Corynebacteriae

La difterite è una malattia infettiva acuta prevalentemente dell'infanzia, che si manifesta attraverso l'intossicazione profonda dell'organismo con la tossina della difterite e l'infiammazione fibrinosa caratteristica nel sito del patogeno. Il nome della malattia deriva dalla parola greca diphthera - pelle, pellicola, poiché nel sito di riproduzione del patogeno si forma un film denso, bianco-grigiastro.

L'agente eziologico della difterite, Corynebacterium diphtheriae, fu scoperto per la prima volta nel 1883 da E. Klebs a fette da un film, ottenuto in coltura pura nel 1884 da F. Leffler. Nel 1888, E. Ru e A. Yersen scoprirono la sua capacità di produrre esotossina, che svolge un ruolo importante nell'eziologia e nella patogenesi della difterite. La ricevuta nel 1892 del siero antitossico di E. Bering e il suo uso dal 1894 per il trattamento della difterite ha permesso di ridurre significativamente la letalità. Un attacco di successo a questa malattia è iniziato dopo il 1923 in connessione con lo sviluppo del metodo di G. Rayon per ottenere il tossoide difterico.

L'agente eziologico della difterite appartiene al genere Corynebacterium (classe Actinobacteria). Morfologicamente, è caratterizzato dal fatto che le cellule sono a forma di bastoncello ispessite alle estremità (sogupe greco-macis), formano ramificazioni, specialmente nelle culture antiche e contengono inclusioni granulari.

Il genere Corynebacterium comprende un gran numero di specie, che sono divise in tre gruppi.

• I Corynebacteria sono parassiti di esseri umani e animali e patogeni per loro.
• Corynebacteria, patogeno per le piante.
• Corynebacteria non patogeno. Molte specie di Corynebacterium sono normali abitanti della pelle, della gola mucosa, del rinofaringe, degli occhi, del tratto respiratorio, dell'uretra e degli organi genitali.

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Morfologia dei corinebatteri

C. Diphtheriae - bastoncini dritti o leggermente curvi di 1,0-8,0 μm di lunghezza e 0,3-0,8 μm di diametro, non formano spore e capsule. Molto spesso hanno gonfiore a una o entrambe le estremità, spesso contengono granuli metacromatici - grani voluti (polimetafosfati), che quando bluastra con blu di metilene acquisiscono un colore bluastro-viola. Per la loro individuazione, viene proposto uno speciale metodo di colorazione secondo Neisser. In questo caso, i bastoncini sono macchiati di giallo paglierino, mentre i chicchi volute sono di colore marrone scuro e solitamente si trovano ai poli. Il Corynebacterium diphtheriae è ben colorato con coloranti all'anilina, Gram-positivi, ma nelle vecchie culture è spesso scolorito e ha una colorazione Gram negativa. È caratterizzato da un forte polimorfismo, specialmente nelle culture antiche e sotto l'influenza di antibiotici. Il contenuto di G + C nel DNA è di circa 60 moli%.

Proprietà biochimiche dei corinebatteri

Difterite bacillus è un aerobio o facoltativa temperatura ottimale per la crescita anaerobio 35-37 ° C (15-40 ° C confine crescita), il pH ottimale di 7,6-7,8. Per i mezzi nutritivi non è molto impegnativo, ma cresce meglio su supporti contenenti siero o sangue. Difterite selettivo per i batteri sono laminati o liquido siero Roux Leffler, la crescita su essi compare in 8-12 ore come convesso, dimensioni di una colonia spillo grigiastro colore bianco o giallo-crema. La loro superficie è liscia o leggermente granulosa, sulla periferia della colonia un po 'più trasparente rispetto al centro. Le colonie non si fondono, dando origine a una cultura che assomiglia a una pelle di colore verde. Sul brodo, la crescita si manifesta come un opacizzazione uniforme, o il brodo rimane trasparente, e sulla sua superficie si forma un film delicato che gradualmente si addensa, si sbriciola e si deposita sul fondo.

