Cellule staminali ematopoietiche da sangue del cordone ombelicale

Il sangue del cordone ombelicale è una buona fonte di cellule staminali emopoietiche in termini di potenziale proliferativo e capacità di ripopolamento delle cellule emopoietiche. È stato ripetutamente dimostrato che, al momento della nascita, il sangue del cordone ombelicale contiene un numero sufficientemente elevato di cellule progenitrici emopoietiche debolmente impegnate. Alcuni autori ritengono che il vantaggio del trapianto di cellule staminali emopoietiche da sangue cordonale risieda nell'eliminazione della necessità di ricercare un donatore compatibile con gli antigeni HLA. A loro avviso, l'immaturità del sistema immunitario del neonato causa una ridotta attività funzionale delle cellule immunocompetenti e, di conseguenza, una minore incidenza di malattia del trapianto contro l'ospite grave rispetto al trapianto di midollo osseo. Allo stesso tempo, il tasso di sopravvivenza di un trapianto di cellule del sangue cordonale non è inferiore a quello delle cellule del midollo osseo, anche nel caso in cui venga somministrato un numero inferiore di cellule staminali emopoietiche per kg di peso corporeo del paziente. Tuttavia, a nostro avviso, le questioni relative al numero ottimale di cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale trapiantate necessarie per un attecchimento efficace nel corpo del ricevente, alla loro compatibilità immunologica e ad altri aspetti del problema del trapianto di cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale richiedono un'analisi più approfondita.

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Ottenere cellule staminali emopoietiche dal sangue del cordone ombelicale

La procedura per ottenere cellule staminali emopoietiche dal sangue del cordone ombelicale prevede il prelievo immediato dopo la nascita del bambino e la sua separazione dalla placenta, sia in utero che fuori dall'utero, così come durante un taglio cesareo, ma anche fuori dall'utero. È stato dimostrato che se il tempo che intercorre tra la nascita e la separazione del neonato dalla placenta si riduce a 30 secondi, il volume di sangue del cordone ombelicale ottenuto aumenta in media di 25-40 ml. Se questa procedura viene eseguita più tardi, si perde la stessa quantità di sangue. È stato dimostrato che la separazione precoce del bambino dalla placenta non comporta conseguenze negative per il neonato.

L'Istituto Russo di Ricerca di Ematologia e Trasfusioni ha sviluppato tecnologie efficaci e a basso costo per ottenere il sangue del cordone ombelicale sia durante il parto fisiologico (70,2+25,8 ml) che durante il taglio cesareo (73,4+25,1 ml). È stato proposto un metodo per separare il sangue del cordone ombelicale con una resa sufficientemente elevata di cellule nucleate e mononucleate, rispettivamente dell'83,1+9,6% e dell'83,4+14,1%. È stato migliorato un metodo per la crioconservazione del sangue del cordone ombelicale, che garantisce un'elevata conservazione di cellule mononucleate e di CFU-GM, rispettivamente del 96,8+5,7% e dell'89,6+22,6%. È stata determinata l'efficienza del metodo di drenaggio per la raccolta del sangue del cordone ombelicale utilizzando il contenitore Kompoplast-300 (Russia). Gli autori hanno raccolto il sangue del cordone ombelicale subito dopo la nascita del bambino e il suo distacco dalla placenta, in condizioni di placenta in utero o ex utero. Prima della puntura della vena ombelicale, il cordone ombelicale è stato trattato una volta con tintura di iodio al 5% e poi due volte con alcol etilico al 70%. Il sangue è defluito spontaneamente attraverso i tubi di collegamento nel contenitore. La procedura di raccolta non ha richiesto più di 10 minuti. Il volume medio di 66 campioni di sangue del cordone ombelicale raccolti tramite drenaggio era (72 ± 28) ml e il numero di leucociti nel volume totale medio del campione era (1,1 ± 0,6) x 107. Durante l'analisi del sangue del cordone ombelicale per la sterilità (contaminazione batterica, HIV-1, virus dell'epatite B e C, sifilide e infezione da citomegalovirus), sono stati rilevati anticorpi IgG contro il virus dell'epatite C in un solo campione. In un altro studio, la placenta è stata posizionata con la superficie fetale rivolta verso il basso su un telaio speciale subito dopo la nascita, il cordone ombelicale è stato trattato con una soluzione di iodio al 5% e alcol etilico al 75%. La vena ombelicale è stata drenata utilizzando un ago da un sistema trasfusionale (G16). Il sangue è fluito spontaneamente nel contenitore. Il volume medio di sangue raccolto in questo modo è stato di (55 ± 25) ml. Nel lavoro di G. Kogler et al. (1996), il sangue del cordone ombelicale è stato raccolto utilizzando un metodo chiuso e sono stati ottenuti grandi volumi di sangue - in media (79 ± 26) ml. Gli autori osservano che tra 574 campioni di sangue del cordone ombelicale, circa il 7% conteneva meno di 40 ml di sangue, il che non ne consente l'utilizzo per il trapianto. K. Isoyama et al. (1996), raccogliendo il sangue del cordone ombelicale mediante esfusione attiva con siringhe, si ottennero in media 69,1 ml di sangue (il volume del sangue del cordone ombelicale variava da 15 a 135 ml). Infine, A. Abdel-Mageed PI et al. (1997) riuscirono a ottenere in media 94 ml di sangue del cordone ombelicale (da 56 a 143 ml) mediante cateterizzazione della vena ombelicale.

Per ridurre il rischio di infezioni iatrogene e di contaminazione con secrezioni materne, è stato sviluppato un sistema di raccolta del sangue chiuso basato sul sistema trasfusionale ampiamente utilizzato di Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA), contenente 62,5 ml di CPDA (citrato-fosfato-destrosio con adenina) come anticoagulante. La tecnologia per l'ottenimento del materiale è di fondamentale importanza per la preparazione di un campione di alta qualità in termini di volume, contenuto e purezza della sospensione cellulare. Tra i metodi esistenti per la raccolta del sangue del cordone ombelicale, convenzionalmente classificati in sistemi chiusi, semi-aperti e aperti, la preferenza dovrebbe essere data al primo, poiché il sistema chiuso riduce significativamente il rischio di contaminazione microbica del materiale, nonché di contaminazione della sospensione cellulare con cellule materne.

A. Nagler et al. (1998) hanno condotto un'analisi comparativa dell'efficienza di tutti e tre i sistemi per la raccolta del sangue del cordone ombelicale. Nella prima variante, la procedura è stata eseguita in un sistema chiuso esfoliando il sangue direttamente in un contenitore. Nella seconda variante, il sangue del cordone ombelicale è stato ottenuto mediante esfusione attiva del sangue con una siringa MP1 seguita dal lavaggio delle vene placentari e dal drenaggio simultaneo del sangue in un contenitore (metodo aperto). Nella terza variante, il sangue è stato raccolto in un sistema semi-aperto estraendolo attivamente con siringhe e lavandolo attraverso l'arteria ombelicale con esfusione simultanea in un contenitore. Nella prima variante, gli autori hanno ottenuto sangue del cordone ombelicale in un volume di (76,4 ± 32,1) ml con un contenuto leucocitario di (10,5 ± 3,6) x 10 ⁶ in 1 ml di sangue. Nella seconda variante, gli indicatori corrispondenti erano (174,4+42,8) ml e (8,8+3,4) x 10⁻¹ ^/ ml; nella terza - (173,7+41,3) ml e (9,3+3,8) x 10⁻¹ ^/ ml. L'infezione più frequente nei campioni di sangue del cordone ombelicale è stata osservata utilizzando un sistema aperto. È stata stabilita una correlazione diretta tra la massa della placenta e il volume di sangue estratto: con un aumento della massa della placenta, aumenta la quantità di sangue prelevato.

