Diagnosi di laboratorio della tubercolosi

La tubercolosi è una malattia facilmente diagnosticabile grazie alle condizioni moderne e ai progressi scientifici. La diagnosi di laboratorio della tubercolosi occupa un posto centrale tra gli altri metodi diagnostici, seconda solo ai metodi radiologici.

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Esame clinico del sangue

Nei pazienti con tubercolosi, le alterazioni degli esami ematochimici generali non sono patognomoniche. Nelle forme limitate e debolmente attive di tubercolosi, è caratteristica l'ipocromia degli eritrociti con un numero normale. Negli infiltrati massivi o nella polmonite caseosa, con linfoadenite caseosa diffusa, danno intestinale specifico, nonché in caso di emorragie polmonari estese o postoperatorie, si osservano eritropenia e microcitosi, oligocromasia e policromasia. La macrocitosi, e soprattutto la poichilocitosi, si riscontrano molto meno frequentemente, solitamente in caso di anemia grave. Il numero di reticolociti nello stadio compensato della tubercolosi varia dallo 0,1 allo 0,6%, nello stadio subcompensato dallo 0,6 all'1,0% e, nello stadio scompensato, è caratteristico l'1% di reticolociti.

In alcuni casi di tubercolosi si può osservare una leucocitosi moderata (fino a 15 mila leucociti), meno frequentemente leucopenia, che si verifica nel 2-7% dei casi nei pazienti con forme limitate e lievi del processo e nel 12,5% nella tubercolosi polmonare distruttiva e progressiva.

Nella maggior parte dei casi, si verificano alterazioni nella formula leucocitaria. Si osserva neutrofilia sia relativa che assoluta, con una moderata deviazione della formula leucocitaria verso sinistra, verso i promielociti. I mielociti si riscontrano molto raramente nei casi di tubercolosi non complicata. Un aumento del numero di neutrofili con granularità patologica nell'emogramma di un paziente con tubercolosi indica sempre la durata del processo: nei pazienti con tubercolosi grave, quasi tutti i neutrofili presentano granularità patologica. Quando un'epidemia di tubercolosi si placa, la deviazione nucleare torna alla normalità relativamente rapidamente. La granularità patologica dei neutrofili di solito persiste più a lungo di altre alterazioni nell'emogramma.

Anche il contenuto di eosinofili nel sangue periferico varia a seconda della fase del processo e dello stato allergico dell'organismo. Il loro numero diminuisce fino a raggiungere l'aneosinofilia nelle epidemie gravi e prolungate e, al contrario, aumenta durante il riassorbimento degli infiltrati e del versamento pleurico, nonché nelle forme precoci di tubercolosi primaria.

La maggior parte delle forme di tubercolosi primaria è accompagnata da linfopenia, che a volte si osserva per diversi anni anche dopo la cicatrizzazione di specifiche alterazioni. La tubercolosi secondaria in fase acuta, a seconda della gravità del processo, può essere accompagnata da un numero normale di linfociti o da linfopenia.

Tra i test per la valutazione del processo tubercolare, un posto speciale è occupato dalla determinazione della velocità di eritrosedimentazione (VES), importante per valutare il decorso del processo tubercolare e identificarne le forme attive. Un aumento della VES indica la presenza di un processo patologico (infettivo e infiammatorio, purulento, settico, emoblastosi, linfogranulomatosi, ecc.) e funge da indicatore della sua gravità, ma valori normali di VES non sempre indicano l'assenza di patologia. L'accelerazione della sedimentazione eritrocitaria è facilitata da un aumento del contenuto di globuline, fibrinogeno e colesterolo nel sangue e da una diminuzione della viscosità del sangue. Il rallentamento della sedimentazione eritrocitaria è caratteristico di condizioni accompagnate da emoconcentrazione, aumento del contenuto di albumine e acidi biliari.

L'emocromo dei pazienti affetti da tubercolosi cambia durante il trattamento. Maggiore è l'efficacia dell'intervento terapeutico, più rapida è la scomparsa delle alterazioni ematologiche. Allo stesso tempo, è importante tenere presente l'effetto di vari farmaci antibatterici sull'emopoiesi. Spesso causano eosinofilia, in alcuni casi leucocitosi e, più spesso, leucopenia fino ad agranulocitosi e reazione linfoide-reticolare. Il monitoraggio ematologico sistematico e la corretta analisi dei dati ottenuti sono essenziali per valutare le condizioni cliniche del paziente, la dinamica del processo e l'efficacia del trattamento.

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Analisi clinica delle urine

In caso di tubercolosi delle vie urinarie, l'analisi delle urine è il principale metodo diagnostico di laboratorio. Si possono osservare leucocituria, eritrocituria, proteinuria, ipoisostenuria, micobatteriuria tubercolare e batteriuria aspecifica.

La leucocituria è il sintomo più comune della tubercolosi delle vie urinarie prima della chemioterapia specifica ed è assente solo in casi eccezionali, come la completa obliterazione del lume ureterale. Il test di Nechiporenko (determinazione del numero di leucociti in 1 ml di urina) aiuta a valutare in modo più oggettivo il grado di leucocituria nella nefrotubercolosi e, in alcuni casi, a rilevarla con una normale analisi delle urine. Tuttavia, è necessario tenere presente che la leucocituria può verificarsi in caso di pielonefrite acuta e cronica, cistite, uretrite, calcoli renali e ureteri.

L'eritrocituria, come la leucocituria, è considerata uno dei segni di laboratorio più comuni della tubercolosi genitourinaria. La frequenza dell'ematuria dipende dalla prevalenza del processo e aumenta con lo sviluppo del processo tubercolare distruttivo nel rene. L'eritrocituria senza leucocituria è più tipica delle fasi precoci della tubercolosi renale. L'ematuria, prevalente sulla leucocituria, è un importante argomento a favore della tubercolosi renale quando si differenzia dalla pielonefrite aspecifica.

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Esame del sangue biochimico

Nella tubercolosi, le alterazioni di alcuni indici biochimici dipendono principalmente dalla fase del processo, dalle complicazioni e da varie patologie concomitanti. Nei pazienti con tubercolosi polmonare e di altri organi inattiva, le proteine totali e le frazioni proteiche del siero sanguigno non subiscono alterazioni e ne determinano il contenuto normale.

Nelle forme acute della malattia, così come nell'esacerbazione e nella progressione delle forme croniche della tubercolosi, il coefficiente albumina-globulina diminuisce.

Di notevole importanza nella valutazione dello stato funzionale e del danno organico al fegato nella tubercolosi e nelle sue complicanze è la determinazione della bilirubina diretta e totale, dell'aspartato aminotransferasi (AST) e dell'alanina aminotransferasi (ALT) nel siero sanguigno. La determinazione dinamica del livello di aminotransferasi nel trattamento dei pazienti con tubercolosi, soprattutto nelle sue forme gravi, è una componente obbligatoria dell'esame biochimico dei pazienti con tubercolosi e viene eseguita mensilmente.

La valutazione dello stato funzionale dei reni include la determinazione della creatinina sierica e il calcolo della velocità di filtrazione glomerulare utilizzando la formula di Cockcroft-Gault. Il calcolo della velocità di filtrazione glomerulare utilizzando il test di Reberg fornisce risultati meno accurati.

L'obiettivo principale degli studi biochimici dinamici sui pazienti affetti da tubercolosi è il monitoraggio del decorso del processo, la tempestiva individuazione degli effetti collaterali dei farmaci e l'adeguata correzione dei disturbi dell'omeostasi emergenti.

