Diagnosi di herpes

La diagnosi dell'herpes si basa sull'isolamento classico del virus su colture cellulari sensibili, sull'immunofluorescenza e sui metodi sierologici, sull'esame colposcopico e sull'impiego di moderni metodi di biologia molecolare (PCR, ibridazione a punti), che consentono di diagnosticare l'intero gruppo di virus herpes, compresi i tipi HHV-6 e HHV-7.

Metodi diagnostici di laboratorio per l'infezione da herpes

I principali metodi volti all'isolamento dell'HSV o al rilevamento delle particelle virali e/o dei loro componenti	Metodi ausiliari volti a rilevare anticorpi contro l'HSV nei fluidi biologici del corpo umano
Isolamento dell'HSV in colture cellulari e animali sensibili Microscopia elettronica diretta e immunitaria Varianti dirette e indirette dell'IPA IFA Metodi biologici molecolari Reazione di agglutinazione al lattice	Reazione di neutralizzazione RSC Determinazione degli anticorpi contro le proteine non strutturali dell'HSV-1,2

È stato dimostrato che nel 76% dei pazienti l'herpes genitale (GH) è causato da HSV-2 e nel 24% da HSV-1. Inoltre, l'GH come monoinfezione si è verificata solo nel 22% dei pazienti, mentre nel 78% dei casi sono state rilevate associazioni microbiche. Nel 46% dei soggetti è stata rilevata una parassitocenosi causata da due patogeni, tra cui la clamidia, rilevata nel 40% dei casi. Gardnerella, Trichomonas e gonococchi sono stati rilevati meno frequentemente negli strisci.

Nel 27% dei pazienti, la parassitocenosi era rappresentata da tre patogeni, nel 5,2% da quattro patogeni. Inoltre, è stata osservata più frequentemente una combinazione di clamidia con funghi gardnerella e Candida. Questi dati confermano la necessità di un esame batteriologico approfondito dei pazienti con GH al fine di identificare combinazioni di agenti patogeni, nonché di uno studio approfondito della patogenesi delle infezioni miste del tratto urogenitale, che consentirà una terapia complessa e differenziata dell'infezione erpetica.

Materiali studiati per l'isolamento dell'HSV in funzione della localizzazione delle lesioni erpetiche

Localizzazione delle lesioni	Contenuto delle vescicole	Raschiamento cellulare				Liquido cerebrospinale	Aspirato bronchiale	Biopsia	Sangue
		1	2	3	4
Pelle	+								+
Occhi			+						+
Genitali				+					+
Ano	+				+				+
Bocca	+	+							+
SNC	+					+		+	+
Polmoni		+					+		+
Fegato								+	+
Herpes congenito	+	+	+				+		+

Metodi di diagnosi di laboratorio dell'infezione da citomegalovirus

Metodi	Tempo necessario per ottenere i risultati	Note
VIROLOGICO
Microscopia elettronica	3 ore	Non molto accessibile
Isolamento del virus in coltura cellulare (VCI)	4-20 giorni	Standard, Lento
Colorazione immunofluorescente dell'AG precoce mediante anticorpi monoclonali	6 ore	Meno specifico
CITOLOGICO	2-3 ore	Meno specifico
SIEROLOGICO
RSC	2 giorni	Standard
RGA	1 giorno	Ad alta intensità di lavoro
BARRIERA CORALLINA	6 ore	Semplice, specifico
NRIF	6 ore	Difficile
RIMP	6 ore	Difficile
ELISA (IgM, DO)	6 ore	Veloce, semplice
Immunoblot	6 ore	Costoso
BIOLOGICO MOLECOLARE
MG	5-7 giorni	Costoso e ad alta intensità di manodopera
PCR	3 ore	Costoso