Dopo il prelievo del sangue cordonale, segue la fase di separazione: isolamento delle cellule mononucleate e purificazione della sospensione cellulare dagli eritrociti. In condizioni sperimentali, le cellule nucleate vengono isolate mediante sedimentazione con metilcellulosa durante la lisi degli eritrociti con cloruro di ammonio. Tuttavia, la metilcellulosa non dovrebbe essere utilizzata per scopi clinici, poiché le perdite di cellule staminali emopoietiche su di essa raggiungono il 50-90%. Anche la lisi degli eritrociti non viene quasi mai eseguita in clinica a causa degli elevati volumi della soluzione di lavoro, sebbene la percentuale di isolamento delle cellule nucleate con fenotipo CD34+, così come delle cellule progenitrici con CFU-GM e CFU-GEMM, sia significativamente più elevata. Viene segnalata l'emergere di un nuovo mezzo per l'isolamento delle cellule mononucleate in gradiente di densità, la soluzione a densità di Buyant (BDS72). Questa sostanza presenta i seguenti parametri fisiologici: pH - 7,4, osmolalità - 280 mOsm/kg, densità - 1,0720 g/ml. Secondo gli autori, può essere utilizzata per isolare fino al 100% delle cellule CD34-positive e rimuovere il 98% degli eritrociti. Tuttavia, BDS72 non è ancora utilizzato in clinica.

Nei metodi approvati per l'isolamento delle cellule nucleate dal sangue del cordone ombelicale, si utilizza solitamente una soluzione di amido idrossietilico al 10% o una soluzione di gelatina al 3%. L'efficienza della sedimentazione degli eritrociti e dell'isolamento delle cellule nucleate in entrambi i casi è approssimativamente uguale. Tuttavia, quando si utilizza la gelatina come agente di sedimentazione, è possibile ottenere una quantità leggermente maggiore di CFU-GM rispetto all'utilizzo di amido idrossietilico. Si presume che le differenze nell'efficienza dell'isolamento di CFU-GM siano dovute a diverse velocità di sedimentazione delle singole frazioni di cellule nucleate o alla capacità delle molecole di amido idrossietilico di essere assorbite sulla superficie dei recettori delle cellule emopoietiche e quindi di bloccarne la sensibilità ai fattori stimolanti le colonie utilizzati nella coltura di CFU-GM in vitro. Ciononostante, entrambi i sedimentatori potrebbero essere adatti per l'isolamento delle cellule nucleate nella creazione di banche del sangue del cordone ombelicale su larga scala.

I metodi di separazione e crioconservazione del sangue cordonale non sono sostanzialmente diversi da quelli utilizzati per le cellule staminali emopoietiche del sangue periferico e del midollo osseo di donatori adulti. Tuttavia, quando si prepara un gran numero di campioni di sangue cordonale per le proprie banche, i metodi di separazione devono, innanzitutto, essere economici. Pertanto, purtroppo, attualmente, per esigenze cliniche, vengono utilizzati metodi di routine già collaudati per l'isolamento e la crioconservazione delle cellule del sangue cordonale, mentre metodi più efficaci, ma costosi, rimangono appannaggio esclusivo degli sperimentatori.

In generale, sono stati approvati i criteri per la valutazione del numero di cellule emopoietiche e i requisiti per l'esame dei campioni di sangue cordonale al fine di identificare agenti infettivi. Per garantire la sicurezza del trapianto di cellule emopoietiche da sangue cordonale, tutti i campioni di sangue devono essere esaminati principalmente per la ricerca di infezioni trasmesse per via ematogena e malattie genetiche. Diversi autori raccomandano ulteriori metodi specifici per l'esame del sangue cordonale al fine di diagnosticare malattie genetiche come l'α-talassemia, l'anemia falciforme, il deficit di adenosina deaminasi, l'agammaglobulinemia di Bruton, le malattie di Hurler e di Ponter.

Secondo le raccomandazioni di L. Ticheli e coautori (1998), ogni campione di sangue cordonale deve essere testato per cellule nucleate, cellule CD34-positive e CFU-GM, deve essere eseguita la tipizzazione HLA e il gruppo sanguigno deve essere determinato in base al sistema ABO e al suo fattore Rh. Inoltre, devono essere eseguiti esami colturali batteriologici, test sierologici per l'infezione da HIV e citomegalovirus, HBsAg, epatite virale C, HTLY-I e HTLV-II (leucemia a cellule T umane), sifilide e toxoplasmosi. È obbligatoria la reazione a catena della polimerasi (PCR) per l'infezione da citomegalovirus e HIV.

La procedura per il prelievo del sangue cordonale deve essere eseguita nel rigoroso rispetto dei principi di bioetica medica. Prima del prelievo, è necessario ottenere il consenso della donna incinta. Un colloquio preliminare con la donna incinta per ottenere il consenso informato per tutte le manipolazioni, dall'esfusione del sangue alla compilazione della documentazione, è effettuato esclusivamente da personale sanitario. In nessun caso è consentito che nessuna di queste procedure venga eseguita da personale con formazione biologica, chimica, farmaceutica o di altra natura non medica, a causa della violazione delle norme stabilite di bioetica e diritti umani. In caso di test positivi per la presenza di HBsAg, di anticorpi contro i patogeni dell'epatite C, dell'infezione da HIV e della sifilide, il sangue cordonale non viene prelevato e i campioni di sangue già prelevati vengono scartati e distrutti. Va notato che il trasporto di infezioni latenti nei neonati è molto meno comune che negli adulti, pertanto la probabilità di trasferimento ematogeno e di sviluppo di complicazioni infettive durante le infusioni di cellule emopoietiche del sangue del cordone ombelicale è significativamente inferiore rispetto al caso di utilizzo di midollo osseo di donatori adulti per il trapianto.

Un aspetto importante dell'uso clinico del sangue cordonale è la valutazione del trapianto, che si basa sulla determinazione della quantità di cellule staminali emopoietiche in un campione di sangue cordonale e delle dosi di cellule necessarie per il trapianto. Attualmente, non sono ancora stati sviluppati standard per la quantità ottimale di cellule staminali emopoietiche necessarie per il trapianto. Non esiste un punto di vista generalmente accettato nemmeno su parametri di routine come il numero di cellule CD34-positive e il CFU-GM. Alcuni autori valutano il potenziale delle cellule emopoietiche analizzando colture a lungo termine con determinazione del contenuto di unità formanti colonie comuni a granulociti, eritrociti, monociti e megacariociti (CFU-GEMM).

Tuttavia, in ambito clinico, la valutazione standard di un trapianto di sangue del cordone ombelicale prevede in genere solo la determinazione del numero di cellule nucleate o mononucleate.

Conservazione delle cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale

Esistono anche alcuni problemi nella tecnologia di conservazione delle cellule emopoietiche del sangue del cordone ombelicale. Quando si crioconservano le cellule staminali emopoietiche, per ottenere la modalità di congelamento ottimale, è necessario ridurre il più possibile il volume del sangue del cordone ombelicale e rimuovere preventivamente gli eritrociti per evitare l'emolisi e il rischio di sviluppare una reazione di incompatibilità per gli antigeni eritrocitari (ABO, Rh). Diversi metodi di isolamento delle cellule nucleate sono adatti a questi scopi. All'inizio degli anni '90 del secolo scorso, il metodo più utilizzato era l'isolamento delle cellule nucleate in un gradiente di densità a base di Ficoll con una densità di 1,077 g/ml o Percoll con una densità di 1,080 g/ml. La separazione del sangue del cordone ombelicale in un gradiente di densità consente l'isolamento prevalentemente di cellule mononucleate, ma comporta una perdita significativa di cellule progenitrici emopoietiche, fino al 30-50%.