Una caratteristica dei batteri della difterite è la loro buona crescita su sangue e mezzi sierici contenenti concentrazioni di tellurito di potassio che sopprimono la crescita di altre specie batteriche. Ciò è dovuto al fatto che C. Diphtheriae ricostruisce la tellurite di potassio al tellurio metallico, che, depositato in cellule microbiche, conferisce alle colonie un caratteristico colore grigio scuro o nero. L'uso di tali mezzi aumenta la percentuale di semina di batteri difterici.

Corynebacterium diphtheriae viene fatto fermentare il glucosio, maltosio, galattosio per formare acido senza gas ma non fermentare (di solito) di saccarosio non hanno tsistinazu hanno ureasi e non formano indolo. Per questi motivi, sono diversi da quelli dei batteri corineformi (difteroidi), che sono più probabili sulla mucosa dell'occhio (Corynebacterium xerosus) e rinofaringe (Corynebacterium pseiidodiphtheriticum) e altri difteroidi.

In natura, ci sono tre varianti principali (biotipo) del bacillo difterite: gravis, intermedin e mitis. Differiscono in morfologico, culturale, biochimico e altre proprietà.

La divisione dei batteri della difterite in biotipi è stata effettuata prendendo in considerazione le forme di difterite in pazienti con cui sono assegnati con la massima frequenza. Il tipo di Gravis è più spesso isolato da pazienti con grave difterite e provoca razzi di gruppo. Il tipo mitis causa casi più leggeri e sporadici di malattie e il tipo intermedi occupa una posizione intermedia tra di loro. Il Corynebacterium belfanti, precedentemente attribuito al mitot dei biotipi, è isolato in un quarto, separato biotipo. La sua principale differenza dai biotipi gravis e mitis è la capacità di ripristinare i nitrati in nitriti. I ceppi Corynebacterium belfanti hanno pronunciato proprietà adesive e tra questi si trovano sia varianti tossigeniche che non tossigeniche.

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Struttura antigenica dei corinebatteri

Corynebacterium è molto eterogeneo e mosaico. Gli agenti causali della difterite di tutti e tre i tipi hanno rivelato diverse dozzine di antigeni somatici, secondo i quali sono divisi in sierotipi. In Russia, è stata adottata una classificazione sierologica, secondo la quale si distinguono 11 sierotipi di batteri difterici, 7 dei quali sono primari (1-7) e 4 sierotipi addizionali, raramente presenti (8-11). Sei sierotipi (1, 2, 3, 4, 5, 7) sono del tipo Gravis, e cinque (6,8,9,10,11) sono del tipo mitis. Lo svantaggio del metodo di sierotipizzazione è che molti ceppi, in particolare quelli non tossigenici, hanno agglutinazione spontanea o poliagglutinabilità.

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Cagotipirovanie Corynebacterium diphtheriae

Sono stati proposti diversi schemi di tipizzazione dei fagi per la differenziazione dei batteri della difterite. Nello Schema D. M. Krylova utilizzando un set di fagi 9 (A, B, C, D, F, G, H, I, K) può essere digitato maggior parte dei ceppi di tipo gravis tossigeni e nontoxigenic. Data la sensibilità alla detta fago, così come la cultura, proprietà antigeniche e la capacità di sintetizzare koritsiny (proteine battericide) MD Krylov allocato gruppi separati 3 tipo corinebatteri gravis (I-III). In ognuno di essi esistono sottogruppi di analoghi tossigenici e non tossigenici di agenti causali difterite.

Resistenza dei corinebatteri

Il Corynebacterium diphtheriae mostra una grande resistenza alle basse temperature, ma rapidamente perisce ad alte temperature: a 60 ° C - per 15-20 minuti, a ebollizione - dopo 2-3 minuti. Tutti i disinfettanti (lisolo, fenolo, cloramina, ecc.) Nella concentrazione comunemente usata la distruggono in 5-10 minuti. Tuttavia, l'agente eziologico della difterite sopporta bene l'essiccazione e può rimanere vitale per lungo tempo nel muco secco, nella saliva, nelle particelle di polvere. In aerosol a dispersione fine, i batteri difterici rimangono vitali per 24-48 ore.