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Applicazione di metodi di ricerca biochimica nella tubercolosi extrapolmonare

L'indicatore più informativo è considerato il contenuto di acido tubercolostearico nei fluidi biologici, tuttavia la sua determinazione è associata a difficoltà tecniche (necessità di utilizzare la cromatografia gassosa e la spettrometria di massa).

È promettente misurare l'attività dell'adenosina deaminasi, un enzima presente nei fluidi: sinoviale, pericardico, ascitico o cerebrospinale. I principali produttori di adenosina deaminasi sono linfociti e monociti. La determinazione dell'attività dell'adenosina deaminasi nei fluidi biologici facilita la diagnosi di sinovite tubercolare, tubercolosi dei linfonodi, meningite tubercolare e sierosite tubercolare.

Alcuni indicatori biochimici, a causa della loro aspecificità, vengono determinati solo nei fluidi biologici in prossimità della lesione. Il livello degli indicatori viene misurato in risposta alla somministrazione sottocutanea o intradermica di tubercolina (solitamente prima della somministrazione e 48 e 72 ore dopo). Successivamente, si calcola il grado di incremento del livello del marcatore (in %) rispetto al livello iniziale.

In modo ottimale, l'attività dell'enzima organo-specifico transamidinasi viene determinata nelle urine; la sua presenza è osservata in caso di danno renale di varia origine. Lo studio della transamidinasi è giustificato solo in caso di somministrazione sottocutanea di tubercolina al fine di esacerbare il processo infiammatorio locale. L'attività della transamidinasi viene determinata nelle urine inizialmente e 24-72 ore dopo la somministrazione di 50 TE di tubercolina. Un aumento della fermenturia di 2 volte o più consente nell'82% dei casi di differenziare la tubercolosi renale attiva dall'esacerbazione della pielonefrite cronica.

In caso di tubercolosi degli organi genitali femminili, le concentrazioni di aptoglobina e malondialdeide nel sangue vengono determinate nelle condizioni del test di provocazione tubercolinica. La tubercolina viene somministrata per via sottocutanea a una dose di 50 TE e si ripete l'esame biochimico dopo 72 ore. In caso di eziologia tubercolare, l'aumento del livello di aptoglobina è di almeno il 28% e quello della malondialdeide è del 39% o superiore. Viene inoltre utilizzata la determinazione dell'attività dell'adenosina deaminasi nel liquido peritoneale ottenuto dalla tasca di Douglas. La puntura viene nuovamente esaminata 72 ore dopo la somministrazione intradermica di tubercolina a dosi di 0,1 TE e 0,01 TE nell'area di proiezione degli organi genitali interni sulla parete addominale anteriore. Un aumento dell'attività dell'adenosina deaminasi pari o superiore al 10% rispetto al valore iniziale indica un processo tubercolare.

In caso di danno oculare, viene esaminata la reazione focale che si verifica nell'occhio in risposta alla stimolazione antigenica. In questo caso, lo sviluppo di una risposta nettamente espressa accompagnata da una riduzione delle funzioni visive è indesiderabile. Poiché la valutazione di reazioni focali minime è spesso difficile, si raccomanda di concentrarsi parallelamente sul grado di aumento dell'aptoglobina o dell'adenosina deaminasi nel siero sanguigno per oggettivare la conclusione.

Tutti gli studi biochimici devono essere effettuati in combinazione con altri metodi.

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Studio del sistema di coagulazione del sangue

L'importanza dello studio dello stato del sistema di coagulazione del sangue in tisiologia è dovuta alla presenza di emottisi o emorragie polmonari in numerosi pazienti con tubercolosi polmonare, nonché alle complicanze emocoagulative nel trattamento chirurgico della tubercolosi. Inoltre, l'emocoagulazione intravascolare latente, che si verifica naturalmente, influenza il decorso della malattia e l'efficacia della chemioterapia.

Nei pazienti con tubercolosi polmonare con una componente essudativa predominante dell'infiammazione, si osserva una diminuzione dell'attività anticoagulante del sangue. Nei pazienti con una bassa prevalenza di danno polmonare specifico con una componente produttiva predominante dell'infiammazione, l'emocoagulazione intravascolare è espressa in modo insignificante. Nei pazienti con tubercolosi polmonare con emottisi ed emorragie polmonari, lo stato del sistema di coagulazione del sangue è diverso: nei pazienti con perdite ematiche minori al culmine dell'emoptoea o immediatamente dopo la sua cessazione, si osserva un netto aumento della capacità coagulativa del sangue dovuto a una marcata intensificazione dei processi di formazione della trombina, pur mantenendo una maggiore coagulabilità "strutturale". Nei pazienti con massicce perdite ematiche, si osserva una diminuzione del potenziale di coagulazione dovuta a una diminuzione della concentrazione di fibrinogeno, dell'attività del fattore XIII e della conta piastrinica. Nella fase di trattamento chirurgico, nei pazienti con forme limitate di tubercolosi polmonare, non si verificano disturbi significativi del sistema omeostatico. Nei pazienti con processi diffusi, durante l'esecuzione di una pneumonectomia o di una pleuropneumonectomia, si sviluppa spesso la sindrome DIC, che può assumere la forma di una "seconda malattia".

Per monitorare lo stato del sistema di coagulazione del sangue nei pazienti affetti da tubercolosi polmonare, è necessario determinare il tempo di tromboplastina parziale attivata (APTT), il fibrinogeno, il tempo di trombina, l'indice di protrombina, nonché il tempo di sanguinamento e il tempo di coagulazione del sangue.

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Studi ormonali

Moderne osservazioni sperimentali e cliniche indicano la presenza di alterazioni dello stato ormonale in specifiche infiammazioni tubercolari polmonari. È stato dimostrato che la correzione della disfunzione dei sistemi ipofisi-surrene, ipofisi-tiroide e pancreatica, in combinazione con la terapia antitubercolare, contribuisce all'attivazione della fibrogenesi e dei processi di riparazione nel focolaio di infiammazione specifica.

Lo stato funzionale del sistema ipofisi-tiroide è valutato dal contenuto di triiodotironina (T3), tiroxina (T4) e ormone ipofisario tireostimolante (TSH) nel siero sanguigno _. È _stato stabilito che l'ipotiroidismo subclinico viene rilevato nel 38-45% dei pazienti con tubercolosi polmonare e viene diagnosticato più spesso nelle forme disseminate e fibroso-cavernose del processo. In queste forme, i livelli sia di T3 che di T4 sono più nettamente ridotti _{e si verificauno} squilibrio di questi ormoni sotto forma di un aumento del _{rapporto T4/} T3.

La funzionalità della corteccia surrenale viene valutata in base al livello sierico di cortisolo, mentre la funzionalità endocrina del pancreas viene valutata dalla concentrazione di insulina immunoreattiva. Nella fase acuta di una malattia infettiva, il fabbisogno di cortisolo endogeno e insulina aumenta. L'iperinsulinemia indica anche la resistenza all'insulina dei tessuti corporei, tipica di qualsiasi processo infiammatorio attivo, in particolare di uno specifico. La determinazione della funzione glucocorticoide delle ghiandole surrenali nella tubercolosi polmonare attiva consente di rilevare la presenza di ipercorticismo nella maggior parte dei pazienti. Concentrazioni normali di cortisolo nel sangue in un paziente con infiammazione infettiva nella fase acuta devono essere considerate come un'insufficienza relativa della funzione glucocorticoide della corteccia surrenale, che può servire come base per una terapia sostitutiva con dosi adeguate di glucocorticoidi.