Metodi di diagnosi del virus herpes zoster

Metodi diagnostici	Tecniche di laboratorio
INDIRETTO
Selezione	Colture tissutali, embrioni di pollo, animali da laboratorio, co-colture con cellule permissive o virus helper
Identificazione degli isolati	Reazione di neutralizzazione, RSC, IF, PIEF, reazione di precipitazione degli isolati, agglutinazione, IF
DIRETTO
Citologia	Strisci: immunofluorescenza a colori
Istologia	Patomorfologia della cellula
Struttura	Microscopia embrionale, microscopia immunoelettronica
Determinazione degli antigeni	SE, PIEF, RIM, IFA
Determinazione della produzione locale di anticorpi	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Approcci biologici molecolari	Ibridazione molecolare, PCR

Diagnosi di laboratorio dell'infezione causata dal virus herpes zoster

Problemi diagnostici	Metodi	Risultati attesi
Infezione primaria acuta	1	Rilevamento in 2 ore
	2	I livelli di anticorpi stanno aumentando lentamente
	3	Presente 3 giorni dopo l'infezione
Infezione acuta riattivata	1	Rilevamento di UUU dopo 2 ore
	2	I livelli di anticorpi stanno aumentando lentamente
	4	Presente 4 giorni dopo la comparsa dell'eruzione cutanea

1. determinazione delle vescicole del VEGF nel liquido;
2. sierologia: CSC, ELISA, finalizzata al rilevamento
3. sierologia: ELISA finalizzato alla rilevazione delle IgM;
4. sierologia: ELISA finalizzato alla rilevazione di IgA, IgM.

Metodi per indicare la risposta immunitaria all'infezione da virus herpes zoster

Approccio	Metodo
Rilevazione di un aumento del titolo anticorpale nel secondo siero	RSK, RTGA, RPGA, reazione di neutralizzazione IF, RIM, ELISA
Rilevazione di anticorpi specifici della classe Ig G, Ig A nel primo campione di siero	ELISA, IF, RIM, agglutinazione al lattice

Interpretazione dei risultati dell'esame sierologico del siero dei pazienti per le infezioni da herpesvirus (ELISA)

Nome dell'infezione/marcatore	Valori soglia medi per le infezioni
	Risultati dell'analisi	Interpretazione
Citomegalia Anti-CMV IgG (1-20 U/ml) IgM anti-CMV (100-300%)	Positivo 1-6 Positivo 6-10 Positivo >10 Negativo Positivo 100-300 Negativo <90 Dubbio 90-100	Remissione Esacerbazione della malattia Fase acuta della malattia Nessuna infezione (malattia) Fase acuta della malattia Ripetere l'analisi tra 2-3 settimane
Herpes simplex 1,2 sierotipi Anti-HSV 1/2 totale (100-900%)	Positivo 100-400 Positivo 400-800 Positivo >800 Negativo <100	Remissione Esacerbazione della malattia Fase acuta della malattia Nessuna infezione (malattia)

Nella tabella sono presentati i principali metodi di diagnosi di laboratorio delle infezioni da herpesvirus, nonché i materiali biologici raccomandati che vengono esaminati durante l'isolamento dell'HSV, tenendo conto della localizzazione delle lesioni erpetiche.

Isolamento affidabile dei virus herpes simplex e CMV mediante l'infezione di colture cellulari sensibili. Pertanto, durante l'esame virologico di 26 pazienti durante il periodo di ricaduta, l'HSV è stato isolato su una coltura cellulare sensibile Vero in 23 casi (88,4%). Le colture infette hanno mostrato un quadro di azione citopatica tipico dell'HSV: la formazione di cellule giganti multinucleate o un accumulo di cellule rotondeggianti e ingrandite sotto forma di cluster. Nel 52,1% dei casi, i focolai di azione citopatica del virus sono stati rilevati già 16-24 ore dopo l'infezione. Entro 48-72 ore di incubazione delle colture infette, la percentuale di materiali che causavano la distruzione specifica delle cellule è aumentata all'87%. E solo nel 13% dei casi sono stati rilevati risultati positivi 96 ore dopo l'infezione o più o durante ripetuti passaggi.