Fattori di patogenicità dei corinebatteri

La patogenicità del Corynebacterium diphtheriae è determinata dalla presenza di un numero di fattori.

I fattori di adesione, colonizzazione e invasione

Le strutture responsabili dell'adesione non sono state identificate, ma senza di esse il bacillo difterico non ha potuto colonizzare le cellule. Il loro ruolo è svolto da alcuni componenti della parete cellulare del patogeno. Le proprietà invasive dell'agente causale sono associate a ialuronidasi, neuraminidasi e proteasi.

Il glicolipide tossico contenuto nella parete cellulare dell'agente patogeno. Rappresenta un 6,6'-diestere di trealosio contenente acido korinemikolovuyu (S32N6403) e acido korinemikolinovuyu (Sz2N62Oz) in rapporto equimolare (trealosio 6,6'-dikorinemikolat). Il glicolipide ha un effetto distruttivo sulle cellule dei tessuti nel sito di propagazione del patogeno.

Esotossina, che determina la patogenicità del patogeno e la natura della patogenesi della malattia. Le varianti non tossigeniche di C. Diphtheriae non provocano difterite.

L'esotossina viene sintetizzata come un precursore inattivo, una singola catena polipeptidica con un m. 61 kD. La sua attivazione viene effettuata proprio proteasi batterica che taglia in due polipeptide associato mediante legami disolfuro tra peptide A (P.M. 21 kDa) e B (P.M. 39 kDa). Il peptide accettore svolge una funzione - riconosce il recettore si lega ad esso e genera canale intramembranosa attraverso il quale entra nella cellula e peptide A vende attività biologica della tossina. Un peptide è un enzima ADP-riboziltransferazu che fornisce adenosina difosfato transfer ribosio dal NAD ad uno del residuo amminoacidico (istidina) la proteina fattore di allungamento EF-2. Come risultato della modifica, EF-2 perde la sua attività, e questo porta alla soppressione della sintesi proteica da parte dei ribosomi nella fase di traslocazione. La tossina sintetizza solo tali diphtheriae, che portano nel loro cromosoma i geni del moderato prophage di conversione. Dell'operone codificante per la sintesi tossina è monocistronic, esso consiste di 1,9 migliaia di coppie di basi e ha toxP promotore e 3 siti :. ToxS, Toxa e toxB. Trama toxS codifica 25 residui amminoacidici peptide segnale (che fornisce una resa di tossina attraverso la membrana nello spazio periplasmatico di una cellula batterica), Toxa - toxB 193 residui di amminoacido di Peptide A, e - residui amminoacidici 342 nella tossina peptide. La perdita del prophage cellulare o della mutazione nell'operone tox rende la cellula maltossigena. Al contrario, la lisogenizzazione di C. Diphtheriae non tossigenica dal fago convertente li trasforma in batteri tossigenici. Ciò è dimostrato in modo inequivocabile: la tossigenicità dei batteri della difterite dipende dalla loro lisogenizzazione mediante la conversione dei nucleotidi macroscopici. Korinefagi integrato nel cromosoma dei batteri corineformi utilizzando un meccanismo di ricombinazione sito-specifica, e difterite ceppi batterici possono contenere nel loro cromosoma a 2 siti di ricombinazione (attB), e korinefagi integrato in ciascuno di essi con la stessa frequenza.

Analisi genetica di una serie ceppo nontoxigenic difterite batteri condotti utilizzando sonde di DNA marcate recanti frammenti tox-operone korinefaga ha mostrato che i loro cromosomi sono sequenze di DNA omologo tox-operone korinefaga ma o codificare polipeptidi inattivi o sono in " stato "silenzioso", cioè inattivo. In questo contesto v'è una questione molto importante è se epidemiologicamente difterite batteri nontoxigenic diventano tossinogeno in vivo (nel corpo), così come avviene in vitro? La possibilità di tale conversione culture nontoxigenic in corinebatteri tossigeno utilizzando conversione fago è stato dimostrato in esperimenti su cavie, embrioni di pollo e topi bianchi. Tuttavia, se questo si verifica durante un naturale processo epidemico (e se sì, con quale frequenza), non è stato ancora possibile stabilirlo.