Quasi un terzo dei pazienti con tubercolosi polmonare presenta un basso livello di insulinemia, prossimo al limite inferiore della norma, mentre il 13-20% presenta un iperinsulinismo significativo. Sia l'ipo- che l'iperinsulinismo relativo rappresentano fattori di rischio elevati per lo sviluppo di disturbi del metabolismo glucidico di varia gravità. Queste alterazioni nell'attività funzionale delle cellule B pancreatiche richiedono un monitoraggio regolare della glicemia nei pazienti con tubercolosi e una tempestiva prevenzione del diabete mellito. Inoltre, ciò costituisce un'ulteriore giustificazione per l'appropriatezza dell'utilizzo di dosi fisiologiche di insulina nella terapia complessa della tubercolosi.

In generale, la diminuzione dei livelli dell'ormone tiroideo, il suo squilibrio, l'ipercortisolemia e l'iperinsulinismo sono più pronunciati nei pazienti con un decorso grave del processo tubercolare, con lesioni polmonari estese e sintomi pronunciati di intossicazione tubercolare.

Diagnostica microbiologica della tubercolosi

Gli studi microbiologici sono necessari per identificare i pazienti affetti da tubercolosi, verificare la diagnosi, monitorare e correggere la chemioterapia, valutare i risultati del trattamento, in altre parole, dal momento in cui un paziente affetto da tubercolosi viene registrato fino alla sua cancellazione dal registro.

Tutti i programmi e i progetti epidemiologici si basano sulla valutazione del numero di escretori di batteri, un obiettivo impossibile da raggiungere senza l'utilizzo di metodi di laboratorio per l'individuazione dei micobatteri tubercolari. Esaminando l'attrattività della cosiddetta popolazione non organizzata, la percentuale di escretori di batteri raggiunge il 70% o più, il che rende i metodi di laboratorio un mezzo piuttosto efficace per identificare i pazienti tubercolari in questo gruppo di popolazione.

I metodi microbiologici tradizionali per la diagnosi della tubercolosi sono gli studi batterioscopici e colturali. I metodi moderni includono la coltura dei micobatteri tubercolari in sistemi automatizzati e la PCR. Tuttavia, tutti questi metodi sono necessariamente combinati con i metodi batteriologici classici.

Raccolta di materiale diagnostico

L'efficacia dei test di laboratorio dipende in larga misura dalla qualità del materiale diagnostico. Il rispetto delle norme per la raccolta, la conservazione e il trasporto del materiale diagnostico e la precisa implementazione dell'algoritmo di analisi del paziente influiscono direttamente sul risultato e garantiscono la sicurezza biologica.

Per i test della tubercolosi si utilizzano diversi materiali. Poiché la tubercolosi polmonare è la forma più comune di infezione tubercolare, il materiale principale per i test è considerato l'espettorato e altri tipi di secrezione dell'albero tracheobronchiale: secrezione delle vie respiratorie superiori ottenuta dopo inalazioni di aerosol: acque di lavaggio bronchiale; lavaggi broncoalveolari; materiale ottenuto durante broncoscopia, biopsia transtracheale e intrapolmonare: aspirato bronchiale, strisci laringei, essudati, strisci di ferite, ecc.

L'efficacia della ricerca aumenta se viene effettuata la raccolta controllata di materiale dal paziente. A tale scopo, viene assegnata una stanza appositamente attrezzata o vengono acquistate cabine specifiche. La raccolta di materiale è una procedura pericolosa, pertanto il materiale per la ricerca deve essere raccolto nel rispetto delle norme di sicurezza contro le infezioni.

Il materiale per i test sul Mycobacterium tuberculosis viene raccolto in fiale sterili con tappi ben avvitati per impedire la contaminazione dell'ambiente e proteggere il materiale raccolto dalla contaminazione.

Le fiale per la raccolta del materiale diagnostico devono soddisfare i seguenti requisiti:

• deve essere realizzato in materiale resistente agli urti;
• dovrebbe sciogliersi facilmente se sterilizzato in autoclave;
• avere un volume sufficiente (40-50 ml):
• avere un'ampia apertura per la raccolta dell'espettorato (diametro non inferiore a 30 mm);
• essere facili da maneggiare, trasparenti o traslucidi, in modo che sia possibile valutare la quantità e la qualità del campione raccolto senza aprire il coperchio.

Per ottenere risultati di ricerca ottimali, devono essere soddisfatte le seguenti condizioni:

• la raccolta del materiale deve essere effettuata prima dell'inizio della chemioterapia;
• il materiale per lo studio deve essere raccolto prima di mangiare o assumere farmaci al mattino;
• Per lo studio, si consiglia di raccogliere almeno 3 campioni di espettorato al mattino. L'espettorato viene raccolto per 3 giorni consecutivi;
• Il materiale raccolto deve essere consegnato al laboratorio il più presto possibile:
• nei casi in cui non sia possibile consegnare immediatamente il materiale al laboratorio, lo stesso viene conservato in frigorifero ad una temperatura dell'aria di 4 °C per non più di 48 ore;
• Durante il trasporto del materiale è necessario prestare particolare attenzione all'integrità delle bottiglie.

L'espettorato correttamente raccolto ha un aspetto mucoso o mucopurulento. Il volume ottimale della porzione di espettorato esaminata è di 3-5 ml.

L'espettorato viene raccolto sotto la supervisione di un operatore sanitario. Le persone responsabili della raccolta dell'espettorato devono garantire il rispetto di determinate regole:

• È necessario spiegare al paziente lo scopo dell'esame e la necessità di espettorare non la saliva o il muco nasofaringeo, ma il contenuto delle vie respiratorie profonde. Ciò può essere ottenuto grazie a una tosse produttiva che si verifica dopo diversi (2-3) respiri profondi. È inoltre necessario avvertire il paziente che deve prima sciacquare la bocca con acqua bollita per rimuovere la maggior parte della microflora vegetante nel cavo orale e i residui di cibo che complicano l'esame dell'espettorato;
• L'operatore sanitario addetto alla raccolta dell'espettorato, oltre al camice e alla cuffia, deve indossare una maschera, guanti di gomma e un grembiule di gomma;
• stando dietro al paziente, gli si consiglia di tenere la bottiglia il più vicino possibile alle labbra e di separare immediatamente l'espettorato al suo interno mentre lo espettora, mentre è necessario assicurarsi che il flusso d'aria sia diretto lontano dall'operatore sanitario:
• Una volta completata la raccolta dell'espettorato, l'operatore sanitario deve chiudere accuratamente il flacone con il tappo e valutare la quantità e la qualità dell'espettorato raccolto. Il flacone viene quindi etichettato e riposto in un apposito contenitore per il trasporto in laboratorio.

Se il paziente non produce espettorato, la sera prima e la mattina presto del giorno della raccolta del materiale, gli deve essere somministrato un espettorante: estratto di radici di Althea (mucaltina), bromexina, ambroxolo, ecc. - oppure si deve ricorrere a un'inalazione irritante, utilizzando l'apparecchiatura installata nella sala di raccolta dell'espettorato. Il materiale raccolto in questo modo non è soggetto a conservazione e deve essere esaminato il giorno della raccolta. Per evitarne il "rigetto" in laboratorio, è necessario annotare la richiesta nella documentazione clinica.

Se gli studi microbiologici non vengono eseguiti presso un determinato istituto, il materiale diagnostico raccolto deve essere consegnato centralmente al laboratorio, a condizione che venga conservato in frigorifero o con conservanti tra una consegna e l'altra. Il materiale viene consegnato al laboratorio in contenitori per il trasporto facilmente disinfettabili. Ogni campione deve essere provvisto di un'etichetta appropriata e l'intero lotto deve essere accompagnato da un modulo di accompagnamento compilato.

