Il ruolo degli enzimi e delle citochine nella patogenesi dell'osteoartrite

Negli ultimi anni, una grande quantità di ricerche si è concentrata sull'identificazione delle proteasi responsabili della degradazione della ECM della cartilagine articolare nell'osteoartrosi. Secondo le idee moderne, un ruolo importante nella patogenesi dell'osteoartrosi è svolto dalle metalloproteasi della matrice (MMP). I pazienti con osteoartrite hanno un livello aumentato di tre rappresentanti di MMP - collagenasi, stromelisina e gelatinasi. Collagenasi è responsabile per la degradazione del collagene nativo, stromelisina - collagene di tipo IV, laminina e proteoglicani, azhelatinaza - per la degradazione di gelatina, collagene IV, XI tipi Vh elastina. Inoltre, presuppone l'esistenza di un altro enzima - aggrecanase che ha proprietà MMP ed è responsabile per la proteolisi di cartilagine aggregati di proteoglicani.

La cartilagine articolare di collagenasi umani identificato tre tipi di livelli che sono elevati in pazienti con osteoartrite - collagenasi-1 (MMP-1), collagenasi-2 (MMP-8), collagenasi-3 (MMP-13). La coesistenza di tre diversi tipi di collagenasi nella cartilagine articolare indica che ognuno di essi svolge il proprio ruolo specifico. Infatti, la collagenasi-1 e -2 sono localizzate principalmente nella zona intermedia superficiale e superiore della cartilagine articolare, mentre collagenasi-3 si trova nella parte inferiore delle zone intermedie e profonde. Inoltre, i risultati di studi immunoistochimici hanno dimostrato che, durante la progressione del livello osteoartrosi collagenasi-3 raggiunge un plateau o anche diminuisce, mentre il livello di collagenasi-1 è gradualmente aumentata. Ci sono prove che per l'artrosi collagenasi-1 è principalmente coinvolto nel processo infiammatorio nella cartilagine articolare, mentre la collagenasi-3 - nel rimodellamento tissutale. La cartilagine-3, espressa nella cartilagine dei pazienti con OA, degrada il collagene di tipo II più intensamente della collagenasi-1.

Dei rappresentanti del secondo gruppo metalloproteasi stromelizinovu umano identificato come tre - stromelisina-1 (MMP-3), stromelisina-2 (MMP-10) e stromelisina-3 (MMP-11). Oggi è noto che solo la stromelisina-1 è coinvolta nel processo patologico nell'osteoartrosi. Nella membrana sinoviale di pazienti con osteoartrosi non sono determinati stromelisina-2, ma si trova in piccolissime quantità nei fibroblasti sinoviali di pazienti con artrite reumatoide. Stromelysin-3 si trova anche nella membrana sinoviale dei pazienti con artrite reumatoide vicino ai fibroblasti, specialmente nelle zone di fibrosi.

Nel gruppo di gelatinasi in tessuto cartilagineo umano identificato solo due - 92 kDa gelatinasi (gelatinasi B, o MMP-9) e 72 kDa gelatinasi (gelatinasi A, o MMP-2); nei pazienti con osteoartrosi viene determinato un aumento del livello di gelatinasi 92 kD.

Non molto tempo fa, è stato identificato un altro gruppo di MMP che sono localizzati sulla superficie delle membrane cellulari e sono chiamati tipo di membrana MMP (MMP-MT). A questo gruppo appartengono quattro enzimi - MMP-MT1-MMP-MT-4. L'espressione MMP-MT si trova nella cartilagine articolare umana. Sebbene MMP-MT-1 possieda le proprietà della collagenasi, sia MMP-MT-1 che MMP-MT-2 sono in grado di attivare gelatinase-72 kD e collagenasi-3. Il ruolo di questo gruppo di MMP nella patogenesi dell'OA richiede un raffinamento.

Le proteine sono secrete sotto forma di zimogeno, che viene attivato da altre proteinasi o composti organici di mercurio. L'attività catalitica di MMP dipende dalla presenza di zinco nella zona attiva dell'enzima.