A causa del fatto che la tossina difterica nel corpo dei pazienti è effetti selettivi e specifici su alcuni sistemi (colpisce principalmente sistema simpatico-surrenale, cuore, vasi sanguigni e nervi periferici), allora ovviamente, non solo inibisce la biosintesi delle proteine nelle cellule, ma anche causa altri disturbi del loro metabolismo.

Per rilevare la tossicità dei batteri della difterite, è possibile utilizzare i seguenti metodi:

• Test biologici sugli animali Infezione intracutanea di porcellini d'India con un filtrato di coltura di brodo di batteri difterite provoca loro necrosi nel sito di somministrazione. Una dose minima letale di tossina (20-30 ng) uccide un porcellino d'India del peso di 250 g con un'iniezione sottocutanea il 4-5 ° giorno. La manifestazione più caratteristica dell'azione della tossina è la sconfitta delle ghiandole surrenali, esse sono ingrandite e fortemente iperemiche.
• Infezione di embrioni di pulcino. La tossina della difterite provoca la loro morte.
• Infezione di colture cellulari. La tossina difterica provoca un distinto effetto citopatico.
• Metodo di saggio immunoassorbente legato all'enzima in fase solida usando antitossine marcate con perossidasi.
• Uso di una sonda di DNA per il rilevamento diretto dell'operone tossico nel cromosoma dei batteri difterici.

Tuttavia, il modo più semplice e comune per determinare la tossicità dei batteri difterici è il metodo sierologico di precipitazione nel gel. L'essenza di questo è il seguente. Una striscia di carta filtro sterile da 1,5 x 8 cm bagnato siero difterite antitoxic contenente 500 AE 1 mL, e applicato alla superficie del terreno in una capsula di Petri. La tazza è asciugata in un termostato per 15-20 minuti. Le colture di test sono inoculate con placche su entrambi i lati del foglio. Diversi ceppi sono seminati su una tazza, uno dei quali, noto per essere tossico, funge da controllo. Tazze con colture sono state incubate a 37 ° C, i risultati permettono per 24-48 ore. Due gel interdiffusione antitossina e la tossina al sito della loro interazione forma una linea di precipitina chiaro che si fonde con il controllo della linea di precipitina ceppo tossigenici. Strisce di precipitazione aspecifica (si formano, se l'antitossina siero presente oltre a piccole quantità di altri anticorpi anti-microbici) appaiono successivamente, sono lievi e non si fondono con una striscia di ceppo di controllo precipitazione.

Immunità postinfettiva

Raramente si osservano casi di malattia ripetuti, forti, persistenti, praticamente per tutta la vita - nel 5-7% dei pazienti che si sono ripresi. L'immunità è principalmente antitossica, gli anticorpi antimicrobici sono meno importanti.

Per valutare il livello di immunità antidifterica, il test di Shik è stato precedentemente ampiamente utilizzato. A tal fine, 1/40 Dim di tossina per porcellino d'India è stato iniettato per via intradermica ai bambini in un volume di 0,2 ml. Se nessuna immunità antitoxic 24-48 ore al sito di iniezione appare arrossamento e gonfiore di più di 1 cm di diametro. Tale reazione positiva Schick indica o una completa assenza di anti-tossina o che il suo contenuto è inferiore a 0,001 AU / ml di sangue. La reazione negativa di Chick si osserva quando il contenuto di antitossina nel sangue è superiore a 0,03 AE / ml. Se il contenuto di antitossina è inferiore a 0,03 AE / ml, ma superiore a 0,001 AE / ml, la reazione Shick può essere positiva o, a volte, negativa. Inoltre, la tossina stessa ha una proprietà allergenica pronunciata. Pertanto, per determinare il livello di immunità antidiphtheria (contenuto antitossina quantitativa) migliore utilizzo TPHA Diagnostico con eritrociti sensibilizzati anatossina difterica.