L'efficienza di sedimentazione dell'amido idrossietilico nel processo di isolamento delle cellule emopoietiche da sangue cordonale viene valutata in modo diverso. Alcuni autori sottolineano la scarsa qualità della separazione con questo metodo, mentre altri ricercatori, al contrario, tra tutti i metodi possibili, preferiscono l'isolamento delle cellule staminali ematopoietiche da sangue cordonale utilizzando una soluzione di amido idrossietilico al 6%. Allo stesso tempo, viene sottolineata l'elevata efficienza di sedimentazione delle cellule emopoietiche, che, secondo alcuni dati, raggiunge l'84-90%.

I sostenitori di un diverso punto di vista ritengono che praticamente tutti i metodi di frazionamento siano associati a grandi perdite di cellule nucleate e propongono di eseguire la separazione per centrifugazione, dividendo il sangue del cordone ombelicale in 3 frazioni: eritrociti, anello leucocitario e plasma. Isolando le cellule in questo modo, gli autori hanno scoperto che il contenuto di cellule mononucleate, cellule progenitrici emopoietiche precoci e cellule con immunofenotipo CD34+ ammontava rispettivamente al 90, 88 e 100% del livello iniziale. Valori simili per l'aumento delle cellule del sangue del cordone ombelicale purificate con questo metodo sono stati ottenuti anche da altri ricercatori: dopo la sedimentazione, sono stati isolati il 92% delle cellule nucleate, il 98% delle cellule mononucleate, il 96% delle cellule CD34-positive e il 106% delle unità formanti colonie.

Alla fine degli anni '90, la gelatina era ampiamente utilizzata come agente di sedimentazione. Nella pratica clinica, la gelatina è stata utilizzata per isolare le cellule staminali emopoietiche dal sangue del cordone ombelicale dal 1994. Utilizzando una soluzione di gelatina al 3%, l'efficienza di isolamento delle cellule nucleate raggiunge l'88-94%. L'uso su larga scala della gelatina nella creazione di una banca del sangue del cordone ombelicale ha confermato i suoi vantaggi rispetto ad altri agenti di sedimentazione. Un'analisi comparativa dell'efficienza di tutti i metodi sopra descritti per l'isolamento delle cellule nucleate nelle condizioni del loro utilizzo sequenziale su ciascuno dei campioni di sangue del cordone ombelicale testati ha dimostrato che una soluzione di gelatina al 3% è l'agente di sedimentazione ottimale in termini di resa di cellule mononucleate con fenotipo CD34+/CD45+, nonché in termini di numero di CFU-GM e CFU-GEMM. I metodi che utilizzano un gradiente di densità di Ficoll, così come l'uso di amido idrossietilico e metilcellulosa, sono risultati significativamente meno efficaci, con perdite di cellule emopoietiche che hanno raggiunto il 60%.

L'aumento dei volumi di trapianto di cellule staminali del sangue cordonale è associato non solo allo sviluppo di metodi per la loro acquisizione, ma anche alla loro conservazione. Esistono molti problemi direttamente correlati alla preparazione del sangue cordonale per la conservazione a lungo termine e alla scelta della tecnologia ottimale per la crioconservazione dei suoi campioni. Tra questi, vi sono la fattibilità delle procedure di separazione, l'utilizzo di diversi terreni di crioconservazione e l'applicazione di metodi per la preparazione delle cellule scongelate per il trapianto. Il trasporto di campioni di sangue cordonale nativo viene spesso effettuato da regioni lontane dai centri ematologici. A questo proposito, si pone il problema di stabilire periodi di conservazione accettabili per il sangue cordonale dal momento dell'acquisizione all'inizio della crioconservazione, un problema di particolare importanza nella creazione di banche del sangue cordonale.

Uno studio sull'attività funzionale delle cellule emopoietiche nel sangue del cordone ombelicale dopo conservazione a lungo termine (fino a 12 anni) in azoto liquido ha dimostrato che circa il 95% delle cellule emopoietiche non perde la sua elevata capacità proliferativa durante questo periodo. Nel lavoro di S. Yurasov e coautori (1997), è stato dimostrato che la conservazione del sangue del cordone ombelicale a temperatura ambiente (22 °C) o a 4 °C per 24 e 48 ore non riduce significativamente la vitalità delle cellule emopoietiche, che è rispettivamente del 92 e dell'88% del livello iniziale. Tuttavia, se il periodo di conservazione viene esteso a tre giorni, il numero di cellule nucleate vitali nel sangue del cordone ombelicale diminuisce significativamente. Allo stesso tempo, altri studi hanno dimostrato che quando conservato per 2-3 giorni a 22 o 4 °C, la vitalità dei granulociti maturi, piuttosto che delle cellule emopoietiche, ne risente in primo luogo.

La vitalità delle cellule staminali emopoietiche del sangue cordonale può essere influenzata negativamente dai componenti dei sistemi di raccolta del sangue cordonale. Un'analisi dell'effetto di vari anticoagulanti il cui meccanismo d'azione è dovuto al legame con gli ioni calcio (ACD, EDTA, XAPD-1) sulle cellule progenitrici emopoietiche in condizioni di conservazione del sangue cordonale per 24-72 ore ha rivelato il loro effetto negativo sulla vitalità delle cellule nucleate. A questo proposito, gli autori raccomandano l'utilizzo di PBS (soluzione tampone fosfato) con l'aggiunta di eparina nativa senza conservanti a una concentrazione di 20 U/ml, che, a loro avviso, consente di aumentare il periodo di conservazione del sangue cordonale non frazionato a 72 ore e di preservare l'attività funzionale delle unità formanti colonie. Tuttavia, uno studio sulla sicurezza di CFU-GM e CFU-G ha dimostrato che il tempo di conservazione del sangue cordonale prima della crioconservazione non deve superare le nove ore. Ovviamente, il principio che dovrebbe applicarsi in questo caso è che, in presenza di dati contrastanti, dovrebbe essere utilizzato il periodo minimo di conservazione raccomandato per il sangue del cordone ombelicale e dovrebbe essere avviato il prima possibile il congelamento programmato delle cellule isolate.

Per il congelamento delle cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale, si utilizza solitamente una soluzione di DMSO al 10% come crioprotettore. Tuttavia, oltre al pronunciato effetto crioprotettore, il dimetilsolfossido in tale concentrazione ha anche un effetto citotossico diretto, anche con un'esposizione minima alle cellule staminali emopoietiche del cordone ombelicale. Per ridurre l'effetto citotossico del DMSO, si utilizza una temperatura di esposizione pari a zero, si aumenta la velocità di tutte le manipolazioni e si eseguono lavaggi multipli dopo lo scongelamento dei campioni di sangue del cordone ombelicale.

Dal 1995, l'Istituto di Ematologia e Trasfusioniologia dell'Accademia delle Scienze Mediche dell'Ucraina ha sviluppato un orientamento scientifico volto a uno studio completo del sangue del cordone ombelicale come fonte alternativa di cellule staminali emopoietiche. In particolare, sono state sviluppate nuove tecnologie per la crioconservazione a bassa temperatura delle cellule emopoietiche del sangue del cordone ombelicale non frazionato e frazionato. Il polivinilpirrolidone medico a basso peso molecolare viene utilizzato come crioprotettore. Il metodo di crioconservazione del sangue del cordone ombelicale non frazionato si basa su una tecnologia originale per la pre-preparazione delle cellule per il congelamento e su un metodo per la lavorazione speciale della sospensione cellulare immediatamente prima del trapianto.