L'attività biologica di MMP è controllata da TIMP specifici. Ad oggi, sono stati identificati tre tipi di TIMP che si trovano nei tessuti articolari umani, TIMP-1-TIMP-3. Il quarto tipo di TIMP viene identificato e clonato, ma non è ancora stato rilevato nei tessuti articolari umani. Queste molecole si legano specificatamente al sito attivo di MMP, anche se alcuni di loro sono in grado di legarsi al sito attivo di 72 kDa progelatinasi (TIMP-2, -3, -4) e 92 kDa progelatinasi (TIMP-1 e -3). I dati indicano che con OA nella cartilagine articolare c'è uno squilibrio tra MMP e TIMP, che si traduce in una relativa carenza di inibitori, che può essere in parte dovuto ad un aumento del livello di MMP attiva nel tessuto. TIMP-1 e -2 si trovano nella cartilagine articolare, sono sintetizzati dai condrociti. Con l'osteoartrosi nella membrana sinoviale e nel liquido sinoviale, è stato rilevato solo il primo tipo di TIMP. TIMP-3 viene rilevato esclusivamente nell'ECM. TIMP-4 ha una sequenza aminoacidica identica con TIMP-2 e-ZIN di quasi il 38% -STIMP-1. In altre cellule bersaglio, TIMP-4 è responsabile della modulazione dell'attivazione della progestogenasi 72 kD sulla superficie cellulare, che indica un ruolo importante come regolatore tissutale del rimodellamento ECM.

Un altro meccanismo per controllare l'attività biologica di MMP è la loro attivazione fisiologica. Si ritiene che gli enzimi della famiglia delle proteasi di serina e cisteina, come AP / plasmina e catepsina B, siano rispettivamente attivatori fisiologici di MMP. Nella cartilagine articolare dei pazienti con osteoartrite, è stato rilevato un livello elevato di urochinasi (UAP) e plasmina.

Nonostante il fatto che diversi tipi di catepsine si trovano nei tessuti articolari, la catepsina-B è considerata l'attivatore più probabile di MMP nella cartilagine. Nei tessuti dell'articolazione umana sono stati rilevati inibitori fisiologici della serina e delle proteasi della cisteina. L'attività dell'inibitore AP-1 (IAP-1), così come le proteasi della cisteina, è ridotta nei pazienti con osteoartrite. Analogamente a MMP / TIMP, è lo squilibrio tra serina e proteasi cisteina e i loro inibitori che possono spiegare l'aumentata attività MMP nella cartilagine articolare di pazienti con osteoartrosi. Inoltre, i MMP sono in grado di attivarsi a vicenda. Ad esempio, stromelysin-1 attiva collagenasi-1, collagenasi-3 e gelatinasi 92 kD; Collagenasi-3 attiva la gelatinasi 92 kD; MMP-MT attiva la collagenasi-3 e la gelatinasi-72 kD potenzia questa attivazione; MMP-MT attiva anche gelatinasi 72 kD. Le citochine possono essere suddivise in tre gruppi: distruttivi (pro-infiammatori), regolatori (inclusi anti-infiammatori) e anabolizzanti (fattori di crescita).

Tipi di citochine (secondo van den Berg WB et al)

Distruttivo	L'interleuchina-1 TNF-alfa Fattore inibitorio leucemico L'interleuchina-17
Normativo	L'interleuchina-4 L'interleuchina-10 L'interleuchina-13 Inibitori di enzimi
Anabolico	Fattori di crescita simili a Msulin TFR-b Proteine morfogenetiche dell'osso Proteine morfogenetiche derivate dalla cartilagine

Citochine distruttive, in particolare IL-1 indotto aumento del rilascio di proteasi e inibiscono la sintesi di proteoglicani e collageni condrociti. Citochine normativi, in particolare IL-4 e -10, inibiscono la produzione di IL-1 antagonista del recettore, per aumentare la produzione di IL-1 (IL-1 RA), e ridurre il livello di attività e NO-sintasi in condrociti. Così, IL-4 antagonizes IL-1 in tre modi: 1) riduce la produzione e previene gli effetti, 2) aumenta la produzione di "scavenger" basic IL-1Pa e 3) riduce la produzione di primaria "messaggero secondario» NO. Inoltre, IL-4 riduce la degradazione del tessuto enzimatico. In condizioni in vivo, l' effetto terapeutico ottimale si ottiene con la combinazione di IL-4 e IL-10. Fattori anabolizzanti, come kakTFR-p e IGF-1, non interferisce in realtà con la produzione o l'azione di IL-1, ma che mostra l'attività opposto, per esempio, stimolano la sintesi di proteoglicani e collagene, inibiscono l'attività della proteasi e TGF (3, inibisce anche il rilascio di enzimi e stimola i loro inibitori.