Epidemiologia della difterite

L'unica fonte di infezione è una persona - un portatore malato, convalescente o sano. L'infezione avviene attraverso goccioline di bordo, aria di polvere da, così come attraverso una varietà di oggetti che erano in uso in pazienti o batteri portatori sani: pentole, libri, biancheria, giocattoli, ecc Nel caso di infezione alimentare (latte, panna, ecc .... Ecc.), è possibile essere infettati da una via alimentare. L'escrezione più massiccia dell'agente patogeno si verifica nella forma acuta della malattia. Tuttavia, il più epidemiologicamente importante sono le persone con forme cancellate e atipiche della malattia, poiché spesso non sono ospedalizzate e non sono immediatamente evidenti. Il paziente affetto da difterite è contagioso durante l'intero periodo della malattia e parte del periodo di recupero. Il periodo medio di trasporto dei batteri nei convalescenti varia da 2 a 7 settimane, ma può durare fino a 3 mesi.

Un ruolo speciale nell'epidemiologia della difterite è svolto da portatori batterici sani. In condizioni di morbilità sporadica, sono i principali distributori di difterite, contribuendo alla conservazione del patogeno in natura. La durata media del trasporto di ceppi tossigenici è leggermente inferiore (circa 2 mesi) rispetto ai ceppi non tossigenici (circa 2-3 mesi).

La ragione per la formazione di un portatore sano di batteri difterite tossigenici e non tossigenici non è completamente rivelata, poiché anche un alto livello di immunità antitossica non sempre garantisce il rilascio completo dell'organismo dal patogeno. Forse, il livello di immunità antibatterica ha una certa importanza. Il trasporto di ceppi tossigenici di batteri difterici è di primaria importanza epidemiologica.

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Sintomi di difterite

Le persone di qualsiasi età sono suscettibili alla difterite. L'agente causale può penetrare nel corpo umano attraverso le mucose di vari organi o attraverso la pelle danneggiata. A seconda del processo di localizzazione si distinguono difterite gola, naso, gola, orecchie, occhi, genitali e la pelle. Possibili forme miste, ad esempio difterite di gola e pelle, ecc. Periodo di incubazione - 2-10 giorni. Se forma clinicamente significativa della difterite nel luogo di localizzazione del patogeno sviluppa caratteristica infiammazione della mucosa fibrina. La tossina prodotta dal patogeno colpisce prima le cellule epiteliali e quindi i vasi sanguigni vicini, aumentandone la permeabilità. L'essudato effluente contiene fibrinogeno, coagulazione che provoca la formazione sugli attacchi vaporosi grigio-bianco superficie mucosa che strettamente saldati al tessuto soggetto e strappando da provocare il sanguinamento. La conseguenza della sconfitta dei vasi sanguigni può essere lo sviluppo di edema locale. Particolarmente pericolosa è la faringe difterite, poiché può causare la difterite groppa a causa di un edema della mucosa della laringe e le corde vocali, che in precedenza muoiono per asfissia 50-60% dei pazienti con i bambini della difterite. La tossina della difterite, entrando nel sangue, provoca una generale intossicazione profonda. Colpisce principalmente il sistema cardiovascolare, simpatico-surrenale e i nervi periferici. Così, i sintomi della difterite sono formati da una combinazione di sintomi locali, a seconda della posizione del cancello, ed i sintomi generali causati da avvelenamento tossina e si manifestano in forma di adynamia, letargia, pallore della pelle, abbassando la pressione sanguigna, miocardite, paralisi, e altri disturbi nervosi periferici. La difterite nei bambini vaccinati, se presente, si verifica, di regola, in forma lieve e senza complicazioni. La mortalità nel periodo prima dell'applicazione di seroterapie e antibiotici era del 50-60%, ora - 3-6%.

Diagnostica di laboratorio di difterite

L'unico metodo di diagnosi microbiologica della difterite è batteriologico, con test obbligatorio della coltura isolata dei corinebatteri per tossigenicità. Gli studi batteriologici sulla difterite sono condotti in tre casi:

• per la diagnosi di difterite nei bambini e negli adulti con processi infiammatori acuti nell'area della gola, naso, rinofaringe;
• sulle indicazioni epidemiologiche di persone che erano in contatto con la fonte dell'agente causativo della difterite;
• persone recentemente ammesse a orfanotrofi, asili nido, convitti e altri istituti speciali per bambini e adulti, al fine di identificare tra loro possibili portatori di batteri difterite bacillus.