Uno dei fattori più importanti che influenzano il livello di attività funzionale delle cellule staminali emopoietiche crioconservate è la velocità di raffreddamento della sospensione cellulare, soprattutto durante la fase di cristallizzazione. Un approccio software per risolvere il problema della velocità e del tempo di congelamento offre grandi opportunità per la creazione di metodi di crioconservazione semplici ed efficaci, senza dover lavare la sospensione cellulare dai crioprotettori prima del trapianto.

Le fasi più pericolose per la vitalità delle cellule durante la loro preparazione sono quelle di congelamento e scongelamento diretti. Durante il congelamento delle cellule emopoietiche, una parte significativa di esse può essere distrutta al momento della transizione del mezzo intercellulare dalla fase liquida a quella solida: la cristallizzazione. Per ridurre la percentuale di morte cellulare, vengono utilizzati crioprotettori, i cui meccanismi d'azione e la cui efficacia crioprotettiva sono ampiamente trattati nella letteratura scientifica.

Una direzione promettente per ottimizzare i metodi di crioconservazione delle cellule del midollo osseo e del sangue del cordone ombelicale è la combinazione di basse concentrazioni di diversi crioprotettori con diversi meccanismi d'azione in un'unica soluzione, ad esempio DMSO che agisce a livello intracellulare e amido idrossietilico o albumina, che hanno un effetto protettivo extracellulare.

Per la crioconservazione delle cellule del sangue del cordone ombelicale, si utilizza tradizionalmente una soluzione di DMSO al 20%, che viene versata lentamente nella sospensione cellulare sotto costante agitazione meccanica in un bagno di ghiaccio fino a raggiungere un rapporto pari (1:1) tra i volumi di crioprotettore e sospensione cellulare. La concentrazione finale di dimetilsolfossido è del 10%. La sospensione cellulare viene quindi raffreddata in un'unità criogenica programmata a una velocità di GS/min fino a -40 °C, dopodiché la velocità di raffreddamento viene aumentata a 10 °C/min. Dopo aver raggiunto -100 °C, il contenitore con la sospensione cellulare viene immerso in azoto liquido (-196 °C). Con questa tecnica di crioconservazione, la conservazione delle cellule mononucleate funzionalmente attive dopo lo scongelamento raggiunge l'85% del livello originale.

Le modifiche ai metodi di crioconservazione mirano a ridurre la concentrazione di DMSO mediante l'aggiunta di amido idrossietilico (le concentrazioni finali di dimetilsolfossido e amido idrossietilico sono rispettivamente del 5 e del 6%). Un'elevata efficienza di tale combinazione di crioprotettori si osserva congelando una sospensione di cellule mieloidi, con una citoprotezione non inferiore a quella ottenuta utilizzando solo una soluzione al 10% di dimetilsolfossido. Il numero di cellule nucleate vitali ha raggiunto il 96,7% del livello iniziale e la loro attività funzionale, stimata in base al numero di UFC-GM, è stata dell'81,8%.

Utilizzando una soluzione di dimetilsolfossido in concentrazioni dal 5 al 10% in combinazione con amido idrossietilico al 4% (concentrazione finale), si è riscontrato che la sicurezza delle cellule CD34-positive in tali intervalli di dimetilsolfossido rimane praticamente invariata. Allo stesso tempo, quando la concentrazione di dimetilsolfossido diminuisce dal 5 al 2,5%, si osserva una morte massiva delle cellule del sangue del cordone ombelicale: il numero di unità cellulari vitali diminuisce dall'85,4 al 12,2%. Anche altri autori sono giunti alla conclusione che sono le soluzioni di dimetilsolfossido al 5 e al 10% (nella versione dell'autore, in combinazione con siero autologo) a fornire la citoprotezione con la massima efficienza durante la crioconservazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) da sangue del cordone ombelicale. Inoltre, si è osservata un'elevata conservazione di cellule congelate e scongelate in successione nel caso di una combinazione di dimetilsolfossido al 5 o 10% con una soluzione di amido idrossietilico al 4%, in particolare a una velocità di raffreddamento controllata di GS/min. In un altro studio, è stata utilizzata una soluzione crioprotettiva composta da tre ingredienti: DMSO, albumina umana purificata e terreno di coltura RPMI in un rapporto di 1:4:5, che è stata aggiunta alla sospensione cellulare in un rapporto volumetrico uguale (la concentrazione finale di dimetilsolfossido era del 5%). Dopo lo scongelamento in un bagno d'acqua a una temperatura di +4 GS, la conservazione di CFU-GM ha superato il 94%.

Alcuni autori suggeriscono l'utilizzo di sangue cordonale non frazionato per la crioconservazione, poiché durante il processo di rimozione dei globuli rossi si perdono quantità significative di cellule emopoietiche. In questa variante, viene utilizzata una soluzione al 10% di dimetilsolfossido per proteggere le cellule mononucleate dagli effetti dannosi della criocristallizzazione. Il congelamento viene effettuato a una velocità di raffreddamento costante di GS/min fino a -80 °C, dopodiché la sospensione di cellule del sangue cordonale viene immersa in azoto liquido. Questo metodo di congelamento provoca la lisi parziale dei globuli rossi, pertanto i campioni di sangue non richiedono frazionamento. Dopo lo scongelamento, la sospensione cellulare viene lavata per rimuovere l'emoglobina libera e il dimetilsolfossido in una soluzione di albumina umana o nel siero autologo del paziente e utilizzata per il trapianto.

La conservazione delle cellule progenitrici emopoietiche dopo lo scongelamento del sangue cordonale non frazionato è effettivamente superiore a quella del sangue cordonale frazionato; tuttavia, a causa della criostabilità di alcuni eritrociti, possono insorgere gravi problemi post-trasfusionali dovuti alla trasfusione di eritrociti ABO-incompatibili. Inoltre, il volume di sangue non frazionato conservato aumenta significativamente. Dal punto di vista clinico, la crioconservazione di cellule emopoietiche da sangue cordonale precedentemente isolate e purificate da altre frazioni cellulari è ancora preferibile.

In particolare, è stato sviluppato un metodo per la crioconservazione delle cellule del sangue del cordone ombelicale frazionato, che consente la rimozione degli eritrociti nella fase di preparazione per il congelamento, utilizzando una soluzione al 6% di amido idrossietilico come componente della soluzione plasmasostitutiva "Stabizol". Dopo lo scongelamento, la sospensione cellulare così ottenuta è pronta per l'uso clinico senza ulteriori manipolazioni.

Pertanto, attualmente esistono molti metodi piuttosto efficaci per la crioconservazione del sangue del cordone ombelicale. La loro differenza fondamentale è che i campioni di sangue vengono congelati non frazionati o sottoposti a separazione in frazioni cellulari durante la fase di preparazione, ottenendo cellule nucleate senza aggiunta di eritrociti.

Trapianto di cellule staminali emopoietiche da sangue del cordone ombelicale

Tra la fine degli anni '80 e l'inizio degli anni '90, si è scoperto che il sangue del cordone ombelicale, che fornisce al feto il supporto vitale durante la gravidanza, contiene un'elevata quantità di cellule staminali emopoietiche. La relativa semplicità di reperimento delle cellule del cordone ombelicale e l'assenza di evidenti problemi etici hanno contribuito all'utilizzo delle cellule staminali del cordone ombelicale nella pratica medica. Il primo trapianto di sangue del cordone ombelicale riuscito in un bambino affetto da anemia di Fanconi è servito da punto di partenza per l'espansione del volume dei trapianti di cellule staminali del cordone ombelicale e la creazione di un sistema per la loro conservazione. Nel sistema mondiale delle banche del sangue del cordone ombelicale, la più grande è il New York Placental Blood Center, iscritto nel bilancio del National Institute of Health statunitense. Il numero di campioni di sangue del cordone ombelicale conservati in questa banca si avvicina a 20.000. Anche il numero di riceventi (per lo più bambini) che hanno subito un trapianto con successo è in crescita. Secondo il Dipartimento della Salute degli Stati Uniti, il periodo di vita post-trapianto senza ricadute nei riceventi di trapianto di sangue del cordone ombelicale supera già i 10 anni.