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Modalità e frequenza dell'esame dei pazienti

Durante l'esame iniziale, cosiddetto diagnostico, di un paziente affetto da tubercolosi, è necessario esaminare almeno 3 campioni di espettorato raccolti sotto la supervisione del personale medico nell'arco di 2 o 3 giorni, il che aumenta l'efficacia della microscopia.

Lo screening primario per la tubercolosi dovrebbe essere effettuato da tutte le strutture mediche e diagnostiche del sistema sanitario. Recentemente, per aumentare l'efficacia dell'esame primario, sono stati istituiti i cosiddetti centri di microscopia, basati su laboratori di diagnostica clinica, dotati di microscopi moderni e attrezzature per garantire la sicurezza in caso di epidemia.

Le strutture antitubercolari utilizzano un programma di indagine che prevede almeno 3 esami dell'espettorato o di altro materiale diagnostico entro 3 giorni. Durante il trattamento, gli esami microbiologici vengono eseguiti regolarmente almeno una volta al mese nella fase di chemioterapia intensiva. Passando alla fase di follow-up, gli esami vengono eseguiti meno frequentemente, a intervalli di 2-3 mesi, mentre la frequenza degli esami è ridotta a due.

Caratteristiche della raccolta del materiale diagnostico per la tubercolosi extrapolmonare

Una caratteristica del materiale patologico nelle forme extrapolmonari di tubercolosi è la bassa concentrazione in esso di micobatteri della tubercolosi, che richiede metodi più sensibili di ricerca microbiologica, principalmente metodi di semina su un terreno nutritivo.

In caso di tubercolosi genitourinaria, l'urina è il materiale più accessibile per l'esame. La raccolta delle urine deve essere eseguita da un infermiere specializzato.

I genitali esterni vengono lavati con acqua e sapone o con una soluzione diluita di permanganato di potassio. L'orifizio esterno dell'uretra viene trattato con cura. La porzione centrale dell'urina del mattino viene raccolta in un flacone sterile: negli uomini - naturalmente, nelle donne - utilizzando un catetere. L'urina dalla pelvi renale viene raccolta in provette sterili durante la cateterizzazione di uno o due reni, in quest'ultimo caso - necessariamente separatamente da ciascun rene. Una piccola quantità di quest'urina viene centrifugata e il sedimento viene esaminato.

Negli uomini, sperma, punture testicolari e secrezioni prostatiche vengono centrifugati per ottenere un sedimento. In caso di localizzazione di un processo specifico nell'area genitale maschile, il massaggio prostatico può favorire il rilascio di secrezioni contenenti micobatteri tubercolari.

Il sangue mestruale viene raccolto dalle donne tramite aspirazione o utilizzando una capsula di Kafka. Il materiale risultante viene separato dagli eritrociti mediante lavaggio con acqua distillata e successiva centrifugazione. Il sedimento viene esaminato.

Le secrezioni dal canale cervicale dell'utero vengono raccolte in un contenitore o tappo di Kafka, ovvero è preferibile accumulare 1-2 ml di materiale patologico.

Il materiale ottenuto durante interventi chirurgici su reni, genitali, biopsie e raschiamento endometriale viene omogeneizzato. A questo scopo, il materiale viene posto in un mortaio sterile e accuratamente frantumato con forbici sterili. Alla sospensione risultante viene aggiunta sabbia di fiume sterile in una quantità pari alla sua massa, quindi si aggiungono 0,5-1,0 ml di soluzione isotonica di cloruro di sodio e il tutto viene macinato fino a formare una massa pastosa con l'aggiunta di soluzione isotonica di cloruro di sodio (4-5 ml). Quindi la massa viene lasciata riposare per 1-1,5 minuti e il surnatante viene esaminato.

Tubercolosi ossea e articolare. Il campione di pus (da ascessi) prelevato con una siringa sterile viene raccolto in un contenitore sterile e immediatamente consegnato al laboratorio. Utilizzando una pipetta sterile, precedentemente inumidita con soluzione isotonica sterile di cloruro di sodio, si prelevano 2-5 ml di pus, che vengono trasferiti in un flacone con microsfere e a cui si aggiungono altri 2-3 ml di soluzione isotonica di cloruro di sodio. Il flacone viene chiuso con un tappo e agitato in uno shaker per 8-10 minuti. La sospensione omogeneizzata viene esaminata.

Nelle forme fistolose di tubercolosi osteoarticolare, il pus viene aspirato dalla fistola. La secrezione abbondante viene raccolta direttamente in una provetta. In caso di scarsa secrezione purulenta, il tratto fistoloso viene lavato con una soluzione isotonica sterile di cloruro di sodio e il liquido di lavaggio raccolto in una provetta o in un tampone imbevuto di pus viene inviato per l'esame.

Il materiale chirurgico ottenuto durante interventi chirurgici su ossa e articolazioni può essere costituito da masse purulento-necrotiche, granulazioni, tessuto cicatriziale, tessuto osseo, tessuto sinoviale e altri substrati. La sua lavorazione viene eseguita come nel caso della tubercolosi renale.

Subito dopo la puntura viene eseguito un esame microbiologico del liquido sinoviale in una soluzione di citrato di sodio al 3% (in rapporto 1:1) per prevenire la coagulazione.

Tubercolosi dei linfonodi. Il pus estratto durante la puntura dei linfonodi viene esaminato allo stesso modo del pus proveniente dagli ascessi. Il tessuto linfonodale ottenuto durante interventi chirurgici e biopsie viene esaminato come in altre forme di tubercolosi.

L'esame delle feci per la ricerca del Mycobacterium tuberculosis viene eseguito estremamente raramente a causa della quasi totale assenza di risultati positivi.

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Microscopia dei micobatteri

La microscopia dell'espettorato è un metodo relativamente rapido, semplice ed economico, che dovrebbe essere utilizzato in tutti i casi in cui si sospetta la tubercolosi. Inoltre, questo esame viene eseguito per valutare l'efficacia della chemioterapia e per confermare la guarigione o l'insuccesso del trattamento in assenza di risultati colturali.

Vengono utilizzati due metodi di esame microscopico:

• metodo di microscopia diretta, quando uno striscio viene preparato direttamente dal materiale diagnostico;
• un metodo di microscopia di sedimenti preparati da materiale trattato con decontaminanti per la ricerca culturale.

Il primo metodo viene utilizzato nei laboratori in cui vengono effettuati solo esami microscopici (laboratori di diagnostica clinica della rete medica generale).

I migliori risultati dell'esame microscopico si ottengono concentrando il materiale diagnostico (ad esempio mediante centrifugazione).

Per rilevare il Mycobacterium tuberculosis con una probabilità del 50% al microscopio, 1 ml di espettorato deve contenere più di 5.000 cellule microbiche. L'espettorato di pazienti con forme polmonari di tubercolosi contiene solitamente un numero significativo di batteri acido-resistenti, il che consente di rilevarli in modo affidabile mediante batterioscopia. La sensibilità diagnostica di questo metodo può essere aumentata esaminando diversi campioni di espettorato di un singolo paziente. Un risultato negativo dell'esame batterioscopico non esclude la diagnosi di tubercolosi, poiché l'espettorato di alcuni pazienti contiene meno Mycobacterium di quanto possa essere rilevato al microscopio. Anche una preparazione inadeguata degli strisci di espettorato può essere la causa di un risultato negativo dell'esame batterioscopico.

