ambiente extracellulare.

Il cambiamento nella concentrazione di altri ioni può anche influenzare i processi di biosintesi nei condrociti. Pertanto, il grado di inclusione di ³⁵ S (solfato) aumenta della metà con un aumento della concentrazione di ioni di potassio da 5 mmoli (concentrazione in un mezzo DM DM standard) a 10 mmol (concentrazione in VKM in vivo). La concentrazione di calcio inferiore a 0,5 mmol ha contribuito alla produzione di collagene da parte di condrociti di toro maturi, mentre una concentrazione di 1-2 mmoli (corrispondente alla concentrazione nel mezzo DM DM standard) ha causato una significativa riduzione della sintesi del collagene. È stato osservato un moderato aumento della biosintesi a livelli elevati di calcio (2-10 mmoli). Vari cationi partecipano all'attaccamento dei condrociti alle proteine VKM. Quindi, gli ioni di magnesio e manganese forniscono l'attaccamento alla fibronectina e al collagene di tipo II, mentre gli ioni di calcio non partecipano all'attaccamento dei condrociti alle proteine. Pertanto, i risultati degli studi descritti indicano l'influenza dei cambiamenti negli ioni extracellulari di potassio, sodio, calcio e osmolarità del mezzo sulla funzione biosintetica dei condrociti incubati in mezzi standard.

L'influenza dello stress meccanico sul metabolismo dei condrociti

L'immobilizzazione dell'articolazione causa un'atrofia reversibile della cartilagine, che indica la necessità di stimoli meccanici per il normale decorso dei processi metabolici nell'ECM. Nella maggior parte dei casi, i modelli di colture cellulari utilizzati esistono in normali condizioni di pressione atmosferica. M. Wright e coautori (1996) hanno dimostrato che l'ambiente meccanico influisce sul metabolismo dei condrociti, la risposta delle cellule dipende dall'intensità e dalla frequenza del carico di compressione. Esperimenti con carico su espianti di cartilagine articolare intatta in vitro hanno dimostrato una diminuzione della sintesi di proteine e proteoglicani sotto l'azione di un carico statico, mentre il carico dinamico stimola questi processi. I meccanismi esatti per la realizzazione dell'effetto del carico meccanico sulla cartilagine sono complessi e probabilmente correlati alla deformazione cellulare, alla pressione idrostatica, alla pressione osmotica, al potenziale elettrico e ai recettori cellulari superficiali alle molecole della matrice. Per studiare l'effetto di ciascuno di questi parametri, è necessario creare un sistema in cui un parametro può essere variato indipendentemente. Ad esempio, una coltura espiantata non è adatta per studiare la deformazione cellulare, ma può essere utilizzata per studiare l'effetto complessivo della pressione sull'attività metabolica dei condrociti. Compressione della cartilagine porta alla cella deformazione, e anche accompagnata dalla presenza di gradiente idrostatico di pressione, potenziale elettrico, e il flusso di fluido cambiamento fisico-fattori quali il contenuto di acqua nella matrice, la densità di carica elettrica, il livello di pressione osmotica. La deformazione cellulare può essere studiata utilizzando condrociti isolati immersi in un gel di agarosio o collagene.

Diversi sistemi sono stati sviluppati per studiare l'effetto della stimolazione meccanica sulla coltura dei condrociti. Alcuni ricercatori usano sistemi per questo scopo in cui la pressione viene applicata alla coltura cellulare attraverso la fase gassosa. Ad esempio, JP Veldhuijzen et al (1979) utilizzando una pressione superiore a quella atmosferica di 13 kPa a bassa frequenza (0,3 Hz) durante 15 minuti, osservato un aumento della sintesi di cAMP e proteoglicani e abbassando la sintesi del DNA. R. Smith et al (1996) hanno dimostrato che l'esposizione intermittente di colture primarie di condrociti toro pressione idrostatica (10 MPa) a 1 Hz per 4 ore causato l'aumento della sintesi di aggrecano e collagene di tipo II, mentre la pressione costante ha avuto alcun effetto su questi processi. Utilizzando un sistema simile M. Wright et al (1996) hanno riportato che la pressione ciclica sulla coltura cellulare è associata con iperpolarizzazione della membrana cellulare dei condrociti e attivazione di Ca ²⁺ canali del potassio -dipendente. Pertanto, gli effetti della pressione ciclica sono mediati dai canali ionici, attivati dallo stiramento, nella membrana del condrocita. La risposta dei condrociti alla pressione idrostatica dipende dalle condizioni della coltura cellulare e dalla frequenza del carico applicato. Così, ciclico pressione idrostatica (5 MPa) riduce l'incorporazione di solfato in condrociti monostrato ad una frequenza di 0,05, 0,25 e 0,5 Hz, mentre per frequenze superiori a 0,5 Hz inclusione solfato aumenta espianto cartilagine.