Ciò non sorprende, poiché numerosi studi sul potenziale emopoietico del sangue del cordone ombelicale hanno dimostrato che, in termini di quantità e qualità delle cellule staminali precoci, non solo non è inferiore al midollo osseo di un adulto, ma lo supera addirittura per alcuni aspetti. Il maggiore potenziale proliferativo delle cellule staminali del sangue del cordone ombelicale è dovuto alle caratteristiche ontogenetiche della segnalazione cellulare, alla presenza di recettori per specifici fattori di crescita sulle cellule staminali ematopoietiche (HSC), alla capacità delle cellule del sangue del cordone ombelicale di autoprodurre fattori di crescita e alle grandi dimensioni e lunghezza dei telomeri.

Pertanto, le caratteristiche genomiche e fenotipiche delle cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale predeterminano l'attecchimento di alta qualità del trapianto, con un elevato potenziale di ripristino dell'emopoiesi del donatore nel corpo del ricevente.

Benefici delle cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale

Tra i reali vantaggi dell'utilizzo di cellule staminali emopoietiche da sangue cordonale per il trapianto rispetto ad altre fonti di cellule emopoietiche, vale la pena sottolineare il rischio praticamente nullo per la salute del donatore (se non si considera la placenta come tale) e l'assenza della necessità di anestesia generale. L'utilizzo del sangue cordonale amplia le possibilità di trapianto cellulare grazie a trapianti parzialmente HLA-compatibili (incompatibilità da uno a tre antigeni). È stato sviluppato un metodo per la conservazione a lungo termine delle cellule emopoietiche da sangue cordonale in stato congelato, che aumenta la probabilità di ottenere tipi HLA rari e riduce i tempi di ricerca di un trapianto HLA-compatibile per il trapianto allogenico. Allo stesso tempo, il rischio di sviluppare determinate infezioni latenti trasmesse per via trasmissibile è significativamente ridotto. Inoltre, la possibilità di utilizzare le cellule del sangue cordonale per il trapianto autologo offre una forma economica di assicurazione sulla vita biologica.

Tuttavia, a causa dei piccoli volumi di sangue che possono essere raccolti dalla placenta (in media non più di 100 ml), si pone il problema di ottenere la massima quantità possibile di sangue dalla vena del cordone ombelicale, rispettando rigorosamente le condizioni di rischio minimo di contaminazione batterica dei campioni di sangue del cordone ombelicale ottenuti.

Le cellule emopoietiche primitive del sangue del cordone ombelicale sono solitamente identificate dalla presenza della glicofosfoproteina CD34 sulla loro superficie, nonché in base alle loro proprietà funzionali studiando la clonogenicità o la formazione di colonie in vitro. Analisi comparative hanno mostrato che nel sangue del cordone ombelicale e nel midollo osseo il contenuto massimo di cellule CD34-positive nella frazione mononucleare è rispettivamente dell'1,6 e del 5,0%, il livello massimo di unità formanti colonie nella sottopopolazione cellulare CD34+ è dell'80 e del 25%, l'efficienza di clonazione totale delle cellule CD34+ è dell'88 e del 58%, il contenuto massimo di cellule formanti colonie ad alto potenziale di proliferazione (HPP-CFC nella popolazione CD34+) è del 50 e del 6,5%. Va aggiunto che l'efficienza di clonazione delle cellule CD34+CD38 e la capacità di rispondere alla stimolazione citochinica sono anche più elevate nelle cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale.

La combinazione degli antigeni fenotipici Thy-1, CD34 e CD45RA conferma l'elevato potenziale proliferativo delle cellule emopoietiche del sangue del cordone ombelicale e l'espressione di questi tre antigeni sulla superficie delle cellule del sangue del cordone ombelicale indica la loro appartenenza alle cellule staminali. Inoltre, è stato riscontrato che il sangue del cordone ombelicale contiene cellule con fenotipo CD34+ prive di marcatori di differenziazione lineare. Il livello di sottopopolazioni cellulari con profilo fenotipico CD34+/Lin nel sangue del cordone ombelicale è pari a circa l'1% del numero totale di cellule CD34-positive. Le cellule progenitrici emopoietiche del sangue del cordone ombelicale danno origine sia alla linea cellulare linfoide che alla serie mieloide pluripotente a differenziazione cellulare lineare, il che indica anch'esso la loro appartenenza alle cellule staminali.

Come già accennato, differenze significative tra midollo osseo e sangue cordonale risiedono nella quantità di cellule emopoietiche utilizzate per il trapianto, ottenute durante una singola procedura di prelievo. Se durante il trapianto di midollo osseo la perdita di massa cellulare durante la separazione, la crioconservazione, lo scongelamento e l'analisi è accettabile entro il 40-50%, per il sangue cordonale tali perdite cellulari sono molto significative, poiché se viene utilizzata una quantità insufficiente di cellule staminali ematopoietiche (HSC), il trapianto potrebbe rivelarsi inefficace. Secondo G. Kogler et al. (1998), per il trapianto cellulare con un peso corporeo del ricevente di 10 kg, tutti i campioni di sangue cordonale possono essere potenziali trapianti (il numero totale di campioni di sangue cordonale raccolti è 2098), con un peso corporeo di 35 kg - 67%, e solo il 25% dei campioni può fornire un trapianto efficace in pazienti con un peso corporeo di 50-70 kg. Questa situazione clinica indica la necessità di ottimizzare e migliorare l'efficienza dei metodi esistenti di raccolta, riproduzione e conservazione delle cellule del sangue cordonale ombelicale. Pertanto, la letteratura attualmente discute ampiamente le questioni relative alla standardizzazione dei metodi di raccolta, analisi, separazione e crioconservazione del sangue del cordone ombelicale per creare banche del sangue, il suo utilizzo in ambito clinico e stabilisce anche le condizioni e i termini di conservazione delle cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale.

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Utilizzo delle cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale in medicina

^{Di solito, è possibile isolare fino a 10⁻¹} cellule staminali emopoietiche dal sangue del cordone ombelicale, raramente di più. A questo proposito, la questione se una tale quantità di cellule staminali emopoietiche dal sangue del cordone ombelicale sia sufficiente a ripristinare l'emopoiesi in un ricevente adulto rimane ancora aperta. Le opinioni in merito sono divise. Alcuni ricercatori ritengono che tale quantità sia più che sufficiente per il trapianto nei bambini, ma troppo scarsa per il trapianto in un adulto, per il quale la quantità ottimale è l'introduzione di (7-10⁻¹) x 10⁻¹ ^cellule CD34-positive per 1 kg di peso corporeo, ovvero una media di 7 x ^10⁻¹ per trapianto. Da questi calcoli si evince che un campione di sangue del cordone ombelicale contiene 700 volte meno cellule staminali emopoietiche rispetto a quelle necessarie per un trapianto in un paziente adulto. Tuttavia, una tale valutazione quantitativa viene effettuata per analogia con il numero di cellule del midollo osseo trasfuse e non tiene affatto conto delle caratteristiche ontogenetiche dell'ematopoiesi.