Il metodo più comune per rilevare i micobatteri acido-resistenti in uno striscio è la colorazione di Ziehl-Neelsen. Il metodo si basa sulla penetrazione della carbolfucsina in una cellula microbica attraverso una membrana che include uno strato ceroso-lipidico, con l'effetto simultaneo del riscaldamento e della forte azione di attacco del fenolo. La successiva decolorazione dello striscio con una soluzione al 25% di acido solforico o al 3% di alcol cloridrico porta alla decolorazione di tutte le strutture non acido-resistenti. Gli elementi decolorati dello striscio vengono colorati con una soluzione allo 0,3% di blu di metilene. I micobatteri non percepiscono i coloranti all'anilina convenzionali, per cui i micobatteri acido-resistenti si colorano di rosso lampone, mentre altri microbi ed elementi cellulari si colorano di blu.

Per esaminare gli strisci colorati secondo Ziehl-Neelsen, utilizzare un microscopio binoculare ottico con obiettivo a immersione (ingrandimento 90 o 100 volte) e un oculare con ingrandimento 7 o 10 volte. Vengono esaminati 100 campi visivi, sufficienti per rilevare singoli micobatteri nello striscio. Se il risultato di tale esame è negativo, si raccomanda di esaminare altri 200 campi visivi per conferma. I risultati vengono registrati, indicando il numero di micobatteri acido-resistenti (AFB) rilevati.

Oltre a questo metodo, la colorazione con fluorocromo viene utilizzata per la microscopia a luminescenza, che consente di ottenere risultati ottimali. L'utilizzo di questo metodo aumenta l'efficienza della microscopia del 10-15%. Quando i micobatteri vengono trattati con coloranti luminescenti (auramina, rodamina, ecc.), queste sostanze si legano anche alle strutture cerose della cellula microbica. Quando le cellule colorate vengono irradiate con una sorgente luminosa eccitante (un certo spettro di radiazioni ultraviolette), iniziano a brillare di arancione o rosso vivo su uno sfondo nero o verde scuro. Grazie all'elevata luminosità e al contrasto dell'immagine visibile, l'ingrandimento complessivo del microscopio può essere ridotto di 4-10 volte, ampliando il campo visivo e riducendo il tempo di osservazione del preparato. Inoltre, grazie alla profondità di campo significativamente maggiore, è possibile aumentare il comfort dell'esame.

Utilizzando la microscopia a fluorescenza, l'osservazione della stessa area di uno striscio richiede un tempo significativamente inferiore rispetto alla microscopia ottica di strisci colorati secondo Ziehl-Neelsen. Se un microscopista osserva circa 20-25 di questi strisci durante una giornata lavorativa, con l'ausilio della microscopia a fluorescenza può esaminare più di 60-80 campioni nello stesso tempo. I microscopisti esperti sanno che la colorazione delle cellule con una miscela di auramina e rodamina è in qualche modo specifica per i micobatteri acidoresistenti, che in questo caso hanno l'aspetto di bastoncelli d'oro. I saprofiti presentano una colorazione verdastra.

Un altro importante vantaggio del metodo di microscopia a fluorescenza è la capacità di rilevare micobatteri alterati che hanno perso le loro proprietà di resistenza agli acidi sotto l'influenza di una serie di fattori sfavorevoli, in particolare la chemioterapia intensiva, e che pertanto non vengono rilevati dalla colorazione di Ziehl-Neelsen.

Gli svantaggi del metodo di microscopia a fluorescenza includono il costo relativamente elevato del microscopio e del suo funzionamento. Tuttavia, nei laboratori centralizzati o di grandi dimensioni, dove il carico di lavoro supera la norma di tre tecnici di laboratorio che lavorano con tre microscopi convenzionali, risulta più economico utilizzare un solo microscopio a fluorescenza.

I metodi batterioscopici hanno una specificità piuttosto elevata (89-100%). Circa il 97% dei risultati positivi ottenuti con qualsiasi metodo microscopico è chiaramente confermato dai risultati della semina.

È importante notare che l'esame microscopico di uno striscio di materiale patologico non consente di determinare la specie dei micobatteri acido-resistenti rilevati. Il metodo microscopico consente di trarre conclusioni solo sulla presenza o assenza di microrganismi acido-resistenti nel preparato, il che è spiegato dall'esistenza in natura di un gran numero di microrganismi acido-resistenti non tubercolari morfologicamente simili ai micobatteri del complesso tubercolare.

La valutazione dei risultati della microscopia viene eseguita in unità semiquantitative.

Per poter confrontare i risultati di diversi metodi di microscopia, vengono introdotti coefficienti empirici. Ad esempio, per confrontare i risultati di uno striscio colorato con coloranti fluorescenti con i dati di uno studio di microscopia ottica (ingrandimento 1000 volte), è necessario dividere il numero di micobatteri acido-resistenti rilevati con un microscopio a fluorescenza per il coefficiente corrispondente: a un ingrandimento 250 volte del microscopio - per 10, a 450 volte - per 4, a 630 volte - per 2.

Caratteristiche della microscopia nella tubercolosi extrapolmonare

Si esegue la microscopia diretta, così come la microscopia di strisci preparati dopo arricchimento con successiva colorazione secondo Ziehl-Neelsen o con coloranti fluorescenti. La microscopia diretta degli strisci è inefficace a causa della bassa concentrazione di micobatteri nel materiale, ed è quindi più razionale utilizzare metodi di arricchimento. La centrifugazione è la più efficace. Se il materiale biologico è viscoso, si utilizza la centrifugazione con simultanea omogeneizzazione e liquefazione del materiale, che viene eseguita utilizzando centrifughe ad alta velocità con una forza centrifuga di 3000 g e soluzioni di ipoclorito. Altri metodi di arricchimento, come la microflottazione, non sono attualmente utilizzati a causa della formazione di aerosol biologicamente pericolosi.

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Metodo colturale per la diagnosi della tubercolosi

Il metodo di semina, o metodo di coltura, è più sensibile della microscopia a striscio e presenta numerosi vantaggi rispetto a quest'ultima. Permette di rilevare diverse decine di micobatteri vitali nel materiale in esame e ha un elevato valore diagnostico. Questo è particolarmente importante quando si esamina materiale proveniente da pazienti con diagnosi recente o in trattamento che espellono una piccola quantità di micobatteri.

Rispetto alla microscopia, la ricerca colturale consente di aumentare il numero di pazienti tubercolari diagnosticati di oltre il 15-25%, nonché di diagnosticare la tubercolosi in fasi iniziali, quando la malattia è ancora facilmente curabile. Un vantaggio molto importante della ricerca colturale è considerato la possibilità di ottenere una coltura del patogeno, che può essere identificata e studiata in relazione alla sensibilità ai farmaci, alla virulenza e ad altre proprietà biologiche.

Gli svantaggi dei metodi di coltura sono la loro durata (il periodo di attesa per i materiali raggiunge le 10 settimane), i costi più elevati e la complessità dell'elaborazione del materiale diagnostico.

Principi del trattamento pre-semina del materiale diagnostico

I metodi microbiologici convenzionali non possono essere utilizzati per condurre test per la tubercolosi. Ciò è dovuto al fatto che i micobatteri della tubercolosi crescono molto lentamente e la maggior parte dei campioni clinici contiene microrganismi e funghi piogeni e putrefattivi a crescita rapida. La loro rapida crescita su terreni ricchi di nutrienti interferisce con lo sviluppo dei micobatteri e non consente l'isolamento del patogeno della tubercolosi, pertanto il materiale diagnostico deve essere pretrattato prima della semina. Inoltre, i micobatteri rilasciati dalle vie respiratorie del paziente sono solitamente circondati da una grande quantità di muco, il che ne rende difficile la concentrazione. A questo proposito, prima di seminare espettorato e altri materiali simili, è necessario liquefarli e decontaminarli.