Il materiale per la ricerca è il muco della faringe e del naso, il film delle tonsille o altre membrane mucose, che sono la porta d'ingresso del patogeno. Colture producono telluritovye sul siero o di sangue e il mezzo simultaneamente mezzo siero despread Roux (siero di cavallo piegato) o Leffler (3 parti di siero bovino e 1 parte di brodo zucchero), in cui corinebatteri crescita appare già dopo 8-12 ore. La cultura recuperata è stata individuata dal un insieme di proprietà morfologiche, culturali e biochimiche, se possibile, usa metodi di tipizzazione del grigio e dei fagi. In tutti i casi, è necessario verificare la presenza di tossicità con uno dei metodi sopra indicati. Caratteristiche morfologiche delle Corynebacterium migliore studio utilizzando tre metodi di preparazione colorazione striscio: Gram, Neisser e blu di metilene (o blu di toluidina).

Trattamento di difterite

Un trattamento specifico per la difterite è l'uso di siero antitossico antidifterico contenente almeno 2000 UI per ml. Il siero viene somministrato per via intramuscolare a dosi comprese tra 10.000 e 400.000 UI, a seconda della gravità del decorso della malattia. Un metodo efficace di trattamento è l'uso di antibiotici (penicilline, tetracicline, eritromicina, ecc.) E preparati sulfanilamide. Per stimolare lo sviluppo delle proprie antitossine, si può usare un'anatoxina. Per il rilascio del trasporto batterico dovrebbero essere usati quegli antibiotici a cui questo ceppo di corinebatteri è altamente sensibile.

Profilassi specifica della difterite

Il principale metodo di controllo della difterite è una massiccia vaccinazione di routine della popolazione. A tal fine, varie forme di realizzazione utilizzano vaccini, tra cui combinazione, cioè. E. Finalizzato alla creazione simultanea di immunità contro diversi agenti patogeni. Il vaccino più comune in Russia era il DTP. Si adsorbito un idrossido di alluminio batteri slurry pertosse uccisi con formalina o thimerosal (20 miliardi in 1 ml), e comprende una dose tossoide difterico flocculante di 30 unità e 10 unità di tetano legame di 1 ml tossoide. Vaccinare i bambini dai 3 mesi di età e poi condurre una rivaccinazione: prima tra 1,5-2 anni, follow-up all'età di 9 e 16 anni, e poi ogni 10 anni.

Grazie alla vaccinazione di massa avviata nell'URSS nel 1959, l'incidenza della difterite nel paese nel 1966 rispetto al 1958 è stata ridotta di 45 volte, e il tasso nel 1969 era 0,7 per 100.000 abitanti. Seguito negli anni '80. XX secolo. La riduzione del volume delle vaccinazioni ha comportato gravi conseguenze. Negli anni 1993-1996. La Russia è stata colpita dall'epidemia di difterite. Gli adulti erano malati, per lo più non vaccinati, e i bambini. Nel 1994 furono registrati quasi 40 mila pazienti. In relazione a ciò, è stata ripresa la vaccinazione di massa. Durante questo periodo, sono stati vaccinati 132 milioni di persone, compresi 92 milioni di adulti. Nel 2000-2001, la copertura dei bambini con vaccinazioni nel periodo prescritto era del 96% e il vaccino di richiamo del 94%. Grazie a ciò, l'incidenza della difterite nel 2001 è diminuita di 15 volte rispetto al 1996. Tuttavia, al fine di portare l'incidenza a singoli casi, è necessario coprire almeno il 97-98% dei bambini nel primo anno di vita con la vaccinazione e fornire negli anni successivi una dose di richiamo massiccia. Per ottenere l'eliminazione completa della difterite nei prossimi anni è improbabile che sia possibile a causa del diffuso vettore di batteri difterite tossigenici e non tossigenici. Ci vorrà del tempo per risolvere questo problema.