In particolare, viene ignorato il fatto che le cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale abbiano un potenziale proliferativo più elevato rispetto alle cellule progenitrici emopoietiche del midollo osseo. I risultati degli studi in vitro sul potenziale formante colonie suggeriscono che una singola dose di sangue del cordone ombelicale sia in grado di ricostituire l'emopoiesi del ricevente adulto. D'altra parte, non va dimenticato che il numero di cellule staminali del cordone ombelicale diminuisce anche durante lo sviluppo embrionale: il contenuto di cellule CD34-positive nel sangue del cordone ombelicale diminuisce linearmente di 5 volte nel periodo compreso tra le 20 settimane (il sangue per lo studio è stato ottenuto durante un'interruzione prematura di gravidanza) e le 40 settimane di gestazione (il periodo del travaglio fisiologico), a cui si accompagna un parallelo e costante aumento dell'espressione dei marcatori lineari di citodifferenziazione.

A causa della mancanza di un approccio standardizzato alla determinazione quantitativa delle cellule progenitrici nei campioni di sangue cordonale, il dibattito sulla dose ottimale di cellule staminali emopoietiche da sangue cordonale continua. Alcuni ricercatori ritengono che il numero di cellule nucleate e mononucleate ricalcolato in base al peso corporeo del ricevente, ovvero la loro dose, possa essere utilizzato come criterio per la selezione dei campioni di sangue cordonale. Alcuni autori ritengono che la soglia quantitativa minima di cellule CD34+, anche per l'autotrapianto di cellule staminali emopoietiche (HSC), sia di 2 x 10 ⁶ /kg. Allo stesso tempo, un aumento della dose di cellule emopoietiche a 5 x 10 ⁶ cellule/kg (solo 2,5 volte) garantisce già un decorso più favorevole del periodo post-trapianto precoce, riduce l'incidenza di complicanze infettive e accorcia la durata della terapia antibiotica preventiva.

Secondo E. Gluckman et al. (1998), in oncoematologia la condizione per il successo del trapianto di cellule staminali del cordone ombelicale è l'introduzione di almeno 3,7 x 10⁻¹ ^cellule nucleate per 1 kg di peso corporeo del ricevente. Quando la dose di cellule staminali emopoietiche viene ridotta a 1 x 10⁻¹ ^cellule nucleate per 1 kg di peso corporeo del paziente, il rischio di fallimento del trapianto e di recidiva del tumore del sangue aumenta drasticamente. Va riconosciuto che il numero minimo di cellule progenitrici necessarie per un rapido ripristino dell'emopoiesi dopo l'allotrapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSC) è ancora sconosciuto. Teoricamente, questo può essere ottenuto utilizzando una singola cellula, ma nella pratica clinica del trapianto di midollo osseo, un attecchimento rapido e stabile è garantito dalla trasfusione di almeno (1-3) x 10⁻¹ ^cellule nucleate per 1 kg di peso corporeo del paziente.

Un recente studio dettagliato per determinare il numero ottimale di cellule staminali ematopoietiche (HSC) in oncoematologia ha incluso l'osservazione di pazienti in tre gruppi, assegnati in base al contenuto di cellule CD34-positive nel materiale trapiantato. Ai pazienti del primo gruppo sono state somministrate (3-5) x 10 ⁶ cellule/kg. La dose di HSC nei pazienti del secondo gruppo era (5-10) x 10 ⁶ cellule/kg, mentre ai pazienti del terzo gruppo è stata trapiantata una quantità superiore a 10 x 10 ⁶ cellule CD34+/kg. I risultati migliori sono stati osservati nel gruppo di riceventi che ha ricevuto un trapianto con un numero di cellule CD34-positive pari a (3-5) x 10 ⁶ /kg. Con un aumento della dose di cellule trapiantate superiore a 5 x 10 ⁶ /kg, non sono stati rilevati vantaggi statisticamente significativi. In questo caso, un contenuto molto elevato di cellule staminali ematopoietiche (HSC) nel trapianto (> 10 x 10 ⁶ /kg) è associato alla reinfusione di un numero significativo di cellule tumorali residue, che porta alla recidiva della malattia. Non è stata stabilita una relazione diretta tra il numero di cellule progenitrici allogeniche trapiantate e lo sviluppo della reazione del trapianto contro l'ospite.

L'esperienza mondiale accumulata nel trapianto di sangue cordonale ne conferma l'elevato potenziale di ripopolamento. Il tasso di attecchimento del trapianto di sangue cordonale è correlato al numero di cellule nucleate introdotte. I risultati migliori si osservano con un trapianto di 3 x 10 ⁷ /kg, mentre per il midollo osseo questa dose è di 2 x 10 ⁸ /kg. Secondo i dati dei centri di coordinamento, alla fine del 2000 sono stati eseguiti 1200 trapianti di cellule del sangue cordonale in tutto il mondo, principalmente da donatori consanguinei (83%). È ovvio che il sangue cordonale dovrebbe essere considerato un'alternativa al midollo osseo per il trapianto nei pazienti con emoblastosi.

Allo stesso tempo, la natura neonatale del cordone ombelicale, fonte di tessuto emopoietico, ispira ottimismo grazie alla presenza di caratteristiche funzionali delle sue cellule staminali ematopoietiche (HSC). D'altro canto, solo l'esperienza clinica può rispondere alla domanda se un singolo campione di sangue cordonale sia sufficiente a ripristinare l'emopoiesi in un ricevente adulto con aplasia emopoietica. Il trapianto di cellule del sangue cordonale ombelicale è utilizzato in programmi di trattamento per numerose patologie tumorali e non tumorali: leucemia e sindromi mielodisplastiche, linfoma non-Hodgkin e neuroblastoma, anemia aplastica, anemie congenite di Fanconi e Diamond-Blackfan, deficit di adesione leucocitaria, sindrome di Barr, malattia di Gunther, sindrome di Hurler, talassemia.

Gli aspetti immunologici del trapianto di cellule emopoietiche da sangue cordonale meritano particolare attenzione e uno studio separato. È stato dimostrato che, nel caso del trapianto di cellule staminali da sangue cordonale da donatori con compatibilità HLA incompleta, i risultati del trapianto sono piuttosto soddisfacenti, il che, secondo gli autori, indica una minore immunoreattività delle cellule del sangue cordonale rispetto al midollo osseo.

Uno studio dettagliato della composizione cellulare del sangue del cordone ombelicale ha rivelato le caratteristiche sia dello spettro fenotipico delle cellule effettrici del sistema immunitario sia della loro attività funzionale, il che ha permesso di considerare il sangue del cordone ombelicale una fonte di cellule staminali ematopoietiche (HSC) con un rischio relativamente basso di sviluppare una reazione "graft versus host". Tra i segni di immaturità funzionale delle cellule immunocompetenti del sangue del cordone ombelicale, è necessario notare lo squilibrio nella produzione di citochine e una ridotta sensibilità alla regolazione citochinica della risposta immunitaria. La conseguente inibizione dell'attività dei linfociti citotossici è considerata un fattore che contribuisce alla formazione di tolleranza immunologica al tessuto emopoietico trapiantato. Nella popolazione linfocitaria del sangue del cordone ombelicale, a differenza del sangue periferico e del midollo osseo di donatori adulti, predominano linfociti inattivi e immaturi e cellule soppressorie. Ciò indica una ridotta predisposizione dei linfociti T del sangue del cordone ombelicale a una risposta immunitaria. Una caratteristica importante della popolazione monocitaria delle cellule del sangue del cordone ombelicale è il basso contenuto di cellule presentanti l'antigene funzionalmente complete e attive.