M. Bushmann ed altri (1992) riportarono che i condrociti in un gel di agarosio alterano la biosintesi in risposta ad un carico meccanico statico e dinamico allo stesso modo di un organo intatto colto. Gli autori hanno scoperto che il carico meccanico genera uno stimolo iperosmotico seguito da una diminuzione del pH nei condrociti.

L'effetto dello stiramento meccanico può essere studiato su una coltura di cellule immerse in un gel. La forza di allungamento può essere creata usando un aspirapolvere controllato da computer. Quando il sistema è in un vuoto di un certo grado, il fondo della capsula di Petri con la coltura cellulare viene esteso di una certa quantità, la deformazione è massima ai bordi del fondo della tazza ed è minima al centro. Lo stretching viene trasmesso e coltivato in una capsula di Petri di condrociti. Con questo metodo, Holm-vall K. Et al (1995) hanno mostrato che coltivate in collagene (II) tipo cellule gel condrosarcoma aumentato l'espressione di mRNA e ₂ -integrina. E ₂ p _g integrina è in grado di legarsi al collagene di tipo II. È considerato come un meccanorecettore, dal momento che interagisce con le proteine leganti l'actina, collegando in tal modo l'ECM e il citoscheletro.

Effetto del pH sul metabolismo dei condrociti

Il pH del liquido interstiziale della ECM del tessuto cartilagineo è più acido rispetto ad altri tessuti. A. Maroudas (1980) ha determinato il pH della cartilagine articolare a 6.9. W. Diamant e co-autori (1966) hanno trovato un pH di 5,5 in condizioni patologiche. È noto che i condrociti vivono a PO2 bassa, il che indica il ruolo importante della glicolisi (il 95% del metabolismo totale del glucosio) nel metabolismo di queste cellule; la glicolisi è accompagnata dalla produzione di una grande quantità di acido lattico.

Oltre all'acidificazione dell'ambiente da parte dei prodotti della glicolisi, i componenti della matrice stessi sono di grande importanza. Un gran numero di carica negativa fissa sulle proteoglicani extracellulari modifica la composizione ionica: c'è un'alta concentrazione di cationi liberi (ad esempio H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) e bassa concentrazione di anioni (per esempio, O2, NPHS). Inoltre, sotto l'influenza di un carico meccanico, l'acqua viene espulsa dall'ECM, il che porta ad un aumento della concentrazione di cariche negative fisse e all'attrazione di più cationi alla matrice. Ciò è accompagnato da una diminuzione del pH del mezzo extracellulare, che influenza il pH intracellulare, modificando in tal modo il metabolismo dei condrociti. R. Wilkin e A. Hall (1995) hanno studiato l'effetto del pH del mezzo extracellulare e intracellulare sulla biosintesi della matrice da parte di condrociti di toro isolati. Hanno osservato una doppia modifica della sintesi della matrice con una diminuzione del pH. Una leggera diminuzione del pH (7,4 35 S0 ₄ e ³ H-prolina in condrociti, che acidificazione profondo (pH <7,1) inibisce la sintesi del 75% rispetto ai controllo. La creazione dello stesso pH basso (6,65) con ioni ammonio ha causato una diminuzione della sintesi della matrice solo del 20%. I risultati ottenuti indicano che la modifica del pH del mezzo di sintesi della matrice extracellulare non può essere spiegata solo da variazioni del pH del mezzo intracellulare. Inoltre, condrociti possiedono la capacità di regolare il pH intracellulare da Na ⁺, H ⁺ scambiatore, Ca ⁺ -dipendente C1 ^_ -NSOZ -TRASPORTATRICI e H ⁺ / ATPasi.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Effetto della composizione del terreno per la coltivazione sul metabolismo dei condrociti

Il mezzo per coltivare i condrociti deve corrispondere alle condizioni sperimentali. Negli ultimi anni, il siero di vitello è stato utilizzato per ottimizzare le condizioni di coltura. Tuttavia, quando si utilizza il siero, devono essere presi in considerazione diversi punti importanti:

• crescita esterna delle cellule dalla periferia del tessuto nelle colture di organi,
• la variabilità della composizione dei sieri di varie serie,
• presenza di componenti sconosciuti in essi,
• aumento del rischio di interferenza, artefatti nello studio dell'influenza di vari fattori biologici sull'attività metabolica delle cellule.

Un esempio di quest'ultimo è lo studio dell'effetto di EGF sui condrociti cartilaginei nei ratti. L'EGF ha stimolato l'incorporazione di ³ H-timidina e un aumento del contenuto di DNA nella coltura. Questo effetto era più pronunciato a basse concentrazioni sieriche (<1%), ma a concentrazioni elevate (> 7,5%) l'effetto scompariva.