Le citochine proinfiammatorie sono responsabili della maggiore sintesi ed espressione della MMP nei tessuti articolari. Sono sintetizzati nella membrana sinoviale e quindi diffusi nella cartilagine articolare attraverso il liquido sinoviale. Le citochine proinfiammatorie attivano i condrociti, che a loro volta sono anche in grado di produrre citochine pro-infiammatorie. Nelle articolazioni affette da osteoartrosi, il ruolo dell'effettore dell'infiammazione è giocato principalmente dalle cellule della membrana sinoviale. È la sinovite del tipo di macrofagi che secernono le proteasi e i mediatori dell'infiammazione. Tra questi, nella patogenesi dell'osteoartrosi, IL-f, TNF-a, IL-6, fattore inibitorio leucemico (LIF) e IL-17 sono coinvolti nella misura massima.

Sostanze biologicamente attive che stimolano la degradazione della cartilagine articolare nell'osteoartrite

• L'interleuchina-1
• L'interleuchina-3
• L'interleuchina-4
• TNF-alfa
• Fattori stimolanti le colonie: macrofagi (monociti) e granulociti-macrofagi
• Sostanza P
• PGE ₂
• Attivatori del plasminogeno (tipi di tessuto e urochinasi) e plasmina
• Metalloproteasi (collagenasi, ellastasi, stromelisine)
• Catepsine A e B
• thriller
• Lipopolisaccaridi batterici
• Fosfolipasi Ag

I dati della letteratura indicano che IL-ip e, possibilmente, TNF-a, sono i principali mediatori della distruzione dei tessuti articolari nell'osteoartrite. Tuttavia, non è ancora noto se operino indipendentemente l'uno dall'altro o che esista una gerarchia funzionale tra di essi. Sui modelli di osteoartrite in animali è stato dimostrato che IL-1 blocco impedisce efficacemente la distruzione della cartilagine articolare, mentre il blocco di TNF-alfa comporta un indebolimento di infiammazione dei tessuti articolari. Nella membrana sinoviale, nel liquido sinoviale e nella cartilagine dei pazienti, sono state rilevate maggiori concentrazioni di entrambe le citochine. I condrociti sono in grado di aumentare la sintesi non solo proteasi (MMP e soprattutto AP), ma anche collageni minori come tipo I e III, nonché ridurre la sintesi di collagene di tipo II e IX e proteoglicani. Queste citochine stimolano anche le specie di ossigeno attivo e i mediatori dell'infiammazione come la PGE ₂. Il risultato di tali cambiamenti macromolecolari nella cartilagine articolare in osteoartrite è processi di riparazione inefficaci, che porta ad ulteriore degradazione della cartilagine.

Le citochine proinfiammatorie summenzionate modulare i processi di depressione / attivazione delle MMPs in osteoartrite. Ad esempio, lo squilibrio tra i livelli di TIMP-1 e MMP nella cartilagine nell'osteoartrite può essere mediata da IL-ip, perché lo studio in vitro hanno dimostrato che concentrazioni crescenti di IL-1 riduce la concentrazione di TIMP-1 e MMP aumentata sintesi mediante condrociti. La sintesi di AP è anche modulata da IL-1beta. Stimolazione in vitro condrociti della cartilagine articolare con IL-1 vyzyvet aumento dose-dipendente della sintesi e brusca diminuzione AP della sintesi di PAI-1. La capacità di IL-1 per ridurre la sintesi di PAI-1 sintesi e stimolare AP è un potente meccanismo per la generazione di attivazione plasmina e MMP. Inoltre, plasmina non è solo un enzima attivazione di altri enzimi, partecipa anche alla degradazione della cartilagine mediante proteolisi diretta.

IL-ip è sintetizzata come una massa precursore inattivo 31 kD (pre-IL-ip), AZAT, dopo scissione del peptide segnale, viene convertito alla citochina attiva dal peso di 17,5 kD. Nei tessuti delle articolazioni, tra la membrana sinoviale e liquido sinoviale della cartilagine articolare, IL-ip rilevato in forma attiva, in studi in vivo hanno dimostrato la capacità della membrana sinoviale in osteoartrite secernere questa citochina. Alcune proteasi di serina sono in grado di convertire pre-IL-ip nella sua forma bioattiva. Nei mammiferi, tali proprietà si trovano in una sola proteasi, che appartiene alla famiglia di enzimi cisteina aspartatspetsificheskih chiamato IL-1p-enzima di conversione (IKF o caspasi-1). Questo enzima è in grado di convertire specificamente pre-IL-ip in un IL-ip "maturo" biologicamente attivo con una massa di 17,5 kD. IKF è un proenzima con una massa molecolare di 45 kD (p45), che è localizzata nella membrana cellulare. Dopo proenzima p45 proteolitico scissione per formare due subunità, noti come p10 e p20, che è caratteristica di attività enzimatica.