Da un lato, la bassa maturità delle cellule effettrici del sistema immunitario nel sangue del cordone ombelicale amplia le indicazioni per il suo utilizzo in clinica, poiché queste caratteristiche determinano una riduzione dell'intensità del conflitto immunitario tra le cellule del donatore e quelle del ricevente. D'altro canto, è nota l'esistenza di una correlazione tra il grado di sviluppo della reazione "graft versus host" e l'effetto antitumorale del trapianto, ovvero lo sviluppo dell'effetto "graft versus leucemia". A questo proposito, è stato condotto uno studio sulla citotossicità antitumorale delle cellule del sangue del cordone ombelicale. I risultati ottenuti indicano che, nonostante la risposta effettivamente indebolita delle cellule del sangue del cordone ombelicale immunocompetenti alla stimolazione antigenica, i linfociti principalmente attivati sono cellule natural killer e cellule killer-like che partecipano attivamente ai meccanismi di attuazione della citotossicità antitumorale. Inoltre, nel sangue del cordone ombelicale sono state riscontrate sottopopolazioni di linfociti con fenotipi CD16+CD56+ e CD16"TCRa/p+. Si presume che queste cellule, nella loro forma attivata, implementino la reazione "graft versus leukemia".

Presso l'Istituto di Oncologia dell'Accademia di Scienze Mediche dell'Ucraina, cellule emopoietiche crioconservate del sangue del cordone ombelicale sono state somministrate a pazienti oncologici con ipoplasia emopoietica persistente dovuta a chemioterapia e radioterapia. In tali pazienti, il trapianto di cellule staminali emopoietiche del sangue del cordone ombelicale ha ripristinato in modo piuttosto efficace l'emopoiesi depressa, come dimostrato da un aumento persistente del contenuto di elementi figurati maturi nel sangue periferico, nonché da un aumento degli indicatori che caratterizzano lo stato dell'immunità cellulare e umorale. La stabilità dell'effetto di ripopolamento dopo il trapianto di cellule emopoietiche del sangue del cordone ombelicale consente di proseguire la radioterapia e la chemioterapia senza interrompere il ciclo di trattamento. Esistono informazioni su una maggiore efficacia dell'allotrapianto di cellule staminali del sangue del cordone ombelicale nei pazienti oncoematologici: il rischio annuo di recidiva di una malattia tumorale con il loro utilizzo è stato del 25% contro il 40% nei pazienti con trapianto di midollo osseo allogenico.

Il meccanismo d'azione delle cellule staminali del sangue cordonale crioconservate deve essere considerato il risultato della stimolazione umorale dell'ematopoiesi del ricevente, causata dalla capacità unica delle cellule neonatali di autoprodurre fattori di crescita ematopoietici, nonché una conseguenza dell'attecchimento temporaneo delle cellule del donatore (come dimostrato da un aumento affidabile del contenuto di emoglobina fetale nel sangue periferico dei riceventi tra il 7° e il 15° giorno dopo la trasfusione rispetto ai dati iniziali). L'assenza di reazioni post-trasfusionali nei riceventi di sangue cordonale è il risultato della relativa tolleranza delle sue cellule immunocompetenti, nonché un criterio di affidabilità per l'adeguatezza biologica del materiale crioconservato.

Le cellule progenitrici killer dei linfociti T del sangue del cordone ombelicale sono in grado di attivarsi sotto l'influenza della stimolazione citochinica esogena, che viene utilizzata per sviluppare nuovi metodi ex vivo e in vivo per indurre la citotossicità antitumorale degli elementi linfoidi del trapianto per la successiva immunoterapia. Inoltre, l'"immaturità" del genoma delle cellule immunocompetenti del sangue del cordone ombelicale consente di utilizzarle per potenziare l'attività antitumorale mediante metodi di modellazione molecolare.

Oggi, il sangue del cordone ombelicale ha trovato ampia applicazione principalmente in ematologia pediatrica. Nei bambini affetti da leucemia acuta, l'allotrapianto di cellule staminali emopoietiche da sangue del cordone ombelicale, rispetto all'allotrapianto di midollo osseo, riduce significativamente l'incidenza della malattia del trapianto contro l'ospite (GVHD). Tuttavia, ciò è accompagnato da un periodo più lungo di neutrocitopenia e trombocitopenia e, purtroppo, da un tasso di mortalità post-trapianto a 100 giorni più elevato. Un periodo più lungo di recupero dei livelli di granulociti e piastrine nel sangue periferico potrebbe essere dovuto a un'insufficiente differenziazione delle singole sottopopolazioni di cellule del cordone ombelicale CD34-positive, come dimostrato dal basso livello di assorbimento della rodamina radioattiva e dalla bassa espressione degli antigeni CD38 sulla loro superficie.

Allo stesso tempo, il trapianto di cellule staminali emopoietiche da sangue del cordone ombelicale in pazienti adulti, eseguito a causa dell'assenza sia di un donatore di midollo osseo non consanguineo compatibile sia della possibilità di mobilizzare cellule staminali ematopoietiche autologhe, ha mostrato un'elevata sopravvivenza libera da recidiva a un anno nel gruppo di pazienti di età inferiore a 30 anni (73%). L'ampliamento della fascia d'età dei riceventi (18-46 anni) ha portato a una riduzione della sopravvivenza al 53%.

L'analisi quantitativa delle cellule con fenotipo CD34+ nel midollo osseo e nel sangue del cordone ombelicale ha rivelato un loro contenuto più elevato (3,5 volte) nel midollo osseo, ma nel sangue del cordone ombelicale è stata osservata una significativa predominanza di cellule con profilo fenotipico CD34+HLA-DR. È noto che le cellule del sangue con i marcatori immunologici CD34+HLA-DR proliferano più attivamente rispetto alle cellule con immunofenotipo CD34+HLA-DR+, il che è stato confermato da studi sperimentali sulla crescita di colture cellulari emopoietiche a lungo termine in vitro. Precursori cellulari primitivi con fenotipo CD34+CD38 sono contenuti sia nel sangue del cordone ombelicale che nel midollo osseo, ma le cellule del cordone ombelicale con il set di marcatori CD34+CD38 presentano un'attività clonogenica maggiore rispetto alle cellule emopoietiche dello stesso fenotipo isolate dal midollo osseo di donatori adulti. Inoltre, le cellule del sangue del cordone ombelicale con immunofenotipo CD34+CD38 proliferano più rapidamente in risposta alla stimolazione citochinica (IL-3, IL-6, G-CSF) e producono 7 volte più colonie nelle colture a lungo termine rispetto alle cellule del midollo osseo.

Banche di cellule staminali del sangue del cordone ombelicale

Per il corretto sviluppo di una nuova area della medicina pratica – il trapianto di cellule staminali del sangue del cordone ombelicale – nonché per l'implementazione dei trapianti di cellule staminali emopoietiche del midollo osseo, è necessaria una rete capillare di banche del sangue, già esistente negli Stati Uniti e in Europa. Le reti nazionali di banche del sangue del cordone ombelicale sono riunite dalla Netcord Bank Association. L'opportunità di creare un'associazione internazionale di banche del sangue del cordone ombelicale è determinata dal fatto che per eseguire trapianti non imparentati è necessario un gran numero di campioni di sangue del cordone ombelicale tipizzati, il che consente di selezionare un donatore HLA-identico. Solo l'istituzione di un sistema di banche con conservazione di campioni di sangue di diversi tipi HLA può risolvere realmente il problema di reperire il donatore necessario. L'organizzazione di un tale sistema di banche del sangue del cordone ombelicale richiede lo sviluppo preliminare di norme etiche e legali, attualmente in fase di discussione a livello internazionale.

Per creare banche del sangue del cordone ombelicale in Ucraina è necessario elaborare una serie di regolamenti e documenti.