È noto che i livelli di sintesi e degradazione del DMEM arricchiti con siero di vitello sono significativamente aumentati rispetto alle condizioni in vivo. Le differenze tra il metabolismo in vivo e in vitro possono essere causate da differenze tra il liquido sinoviale e l'ambiente in cui le cellule sono coltivate. D. Lee ed altri (1997) coltivarono condrociti di giovani tori in agarosio usando un mezzo nutriente contenente DMEM arricchito con 20% di siero di vitello e una grande quantità di normale liquido sinoviale allogenico. La presenza di fluido sinoviale nel terreno ha indotto un aumento del numero di proteoglicani, fino all'80% della quantità totale di liquido sinoviale. I risultati ottenuti indicano che il liquido sinoviale in coltura induce un tasso metabolico simile a quello in vivo, con un alto livello di sintesi di glicosaminoglicani e un basso livello di divisione cellulare.

G. Verbruggen et al (1995) hanno dimostrato che la sintesi di ³⁵ S-arrpeKaHa condrociti umani coltivati in agarosio in DMEM senza siero è stata del 20-30% del livello di sintesi osservato in DMEM, integrato con il 10% di siero di vitello. Gli autori hanno determinato la misura in cui IGF-1, IGF-2, TGF-P o insulina ripristinano la produzione di aggrecan in terreni senza siero. Gli autori hanno concluso che il 100 ng insulina / ml, IGF-1 e IGF-2 sintesi parzialmente ridotto di aggrecan al 39-53% dei livelli di controllo. Con una combinazione di questi fattori, non sono stati identificati fenomeni sinergici o cumulativi. Allo stesso tempo, 10 ng / ml di TGF-P in presenza di 100 ng insulina / ml stimolato sintesi di aggrecan al 90% o più del livello di riferimento. Infine, la transferrina sierica, da sola o in combinazione con insulina, non ha influenzato la sintesi di aggrecan. Quando il siero di vitello è stato sostituito con albumina di siero bovino, il contenuto aggregato di aggrecan è stato significativamente ridotto. L'arricchimento del mezzo per la coltura di insulina, IGF o TGF-P ha parzialmente ripristinato la capacità delle cellule di produrre aggregati aggrecani. In questo caso, l'IGF-1 e l'insulina sono in grado di mantenere l'omeostasi in colture cellulari. Dopo 40 giorni di coltura in terreno addizionato con 10-20 ng / ml IGF-1, la sintesi dei proteoglicani è stata mantenuta allo stesso livello o addirittura superiore in confronto con terreno contenente 20% di siero di vitello. Processi catabolici procedevano lentamente in terreno supplementato con IGF-1 che nel mezzo integrato con soluzione di albumina 0,1%, ma alquanto più velocemente in mezzo integrato con il 20% di siero. Nelle colture a lunga conservazione, 20 ng / ml IGF-1 mantiene uno stato stabile di cellule.

D. Lee et al (1993) hanno confrontato l'effetto della composizione del terreno di coltura (DMEM, DMEM + 20% siero di vitello, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) sulla sintesi di DNA in una cultura di espianto cartilagine, coltura monostrato e in sospensione in agarosio . Quando coltivati in agarosio in presenza di siero, gli autori hanno osservato una tendenza a raggruppare i condrociti in grandi gruppi. Le cellule coltivate senza siero o con IGF-1 venivano conservate in un agarosio di forma rotonda, assemblate in piccoli gruppi, ma non formavano grandi aggregati. Nel monostrato, la sintesi del DNA era significativamente più alta nei media contenenti siero rispetto al mezzo arricchito con IGF-1; La sintesi del DNA nel secondo era molto più alta che nell'ambiente non arricchito. Quando coltura di condrociti in sospensione in agarosio in terreno non concentrata e in un mezzo con IGF-1, nessuna differenza nella sintesi del DNA. Allo stesso tempo la poltiglia coltura di condrociti in agarosio in terreno supplementato con siero, è stato accompagnato da una maggiore incorporazione di radionuclidi ³ H-timidina rispetto ad altri ambienti.

La vitamina C è necessaria per l'attivazione degli enzimi coinvolti nella formazione di una struttura a spirale stabile di fibrille di collagene. I condrociti, carenti rispetto all'acido ascorbico, sintetizzano i precursori non elicoidali sottogenidrati del collagene, che vengono lentamente secreti. L'introduzione di acido ascorbico (50 μg / ml) provoca l'idrossilazione dei tipi di collagene II e IX e la loro secrezione in quantità normali. L'aggiunta di vitamina C non ha influenzato il livello di sintesi dei proteoglicani. Di conseguenza, la secrezione di collagene è regolata indipendentemente dalla secrezione di proteoglicani.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]