Tutti i detergenti e i decontaminanti hanno un effetto tossico più o meno pronunciato sui micobatteri. A seguito del trattamento, fino al 90% dei micobatteri può morire. Per preservare una porzione sufficiente della popolazione micobatterica, è necessario utilizzare metodi di trattamento delicati che consentano, da un lato, di sopprimere i microrganismi piogeni e putrefattivi a rapida crescita e, dall'altro, di preservare al massimo la vitalità dei micobatteri presenti nel materiale.

A seconda del materiale, della sua omogeneità e del livello di contaminazione, per il trattamento pre-semina vengono utilizzati diversi decontaminanti: per l'espettorato: soluzione di idrossido di sodio al 4%, soluzioni di fosfato trisodico al 10%, cloruro di benzalconio fosfato trisodico, NALC-NaOH (N-acetil-L-cisteina-idrossido di sodio) con una concentrazione finale di NaOH dell'1%, per urina e altri materiali liquidi: soluzione di acido solforico al 3%, per campioni contaminati, materiali contenenti grassi: soluzione di acido ossalico fino al 5%. In alcuni casi, vengono inoltre utilizzati enzimi e tensioattivi (detergenti). L'uso di Tween e di alcuni altri detergenti è associato a una minore mortalità delle cellule micobatteriche (40-50% di sopravvivenza). Tuttavia, questi prodotti possono essere utilizzati solo per materiali liquidi. NALC-NaOH, prodotto in kit, è il più utilizzato al mondo. Questo metodo consente di isolare oltre l'85% della popolazione cellulare micobatterica. La decontaminazione di materiali solidi contenenti tessuti è più complessa, poiché è difficile stimare il grado di dispersione del materiale durante l'omogeneizzazione. Ad esempio, la lavorazione delle biopsie linfonodali è spesso accompagnata da una maggiore frequenza di contaminazione con flora estranea. In questo caso, è possibile utilizzare etonio all'1%.

Il materiale non omogeneo viene omogeneizzato utilizzando microsfere di vetro in presenza di decontaminanti. I materiali liquidi vengono precentrifugati e solo il sedimento viene trattato.

Tecnica di semina e incubazione

Dopo un trattamento preliminare, il materiale viene centrifugato, precipitando i micobatteri e aumentandone la concentrazione nel sedimento ("arricchimento del sedimento"). Il sedimento risultante viene neutralizzato e inoculato sulla superficie di terreni nutritivi densi o di provette con terreni liquidi (semiliquidi). Dal sedimento rimanente vengono preparati strisci per l'esame microscopico. La tecnica di semina deve prevenire la contaminazione incrociata del materiale diagnostico.

Per un'interpretazione clinica affidabile dei risultati della ricerca microbiologica, è necessario rispettare la seguente regola: gli studi microscopici e colturali devono essere eseguiti parallelamente sullo stesso campione di materiale diagnostico.

Le provette inoculate vengono poste in un termostato a 37 ^° C per 2 giorni in posizione orizzontale. Ciò garantisce un assorbimento più uniforme del materiale nel terreno nutritivo. Dopo 2 giorni, le provette vengono spostate in posizione verticale e sigillate ermeticamente con tappi di gomma o silicone per evitare che il terreno di coltura si secchi.

Le colture vengono mantenute in un termostato a 37 ^° C per 10-12 settimane con regolari ispezioni settimanali. Ad ogni ispezione di controllo vengono registrati i seguenti parametri:

• periodo di crescita osservabile visivamente a partire dal giorno della semina;
• tasso di crescita (numero di UFC);
• contaminazione della coltura con flora microbica o funghi estranei (tali provette vengono rimosse);
• Nessuna crescita visibile. I tubi vengono lasciati nel termostato fino alla prossima ispezione.

Terreni nutritivi

Per la coltivazione dei micobatteri vengono utilizzati diversi terreni nutritivi: solidi, semiliquidi e liquidi. Tuttavia, nessuno dei terreni nutritivi noti possiede proprietà tali da garantire la crescita di tutte le cellule micobatteriche. A questo proposito, per migliorare l'efficienza, si consiglia di utilizzare contemporaneamente 2-3 terreni nutritivi di diversa composizione.

Come terreno standard per l'isolamento primario del patogeno della tubercolosi e la determinazione della sua sensibilità ai farmaci, l'OMS raccomanda il terreno Lowenstein-Jensen. Si tratta di un terreno denso a base di uova su cui si ottiene la crescita dei micobatteri il 20°-25° giorno dopo la semina di materiale batterioscopicamente positivo. La semina di materiale batterioscopicamente negativo richiede un periodo di incubazione più lungo (fino a 10-12 settimane).

Nel nostro Paese, il terreno di coltura Finn-II, proposto da ER Finn, si è diffuso ampiamente. Si differenzia per il fatto che, al posto della L-asparagina, utilizza il glutammato di sodio, che innesca altre vie per la sintesi degli amminoacidi nei micobatteri. La crescita su questo terreno di coltura appare leggermente prima e la frequenza di isolamento dei micobatteri è del 6-8% superiore rispetto al terreno di coltura Lowenstein-Jensen.

Per aumentare l'efficienza della diagnostica batteriologica della tubercolosi extrapolmonare, è consigliabile includere terreni di coltura Finn-II modificati nel complesso dei terreni nutritivi. Per accelerare la crescita, viene aggiunto al terreno nutritivo Finn-II anche lo 0,05% di tioglicolato di sodio, che riduce la concentrazione di ossigeno. Per proteggere i sistemi enzimatici dei micobatteri dai prodotti tossici della perossidazione lipidica, l'antiossidante α-tocoferolo acetato viene introdotto nel terreno nutritivo Finn-II a una concentrazione di 0,001 μg/ml. Il materiale diagnostico viene seminato secondo il metodo standard.

Nei laboratori antitubercolari russi vengono utilizzate anche altre modifiche dei terreni nutritivi densi: il terreno nutritivo "Novaya" proposto da G. G. Mordovsky, i terreni nutritivi A-6 e A-9 sviluppati da V. Anikin, ecc.

Poiché durante la chemioterapia si verificano danni a vari sistemi metabolici della cellula microbica, parte della popolazione micobatterica perde la capacità di svilupparsi normalmente nei terreni nutritivi convenzionali e necessita di terreni nutritivi osmoticamente bilanciati (semiliquidi o liquidi).

Valutazione e registrazione dei risultati della coltura del materiale diagnostico

Alcuni ceppi e tipi di micobatteri crescono lentamente, e la crescita può manifestarsi anche entro il 90° giorno. Il numero di queste colture è limitato, ma questo impone la conservazione delle semine in un termostato per 2,5-3 mesi.

Le colture virulente di Mycobacterium tuberculosis crescono solitamente su terreni di coltura solidi come colonie di tipo R di dimensioni e aspetto variabili. Le colonie sono secche, rugose, color avorio e leggermente pigmentate. Su altri terreni, le colonie di Mycobacterium tuberculosis possono essere più umide. Dopo un ciclo di chemioterapia o durante il trattamento, si possono isolare colonie lisce con crescita umida (forme S).

Durante l'isolamento delle colture, si utilizza una serie di studi speciali per distinguere i micobatteri della tubercolosi dai micobatteri non tubercolari e dai saprofiti acidoresistenti.

Una risposta positiva viene fornita dopo un esame microscopico obbligatorio di uno striscio di colonie cresciute e colorate secondo la tecnica di Ziehl-Neelsen. Nel caso di crescita di micobatteri, negli strisci si trovano bastoncini rosso vivo, disposti singolarmente o in gruppi, che formano grappoli a forma di feltro o trecce. Nelle colture giovani, soprattutto quelle isolate da pazienti sottoposti a chemioterapia per lungo tempo, i micobatteri si distinguono per un marcato polimorfismo, che può arrivare alla presenza di varianti corte, quasi coccoidi o allungate, simili al micelio fungino, insieme a forme a bastoncello.