In primo luogo, si tratta di standardizzare i metodi di raccolta, frazionamento e congelamento del sangue del cordone ombelicale. È necessario regolamentare le regole di raccolta del sangue del cordone ombelicale negli ospedali per la maternità in conformità con i requisiti di etica medica, per determinare il volume minimo di sangue del cordone ombelicale che garantisca il successo del trapianto. È necessario confrontare e standardizzare diversi criteri per la valutazione della qualità e della quantità delle cellule progenitrici emopoietiche, nonché i metodi di tipizzazione HLA e i metodi diagnostici per le malattie genetiche e infettive che possono essere trasmesse durante l'infusione di cellule del sangue del cordone ombelicale, al fine di stabilire criteri comuni per la selezione dei donatori sani. Vale anche la pena discutere la questione della creazione di strutture di conservazione separate per siero, cellule e DNA ottenuti dal sangue del cordone ombelicale.

È assolutamente necessario organizzare una rete informatica di dati relativi al sangue del cordone ombelicale da collegare ai registri dei donatori di midollo osseo. Per un ulteriore sviluppo della trapiantologia cellulare, è necessario sviluppare protocolli specifici per confrontare i risultati del trapianto di sangue del cordone ombelicale e di midollo osseo da parenti HLA-identici e donatori non consanguinei. La standardizzazione della documentazione, incluso il consenso informato dei genitori, nonché la notifica alla madre o ai parenti delle malattie genetiche e/o infettive rilevate nel bambino, può contribuire a risolvere i problemi etici e legali dell'uso clinico delle cellule del sangue del cordone ombelicale.

La condizione determinante per lo sviluppo della trapiantologia cellulare in Ucraina sarà l'adozione del Programma nazionale di donazione delle cellule staminali e lo sviluppo della cooperazione internazionale con altri paesi attraverso la World Marrow Donor Association (WMDA), il Programma nazionale di donazione delle cellule staminali degli Stati Uniti (NMDP) e altri registri.

Riassumendo la storia, seppur breve, dello sviluppo del trapianto di cellule staminali emopoietiche da cordone ombelicale, notiamo che le prime ipotesi sulla possibilità di utilizzare il sangue del cordone ombelicale in ambito clinico, formulate già nei primi anni '70, furono confermate negli anni '80 dai risultati di studi sperimentali su animali e, nel 1988, fu eseguito il primo trapianto al mondo di cellule staminali emopoietiche da cordone ombelicale in un essere umano, a seguito del quale iniziò a essere creata una rete globale di banche del sangue del cordone ombelicale. In 10 anni, il numero di pazienti a cui furono trapiantate cellule staminali emopoietiche da cordone ombelicale si avvicinò a 800. Tra questi, pazienti affetti da varie patologie di natura tumorale (leucemia, linfoma, tumori solidi) e non tumorale (immunodeficienze congenite, anemia, patologie associate a disturbi metabolici).

Il contenuto di precursori cellulari precoci e impegnati nel sangue del cordone ombelicale è superiore a quello del sangue periferico di un adulto. In termini di numero di unità formanti colonie di granulociti-macrofagi e del loro potenziale proliferativo, il sangue del cordone ombelicale supera significativamente il sangue periferico degli adulti, anche dopo l'introduzione di fattori di crescita. Nelle colture cellulari in vitro a lungo termine, è stata osservata una maggiore attività proliferativa e vitalità delle cellule del sangue del cordone ombelicale rispetto alle cellule del midollo osseo. Momenti critici nel trapianto di cellule staminali del cordone ombelicale sono il numero e il potenziale emopoietico delle cellule nucleate, la presenza di infezione da citomegalovirus, la compatibilità HLA del donatore e del ricevente, il peso corporeo e l'età del paziente.

Tuttavia, il trapianto di cellule staminali del sangue cordonale dovrebbe essere considerato un'alternativa al trapianto di midollo osseo per il trattamento di gravi malattie del sangue, soprattutto nei bambini. I problemi clinici del trapianto di cellule staminali del sangue cordonale stanno gradualmente trovando soluzione: esistono già metodi piuttosto efficaci per la raccolta, la separazione e la crioconservazione delle cellule del sangue cordonale, si stanno creando le condizioni per la creazione di banche del sangue cordonale e si stanno migliorando i metodi per l'analisi delle cellule nucleate. Una soluzione di gelatina al 3% e una soluzione di amido idrossietilico al 6% dovrebbero essere considerate ottimali per la separazione durante l'approvvigionamento su larga scala di cellule staminali emopoietiche del sangue cordonale in fase di creazione di banche.

P. Perekhrestenko e coautori (2001) osservano giustamente che il trapianto di cellule staminali del sangue cordonale dovrebbe trovare il suo giusto posto nel complesso delle misure terapeutiche per superare le depressioni emopoietiche di varia genesi, poiché le cellule staminali del sangue cordonale presentano una serie di vantaggi significativi, tra cui i più importanti sono la relativa semplicità del loro reperimento, l'assenza di rischi per il donatore, la bassa contaminazione virale delle cellule neonatali e il costo relativamente basso del trapianto. Alcuni autori sottolineano che il trapianto di cellule del sangue cordonale è meno frequentemente accompagnato da complicazioni associate alla reazione del trapianto contro l'ospite rispetto al trapianto di cellule del midollo osseo, il che è dovuto, a loro avviso, alla debole espressione degli antigeni HLA-DR sulle cellule del sangue cordonale e alla loro immaturità. Tuttavia, la principale popolazione di cellule nucleate nel sangue del cordone ombelicale è costituita dai linfociti T (cellule CD3-positive), il cui contenuto è pari a circa il 50%, ovvero il 20% in meno rispetto al sangue periferico di un adulto, ma le differenze fenotipiche nelle sottopopolazioni di linfociti T provenienti da queste fonti sono insignificanti.

Tra i fattori che influenzano direttamente il tasso di sopravvivenza nel trapianto di cellule staminali del sangue del cordone ombelicale, vale la pena sottolineare l'età dei pazienti (i risultati migliori si osservano nei riceventi di età compresa tra uno e cinque anni), la diagnosi precoce della malattia e la forma di leucemia (l'efficacia è significativamente maggiore nella leucemia acuta). Di grande importanza sono la dose di cellule staminali del sangue del cordone ombelicale nucleate e la loro compatibilità HLA con il ricevente. Non è un caso che l'analisi dell'efficacia clinica del trapianto di cellule staminali del sangue del cordone ombelicale in oncoematologia mostri i migliori risultati terapeutici con l'utilizzo di trapianti correlati: la sopravvivenza libera da recidiva a un anno in questo caso raggiunge il 63%, mentre con il trapianto non correlato si attesta solo sul 29%.

Pertanto, la presenza di un elevato numero di cellule staminali nel sangue del cordone ombelicale e l'elevata capacità di ripopolamento delle cellule staminali emopoietiche neonatali ne consentono l'utilizzo per il trapianto allogenico in pazienti oncoematologici. Tuttavia, è opportuno sottolineare che la ricapitolazione dell'emopoiesi dopo il trapianto di cellule emopoietiche del cordone ombelicale è "prolungata nel tempo": il ripristino del contenuto di neutrofili nel sangue periferico si osserva solitamente entro la fine della sesta settimana e la trombocitopenia solitamente scompare dopo 6 mesi. Inoltre, l'immaturità delle cellule emopoietiche del cordone ombelicale non esclude conflitti immunologici: una grave malattia del trapianto contro l'ospite (GVHD) acuta e cronica si osserva rispettivamente nel 23 e nel 25% dei riceventi. Recidive di leucemia acuta entro la fine del primo anno dopo il trapianto di cellule emopoietiche del cordone ombelicale si osservano nel 26% dei casi.

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