Metodi di diagnosi di laboratorio dell'infezione generalizzata da herpes

I principali metodi volti a rilevare (isolare) i virus herpes, le loro particelle e i loro componenti

Metodi ausiliari volti a rilevare anticorpi contro i virus dell'herpes nei fluidi biologici, rilevando spostamenti enzimatici nel siero sanguigno

Isolamento di virus herpes su colture cellulari e animali sensibili Microscopia elettronica diretta e immunitaria Varianti dirette e indirette del metodo dell'immunoperossidasi Varianti dirette e indirette del metodo dell'anticorpo fluorescente Varianti dell'immunoanalisi enzimatica in fase solida Varianti del metodo di ibridazione molecolare (DNA-DNA) Reazione a catena della polimerasi Reazione di agglutinazione al lattice

Test di neutralizzazione Test di fissazione del complemento Test di agglutinazione al lattice Versione indiretta del metodo dell'anticorpo fluorescente Versione indiretta del metodo dell'immunoperossidasi Varianti dell'immunoanalisi enzimatica in fase solida Metodo dell'immunoblotting Metodo di fissazione radiale del complemento Determinazione dei livelli di alanina e aspartato aminotransferasi

Per diagnosticare la mononucleosi infettiva (un'infezione causata dal virus di Epstein-Barr), si utilizzano metodi sierologici. La reazione di Paul-Bunnell con globuli rossi di montone, un titolo diagnostico di 1:28 o superiore in un singolo test sierologico, o un aumento di 4 volte degli anticorpi nell'esame di sieri appaiati, viene utilizzata. Viene utilizzata la reazione di Hoff-Bauer con una sospensione al 4% di globuli rossi di cavallo formalizzati. Il risultato viene preso in considerazione dopo 2 minuti; nella mononucleosi infettiva, la reazione è altamente specifica.

Attualmente è in fase di sviluppo un metodo immunoenzimatico (EIA) per la diagnosi della mononucleosi infettiva. In questo caso, gli anticorpi IgG e IgM nel siero del paziente vengono determinati incubandolo con linfoblasti infettati da EBV, seguito da trattamento con anticorpi fluorescenti. Nella fase acuta della malattia, gli anticorpi contro l'antigene del capside virale vengono determinati a un titolo di 1:160 e superiore.

Utilizzando diversi sistemi di test commerciali importati, l'ELISA può rilevare: anticorpi contro gli anticorpi dell'involucro di EBV, anticorpi contro l'antigene precoce di EBV, anticorpi totali contro l'antigene precoce di EBV, determinati nella fase acuta della malattia sia nel nucleo che nel citoplasma cellulare, e anticorpi limitati contro l'antigene precoce di EBV, determinati nella fase acuta della malattia sia nel nucleo che nel citoplasma cellulare, anticorpi limitati contro l'antigene precoce di EBV, determinati al culmine della malattia solo nel citoplasma cellulare, e anticorpi contro l'antigene nucleare di EBV. L'utilizzo di questi sistemi di test consente la diagnosi differenziale di diverse patologie associate all'EBV.

Dopo un test ELISA positivo che rivela anticorpi contro l'EBV, viene eseguita una reazione di immunoblotting di conferma, che determina la presenza di anticorpi contro le singole proteine marcatrici dell'EBV (proteine p): p23, p54, p72 (la presenza di questa proteina indica la possibilità di riproduzione dell'EBV), p 138. I metodi di laboratorio sopra descritti vengono utilizzati anche per monitorare l'efficacia del trattamento.

La sensibilità dei metodi virologici è dell'85-100%, la specificità del 100% e il tempo di studio è di 2-5 giorni. Il metodo di immunofluorescenza diretta (DIF) con anticorpi policlonali o monoclonali contro HSV-1 e HSV-2 è spesso utilizzato nella pratica clinica. Il metodo DIF è facilmente riproducibile in un normale laboratorio clinico, non è costoso, la sensibilità è superiore all'80% e la specificità è del 90-95%. La microscopia a immunofluorescenza ha rivelato la presenza di inclusioni citoplasmatiche, caratteristiche morfologiche e la percentuale di cellule infette in strisci/raschiati prelevati da uretra, canale cervicale, cervice e retto.