L'intensità di crescita micobatterica è designata secondo il seguente schema: (+) - 1-20 UFC in provetta (bassa escrezione batterica); (++) - 20-100 UFC in provetta (escrezione batterica moderata); (+++) - >100 UFC in provetta (escrezione batterica abbondante). Nella diagnostica di laboratorio della tubercolosi, non è sufficiente fornire una risposta che indichi se i micobatteri sono stati rilevati o meno con un particolare metodo. È anche necessario avere un'idea dettagliata del volume e della natura della popolazione micobatterica, della sua composizione e delle sue proprietà. Sono questi dati che consentono di interpretare correttamente lo stato del processo, pianificare le tattiche e adattare tempestivamente il trattamento.

Negli ultimi anni, sono stati proposti terreni nutritivi a base di agar con vari additivi di crescita e l'uso di una speciale miscela di gas per accelerare la crescita dei micobatteri. Per ottenere la crescita dei micobatteri su questi terreni, durante la coltivazione viene creata un'atmosfera con un contenuto elevato di anidride carbonica (4-7%). A tale scopo, vengono utilizzati speciali incubatori a CO₂ _. Tuttavia, i sistemi automatizzati per la coltivazione di micobatteri hanno ricevuto il maggiore sviluppo: MGIT-BACTEC-960 e MB/Bact.

Uno di questi sistemi è il sistema MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube), un'innovazione tecnologica avanzata, progettato per la diagnosi batteriologica accelerata della tubercolosi e la determinazione della sensibilità dei micobatteri ai farmaci di prima linea e ad alcuni farmaci di seconda linea. MGIT è progettato per l'uso come parte del dispositivo VASTEC-960. I microrganismi vengono coltivati in apposite provette con un terreno nutritivo liquido a base di un terreno Middlebrook-7H9 modificato. Per stimolare la crescita dei micobatteri e inibire la crescita della microflora estranea, vengono utilizzati MGIT Growth Supplement e una miscela di farmaci antibatterici PANTA.

La crescita dei microrganismi viene registrata otticamente. Si basa sulla fluorescenza, che si verifica quando i micobatteri consumano ossigeno durante la loro crescita. Un colorante fluorocromico dipendente dall'ossigeno è contenuto sul fondo di una speciale provetta e ricoperto da uno strato di silicone. La riproduzione dei micobatteri porta a una diminuzione della quantità di ossigeno nella provetta e a una diminuzione della sua concentrazione, che causa un aumento della fluorescenza, che diventa visibile quando la provetta viene irradiata con luce ultravioletta e viene registrata automaticamente dai fotosensori integrati nel dispositivo VASTES-960. L'intensità di luminescenza è registrata in unità di crescita (GU). I dati di crescita vengono automaticamente inseriti in un computer, dove possono essere salvati. L'analisi computerizzata delle curve di crescita può fornire informazioni sulla presenza di vari pool di micobatteri, inclusi quelli non tubercolari, e aiuta anche a valutare le proprietà di crescita dei micobatteri.

Grazie all'introduzione di tali sistemi, il tempo di crescita dei micobatteri è stato significativamente ridotto, attestandosi in media a 11 giorni su VASTEC-960 e 19 giorni su MB/Bact, contro i 33 giorni su un terreno nutritivo denso standard. È importante sottolineare che questi sistemi richiedono personale altamente qualificato. La semina del materiale su terreno liquido è necessariamente accompagnata dalla semina su terreno Lowenstein-Jensen, che svolge il ruolo di riserva nei casi in cui i micobatteri tubercolari non crescano su altri terreni.

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Determinazione della sensibilità ai farmaci dei micobatteri

La determinazione dello spettro e del grado di sensibilità dei micobatteri ai farmaci antitubercolari è di grande importanza clinica, così come per la valutazione epidemiologica della diffusione della tubercolosi farmacoresistente. Inoltre, il monitoraggio della farmacoresistenza consente di valutare l'efficacia del programma antitubercolare nel suo complesso, essendo un indicatore fondamentale dell'efficacia di tutte le componenti delle misure antitubercolari.

Frequenza e tempistica dei test di sensibilità ai farmaci:

• prima dell'inizio del trattamento, una volta per determinare la strategia e le tattiche di trattamento:
• Quando si isolano colture da vari materiali di un paziente (espettorato, BAL, urina, essudati, liquido cerebrospinale, ecc.), vengono esaminati tutti i ceppi isolati:
• al termine della fase intensiva del trattamento in assenza di dinamica clinica e radiologica:
• se è necessario modificare il regime terapeutico in caso di:
  • assenza di negatività dell'espettorato;
  • nuova coltura dopo negatività dell'espettorato;
  • Un forte aumento della quantità di AFB in uno striscio dopo una diminuzione iniziale. È noto che ceppi di Mycobacterium tuberculosis con diversa sensibilità ai farmaci vengono isolati da materiale prelevato da un paziente affetto da tubercolosi. La sensibilità dei ceppi ai farmaci antitubercolari può variare nello spettro di farmaci, nel grado, nella frequenza e nella velocità di sviluppo della resistenza.

Il grado di resistenza al farmaco del Mycobacterium tuberculosis viene determinato secondo criteri stabiliti, che si concentrano sul significato clinico della resistenza e dipendono dall'attività antitubercolare del farmaco, dalla sua farmacocinetica, dalla concentrazione nella lesione, dalla dose terapeutica massima, ecc.

La determinazione della sensibilità dei micobatteri ai farmaci viene attualmente effettuata utilizzando metodi microbiologici:

• concentrazioni assolute (metodo di diluizione su terreni nutritivi solidi o liquidi),
• proporzioni,
• coefficiente di resistenza.

Solitamente, la resistenza si manifesta sotto forma di crescita visibile di colonie di micobatteri tubercolari, tuttavia esistono metodi che inducono la crescita nelle fasi iniziali della divisione cellulare micobatterica, sotto forma di reazioni cromatiche. Questi metodi riducono i tempi di analisi da 3-4 a 2 settimane.

Il metodo di concentrazione assoluta raccomandato dal Comitato per la Chemioterapia dell'OMS si è diffuso in Russia come metodo unificato. Dal punto di vista metodologico, è il più semplice, ma richiede un'elevata standardizzazione e precisione delle procedure di laboratorio. Il test di sensibilità ai farmaci consiste in un set di provette con un terreno nutritivo modificato con farmaci antitubercolari. Il set è composto da 2-3 provette con diverse concentrazioni di ciascuno dei farmaci utilizzati, una provetta di controllo con un terreno senza farmaco e una provetta contenente 1000 μg/ml di salicilato di sodio o 500 μg/ml di acido paranitrobenzoico per rilevare la crescita di micobatteri non tubercolari.

Per preparare un set di terreni di coltura con preparati, utilizzare un terreno di coltura Lowenstein-Jensen modificato (senza amido), che viene versato in beute. A ciascuna beuta viene aggiunto un certo volume della corrispondente diluizione del farmaco antitubercolare. Il contenuto delle beute viene accuratamente miscelato, versato in provette e coagulato in posizione inclinata per 40 minuti a una temperatura di 85 °C. Si consiglia di coagulare il terreno di coltura in un coagulatore elettrico con controllo automatico della temperatura. Terreno di coltura con farmaci antitubercolari

La prima fila può essere conservata in frigorifero a 2-4 °C per 1 mese, mentre i farmaci della seconda fila non possono essere conservati per più di 2 settimane. La conservazione dei terreni di coltura con i farmaci a temperatura ambiente non è accettabile. Nella preparazione di soluzioni di farmaci antitubercolari, si tiene conto della loro attività, calcolando la concentrazione con un aggiustamento per il peso molecolare della parte non specifica del farmaco, la purezza, ecc. Per determinare la sensibilità al farmaco, vengono utilizzate solo sostanze chimicamente pure.