TNF-a è anche sintetizzato come precursore legato alla membrana con una massa di 26 kD; per scissione proteolitica, viene rilasciato dalla cellula come una forma solubile attiva con una massa di 17 kD. La scissione proteolitica viene effettuata dall'enzima TNF-a-converting (TNF-KF), che appartiene alla famiglia delle adamalisine. AR Amin e co-autori (1997) hanno trovato maggiore espressione di mRNA di TNF-CF nella cartilagine articolare di pazienti con osteoartrosi.

L'attivazione biologica di condrociti e sinovitociti IL-1 e TNF-a è mediata dal legame con recettori specifici sulla superficie delle cellule - IL-R e TNF-R. Per ogni citochina sono stati identificati due tipi di recettori: IL-IP dei tipi I e II e TNF-P I (p55) e II (p75). Per la trasmissione dei segnali nelle cellule dei tessuti articolari, rispondono IL-1PI e p55. IL-1P tipo I ha un'affinità leggermente superiore per IL-1beta rispetto a IL-1a; IL-1P tipo II - al contrario, ha una maggiore affinità per IL-1a rispetto a IL-ip. Non è chiaro se IL-IP II di tipo II possa mediare i segnali di IL-1 o che serva solo a inibire competitivamente il legame di IL-1 al tipo di IL-1PI. In condroiti e fibroblasti sinoviali di pazienti con osteoartrite, si riscontra un gran numero di IL-1PI e p55, che a sua volta spiega l'elevata sensibilità di queste cellule alla stimolazione con citochine appropriate. Questo processo porta sia ad un aumento della secrezione di enzimi proteolitici, sia alla distruzione della cartilagine articolare.

Non è esclusa la partecipazione di IL-6 nel processo patologico nell'osteoartrosi. Questa ipotesi si basa sulle seguenti osservazioni:

• IL-6 aumenta il numero di cellule infiammatorie nella membrana sinoviale,
• IL-6 stimola la proliferazione dei condrociti,
• IL-6 migliora gli effetti dell'IL-1 nell'aumentare la sintesi di MMP e inibire la sintesi di proteoglicani.

Tuttavia, IL-6 è in grado di indurre la produzione di TIMP, ma non influisce sulla produzione di MMP ritiene quindi che questa citochina è coinvolta nel processo di contenimento di degradazione proteolitica della cartilagine articolare, che si realizza attraverso un meccanismo di feedback.

Un altro rappresentante della famiglia IL-6 è la citochina LIF, prodotta da condrociti ottenuti da pazienti con osteoartrite, in risposta alla stimolazione di citochine proinfiammatorie IL-ip e TNF-a. LIF stimola il riassorbimento dei proteoglicani della cartilagine, così come la sintesi di MMP e NO produzione. Il ruolo di questa citochina nell'osteoartrosi non è completamente compreso.

IL-17 è un omodimero da 20-30 kD con azione simile a IL-1, ma molto meno pronunciato. IL-17 stimola la sintesi e l'isolamento di un certo numero di citochine pro-infiammatorie, tra cui IL-ip, TNF-a, IL-6 e MMP in cellule bersaglio, ad esempio nei macrofagi umani. Inoltre, IL-17 stimola la produzione di NO con i condrociti. Come il LIF, il ruolo dell'IL-17 nella patogenesi dell'OA è stato poco studiato.

Il NO radicalico inorganico svolge un ruolo importante nella degradazione della cartilagine articolare con OA. I condrociti ottenuti da pazienti con osteoartrosi producono più NO tanto spontaneamente quanto dopo stimolazione con citochine pro-infiammatorie rispetto alle cellule normali. Un alto contenuto di NO si trova nel liquido sinoviale e nel siero dei pazienti con osteoartrosi - il risultato di un aumento dell'espressione e della sintesi di NO sintasi indotta (hNOC), un enzima responsabile della produzione di NO. Recentemente, il DNA di hNOC specifico dei condrociti è stato clonato, è stata determinata la sequenza di amminoacidi dell'enzima. La sequenza di amminoacidi indica un'identità del 50% e una somiglianza del 70% con l'hNOC specifico per l'endotelio e il tessuto neurale.