Il metodo PIF fornisce un'idea delle proprietà morfologiche delle cellule e dei cambiamenti nella localizzazione degli antigeni dell'HSV. Oltre ai segni diretti di danno cellulare da virus erpetici (rilevamento di luminescenza specifica), i dati PIF mostrano segni indiretti di infezione da herpes:

• aggregazione di materia nucleare, distacco del cariolemma;
• la presenza dei cosiddetti nuclei “buchi”, quando del nucleo cellulare rimane un solo cariolemma;
• la presenza di inclusioni intranucleari - corpi di Cowdry.

Durante l'esecuzione del PIF, il medico riceve non solo una valutazione qualitativa, ma anche quantitativa dello stato delle cellule infette, che abbiamo utilizzato per valutare l'efficacia della terapia antivirale con aciclovir (AC). Pertanto, 80 pazienti con herpes genitale semplice (GH) sono stati esaminati utilizzando il metodo PIF in dinamica. È stato dimostrato che se prima del trattamento con aciclovir, l'88% dei pazienti presentava un'alta percentuale di cellule infette (50-75% e oltre) negli strisci, dopo un ciclo di aciclovir, sono state rilevate cellule sane negli strisci del 44% dei pazienti, nel 31% dei casi sono state rilevate singole cellule infette e nel 25% dei pazienti si è riscontrata fino al 10% di cellule infette.

Contenuto di cellule infette negli strisci (reazione PIF) di pazienti con herpes genitale trattati con aciclovir

Periodi di malattia	Contenuto percentuale negli strisci
	Cellule infette					Cellule normali
	Più del 75%	50-75%	40-50%	10%	Singole cellule nel campo visivo
Recidiva (prima del trattamento)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Remissione (dopo il trattamento)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

Utilizzando il PIF e il metodo di ibridazione dot per molti anni, si è notato che i risultati dello studio coincidono in quasi il 100% dei casi. È importante sottolineare che, per aumentare l'affidabilità della diagnosi di herpes, soprattutto nei casi di forme subcliniche e poco manifeste, si raccomanda di utilizzare 2-3 metodi di diagnostica di laboratorio, soprattutto quando si esaminano donne in gravidanza, donne con una storia ostetrica sfavorevole e persone con diagnosi ginecologica non specificata.

Pertanto, nella diagnostica PCR delle infezioni virali e batteriche del tratto urogenitale, è necessario valutare i risultati positivi ottenuti tenendo conto dell'anamnesi e della presenza (o assenza) di sintomi clinici specifici della malattia. Se la clamidia viene rilevata mediante PCR, allora in questo caso vi è un'alta probabilità di infezione e le problematiche terapeutiche possono essere risolte di conseguenza. In caso di rilevamento di micoplasmi (ureaplasmi), che sono microrganismi opportunisti, sono necessari ulteriori studi colturali per confermare la diagnosi, ovvero la semina di materiale del paziente su colture cellulari sensibili. Solo se si ottengono risultati positivi nell'analisi colturale si può parlare di conferma di laboratorio della diagnosi di micoplasmosi. Lo stesso metodo consentirà, se necessario, di determinare la sensibilità dei micoplasmi isolati alle forme di dosaggio di uso comune (antibiotici, fluorochinoloni, ecc.).

È possibile l'infezione simultanea con diversi virus della famiglia Herpesviridae. Abbiamo spesso rilevato l'infezione di un paziente con i virus HSV-1, HSV-2 e CMV. I pazienti con manifestazioni cliniche e di laboratorio di IDS secondaria (pazienti oncoematologici, oncologici, con infezione da HIV) presentavano significativamente più frequentemente infezioni da diversi virus herpes. Pertanto, è stato dimostrato che i disturbi clinici e immunologici che progrediscono nell'infezione da HIV sono accompagnati da un aumento del numero di virus herpes rilevati con il metodo di ibridazione molecolare. In questo caso, il più significativo dal punto di vista prognostico può essere considerato il rilevamento simultaneo complesso di DNA di tipo HSV-1, CMV e HHV-6.

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