Metodi genetici molecolari per la diagnosi di malattie ereditarie

I metodi della tecnologia del DNA sono utilizzati per determinare la localizzazione in un particolare cromosoma di un gene mutante responsabile dell'origine di alcune forme di patologia ereditaria. Dato che il gene è un segmento di DNA e la mutazione del gene - danni alla struttura primaria del DNA (una mutazione è compreso da tutti i cambiamenti nella sequenza di DNA, indipendentemente dalla loro posizione e l'influenza sul singolo vitalità) malattia poi tastatura preparazioni di cromosomi metafase paziente ereditati, possibile stabilire localizzazione del gene patologico. Metodi di genetica molecolare creano opportunità per diagnosticare malattie a livello della struttura alterata del DNA, permettono di scoprire la localizzazione dei disturbi ereditari. I metodi genetici molecolari possono rivelare mutazioni associate alla sostituzione anche di una singola base.

La fase più importante nell'identificazione di un gene è il suo isolamento. Il DNA può essere isolato da qualsiasi tipo di tessuto e nucleo contenente cellule. Le fasi di estrazione del DNA includono rapida lisi delle cellule mediante centrifugazione con la rimozione di frammenti di organelli e delle membrane cellulari, distruzione enzimatica delle proteine e loro estrazione dalla soluzione con fenolo e cloroformio, concentrazione del DNA mediante precipitazione in etanolo.

Nei laboratori genetici, il DNA è il più spesso isolato dai leucociti del sangue, per i quali il paziente riceve 5-20 ml di sangue venoso in una provetta sterile con una soluzione anticoagulante (eparina). I leucociti vengono quindi separati e processati secondo i passaggi sopra descritti.

La successiva fase di preparazione del materiale allo studio - DNA "cut" in frammenti a siti con strettamente specifica sequenza di basi viene effettuata per mezzo di enzimi batterici - endonucleasi di restrizione (enzimi di restrizione). Gli enzimi di restrizione riconoscono sequenze specifiche di 4-6, almeno 8-12 nucleotidi nella molecola di DNA a doppio filamento e suoi separate in frammenti di queste sequenze localizzare siti chiamati siti di restrizione. Il numero di frammenti di DNA di restrizione prodotti è determinato dalla frequenza dei siti di restrizione e la dimensione dei frammenti è determinata dalla distribuzione di questi siti lungo la lunghezza della molecola di DNA originale. Più spesso si trovano i siti di restrizione, più brevi sono i frammenti di DNA dopo la restrizione. Attualmente sono noti più di 500 diversi tipi di enzimi di restrizione di origine batterica e ciascuno di questi enzimi riconosce la sua sequenza specifica di nucleotidi. In futuro, i siti di restrizione possono essere utilizzati come marcatori genetici per il DNA. I frammenti di DNA formati a seguito di una restrizione possono essere ordinati lungo la lunghezza mediante elettroforesi in un gel di agarosio o poliacrilammide, e quindi il loro peso molecolare può essere determinato. Di solito per il rilevamento del DNA nel gel utilizzato da colorazione specifica (solitamente bromuro di etidio) e la visualizzazione del gel in luce trasmessa nell'ultravioletto. Le posizioni di localizzazione del DNA hanno un colore rosso. Tuttavia, una persona nel trattamento dei vari restrizione del DNA endonucleasi formata tanti frammenti di lunghezze differenti che non riescono a essere separati mediante elettroforesi, non è possibile identificare visivamente i singoli frammenti di DNA a electrophoregram (colorazione uniforme prodotto per tutta la lunghezza del gel). Pertanto, un metodo di ibridazione con sonde di DNA marcate viene utilizzato per identificare i frammenti di DNA desiderati in tale gel.

Qualsiasi segmento a filamento singolo di DNA o RNA è in grado di legarsi (ibridarsi) alla sua catena complementare e la guanina è sempre associata alla citosina, l'adenina con la timina. Questa è la formazione di una molecola a doppio filamento. Se una copia a filamento singolo del gene clonato viene etichettata con un'etichetta radioattiva, verrà ottenuta una sonda. La sonda è in grado di trovare un segmento complementare di DNA, che viene facilmente identificato dalla radioautografia. Una sonda radioattiva aggiunta a un farmaco di cromosomi stirati consente di localizzare il gene su un determinato cromosoma: alcuni campioni di DNA possono essere identificati con una sonda di DNA in Southern blotting. L'ibridazione si verifica se la porzione di test del DNA contiene un gene normale. Nel caso in cui sia presente una sequenza anormale di nucleotidi, cioè le corrispondenti strutture cromosomiche contengono un gene mutante, non si verificherà l'ibridazione, che consente di determinare la localizzazione del gene patologico.

Per ottenere le sonde del DNA, viene utilizzato il metodo di clonazione del gene. L'essenza del metodo consiste nel fatto che il frammento di DNA corrispondente a qualsiasi gene o regione del gene inserito nella particella clonazione, di solito un plasmide batterico (circolare DNA presente extracromosomico nelle cellule batteriche e che trasportano geni di resistenza agli antibiotici), e quindi i batteri avere un plasmide con un gene umano incorporato, si moltiplica. Grazie ai processi di sintesi nel plasmide, è possibile ottenere miliardi di copie del gene umano o del suo sito.

Inoltre, le copie del DNA etichettate con un'etichetta radioattiva o fluorocromi vengono utilizzate come sonde per cercare sequenze complementari tra il pool di molecole di DNA studiate.

Al momento, ci sono molte varietà di metodi che utilizzano sonde di DNA per la diagnosi delle mutazioni geniche.

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