L'NO inibisce la sintesi di macromolecole di ECM della cartilagine articolare e stimola la sintesi di MMP. Inoltre, un aumento della produzione di NO è accompagnato da una diminuzione della sintesi dell'antagonista IL-IP (IL-1RA) da parte dei condrociti. Pertanto, un aumento del livello di IL-1 e una diminuzione di IL-1 RA porta all'iperstimolazione di NO condrociti, che a sua volta porta ad un aumento della degradazione della matrice cartilaginea. Ci sono state segnalazioni di un effetto terapeutico in vivo di un inibitore selettivo dell'hNOC sulla progressione dell'osteoartrite sperimentale.

Gli inibitori delle citochine naturali possono inibire direttamente il legame delle citochine con i recettori delle membrane cellulari, riducendo la loro attività pro-infiammatoria. Gli inibitori naturali delle citochine possono essere suddivisi in tre classi in base alla loro modalità di azione.

La prima classe di inibitori comprende gli antagonisti del recettore, che impediscono il legame del ligando al suo recettore dalla competizione per il sito di legame. Ad oggi, tale inibitore si trova solo per IL-1 - questo è il suddetto inibitore competitivo del sistema IL-1 / ILIP IL-1 PA. Blocchi di IL-1 RA molti degli effetti che si osservano nei tessuti delle articolazioni in osteoartrite, compresa la sintesi delle prostaglandine da cellule sinoviali, la produzione di collagenasi da condrociti e degradazione della cartilagine articolare nel gabinetto.

IL-1RA viene rilevato in varie forme: una solubile (rIL-1PA) e due intercellulare (μIL-lPAI e μIL-1APAP). L'affinità della forma solubile di IL-1RA è 5 volte quella delle forme intercellulari. Nonostante l'intensa ricerca scientifica, la funzione di quest'ultimo rimane sconosciuta. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che per inibire l'attività di IL-1bet è necessaria la concentrazione di IL-1PA, 10-100 volte superiore al normale , in vivo è necessario un aumento di mille volte la concentrazione di IL-1PA. Questo fatto può parzialmente spiegare la deficienza relativa di IL-1 RA e l'eccesso di IL-1 nella sinovia di pazienti con osteoartrosi.

La seconda classe di inibitori naturali delle citochine è rappresentata dai recettori solubili delle citochine. Un esempio di tali inibitori negli umani correlati alla patogenesi dell'osteoartrosi sono pIL-1P e pp55. Recettori di citochine solubili sono forme troncate di recettori normali, che si legano alle citochine, interferiscono con il loro legame con i recettori associati alle membrane delle cellule bersaglio, agendo secondo il meccanismo dell'antagonismo competitivo.

Il principale precursore dei recettori solubili è IL-1PP legato alla membrana. L'affinità di rIL-IP in relazione a IL-1 e IL-1 PA è diversa. Pertanto, pIL-1PH ha una maggiore affinità per IL-1p rispetto a IL-1 PA e pIL-1PI mostra una maggiore affinità per IL-1RA rispetto a IL-ip.

Per il TNF ci sono anche due tipi di recettori solubili: pp55 e pp75, come i recettori solubili IL-1, sono formati da "sheeding" (dumping). In vivo, entrambi i recettori si trovano nei tessuti delle articolazioni colpite. Viene discusso il ruolo dei recettori solubili del TNF nella patogenesi dell'osteoartrite. Si suggerisce che in basse concentrazioni stabilizzino la struttura tridimensionale del TNF e aumentino l'emivita della citochina bioattiva, mentre alte concentrazioni di pp55 e pp75 possono ridurre l'attività del TNF attraverso l'antagonismo competitivo. Apparentemente, pp75 può fungere da vettore del TNF, facilitando il suo legame con il recettore associato alla membrana.

La terza classe di inibitori naturali delle citochine è rappresentata da un gruppo di citochine anti-infiammatorie, che includono TGF-beta, IL-4, IL-10 e IL-13. Le citochine anti-infiammatorie riducono la produzione di pro-infiammatori, così come alcune proteasi, stimolano la produzione di IL-1RA e TIMP.