Il principio del metodo è determinare la concentrazione di un farmaco antitubercolare che sopprime la crescita di una porzione significativa della popolazione micobatterica. Se eseguito correttamente, questo metodo offre una buona affidabilità.

Prima di eseguire il test, è necessario assicurarsi che la coltura isolata di Mycobacterium tuberculosis non contenga microflora estranea. Una sospensione omogenea contenente 500 milioni di corpi microbici in 1 ml (standard di torbidità ottica 5 unità) viene preparata dalla coltura di micobatteri in una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%. La sospensione risultante viene diluita con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% (1:10) e 0,2 ml della sospensione vengono aggiunti a ciascuna provetta del set di terreni nutritivi. Le provette inoculate vengono poste in un termostato a 37 °C e mantenute orizzontalmente per 2-3 giorni in modo che la superficie inclinata del terreno nutritivo venga inoculata uniformemente con la sospensione di Mycobacterium tuberculosis. Quindi le provette vengono spostate in posizione verticale e incubate per 3-4 settimane. I risultati vengono registrati dopo 3-4 settimane.

Poiché il tempo necessario per isolare il patogeno dal materiale clinico su terreno nutritivo è di almeno 1-1,5 mesi, i risultati della determinazione della sensibilità al farmaco con questo metodo possono essere ottenuti non prima di 2-2,5 mesi dalla semina del materiale. Questo è uno dei principali svantaggi del metodo.

I risultati dei test di sensibilità ai farmaci micobatterici vengono interpretati in base a determinati criteri. Su terreni solidi, una coltura è considerata sensibile alla concentrazione del farmaco contenuto nel terreno se il numero di colonie micobatteriche cresciute in una data provetta con il farmaco non supera le 20, con una crescita abbondante in una provetta di controllo senza farmaci. Solo se le colonie sono più di 20, la coltura è considerata resistente a una data concentrazione. In pratica, quando si ottengono risultati di crescita in provette prossime a 20 UFC, è necessario informare l'unità clinica che la sensibilità o la resistenza in questo caso è borderline, poiché ciò può talvolta spiegare la dinamica poco chiara degli indicatori clinici.

Per diverse preparazioni, viene stabilita una certa concentrazione alla quale si osserva la riproduzione di una proporzione critica della popolazione micobatterica. Queste concentrazioni sono chiamate "critiche". L'entità della crescita della popolazione micobatterica su un terreno nutritivo con la preparazione in una concentrazione critica viene utilizzata come criterio di stabilità.

Nella pratica clinica nazionale, la determinazione della resistenza ai farmaci non si limita alla sola determinazione delle concentrazioni critiche. Ciò è dovuto al fatto che una definizione più ampia del livello di resistenza ai farmaci del patogeno consente al medico di formulare più correttamente le tattiche chemioterapiche, sfruttando la conoscenza dell'effetto potenziante delle combinazioni di farmaci, per anticipare la resistenza crociata o utilizzare farmaci più efficaci all'interno del gruppo di farmaci antitubercolari in uso.

Il metodo della concentrazione assoluta è il più semplice, ma anche il più sensibile agli errori commessi nella sua implementazione. Più affidabile, soprattutto quando si determina la sensibilità ai farmaci di seconda linea, e diffuso al di fuori della Russia, è il metodo proporzionale. Tiene conto delle carenze del metodo della concentrazione assoluta, ma è più laborioso da implementare.

Il metodo è molto simile al metodo della concentrazione assoluta. La preparazione delle provette con i farmaci è la stessa del metodo della concentrazione assoluta. Tuttavia, la dose di inoculo della sospensione di micobatteri tubercolari viene ridotta di 10 volte, eliminando la frequenza di resistenza spontanea di alcuni ceppi di micobatteri tubercolari a farmaci come etambutolo, protionamide e capreomicina. Come controlli, vengono utilizzate 2 o 3 provette con una dose di inoculo pari a quella delle provette, diluite successivamente 10 e 100 volte. Il criterio di resistenza è la percentuale di crescita del micobatterio tubercolare osservata visivamente. Per i farmaci di prima linea, il criterio di resistenza è una crescita in eccesso dell'1% della popolazione iniziale, mentre per i farmaci di seconda linea è una crescita pari o superiore al 10% della popolazione iniziale, a seconda della concentrazione critica selezionata.

Nel 1997, il gruppo di lavoro dell'OMS e dell'Unione Internazionale contro la Tubercolosi sulla rilevazione della resistenza ai farmaci antitubercolari ha apportato delle modifiche a questi criteri, proponendo di considerare resistenti i micobatteri che crescono nel terreno di coltura denso di Lowenstein-Jensen alle seguenti concentrazioni:

• diidrostreptomicina - 4 μg/ml;
• isoniazide - 0,2 µg/ml:
• rifampicina - 40 mcg/ml:
• Etambutolo - 2 mcg/ml.

Nel 2001 sono state proposte concentrazioni critiche per i seguenti farmaci di seconda linea (per una percentuale critica dell'1%):

• capreomicina - 40 mcg/ml;
• protionamide - 40 mcg/ml;
• kanamicina - 30 μg/ml;
• viomicina - 30 μg/ml;
• cicloserina - 40 mcg/ml;
• acido aminosalicilico - 0,5 mcg/ml;
• ofloxacina - 2 mcg/ml.

I risultati della crescita vengono valutati dopo 4 settimane come preliminari e dopo 6 settimane di coltivazione come definitivi.

Per determinare la sensibilità al farmaco della pirazinamide, ampiamente utilizzata nella moderna chemioterapia antitubercolare, la concentrazione critica raccomandata è di 200 μg/ml. Tuttavia, non esiste ancora un metodo generalmente accettato per determinare la resistenza a questo farmaco su terreni nutritivi solidi, poiché la sua attività antibatterica si manifesta solo in un ambiente acido (pH <6), tecnicamente difficile da mantenere. Inoltre, molte colture cliniche di Mycobacterium tuberculosis sono riluttanti a crescere su terreni di coltura per uova in ambiente acido.

Per valutare la qualità dei risultati nella determinazione della sensibilità ai farmaci dei micobatteri, si raccomanda di controllare ogni nuovo lotto del terreno di coltura Lowenstein-Jensen mediante la determinazione parallela della sensibilità del ceppo standard museale H37Rv. Inoltre, è necessario rispettare alcuni criteri microbiologici affinché i metodi forniscano un risultato ben riproducibile e correttamente interpretato. Questi includono la vitalità della coltura di micobatteri tubercolari, le regole per ottenere una sospensione e una sospensione omogenee, le regole per la selezione delle colture di micobatteri tubercolari e la rappresentatività della massa batterica selezionata. L'affidabilità della determinazione della resistenza ai farmaci diminuisce in caso di escrezione batterica estremamente scarsa.

Recentemente, il metodo per determinare la sensibilità ai farmaci utilizzando sistemi automatizzati è stato riconosciuto come promettente. I più avanzati in questo ambito sono gli sviluppi basati sul sistema VASTEC MGIT-960. In questo caso, la sensibilità ai farmaci dei micobatteri tubercolari viene determinata utilizzando un metodo a proporzioni modificate. Durante la determinazione, viene confrontata la velocità di crescita dei micobatteri tubercolari nella provetta di controllo e in quelle contenenti i farmaci. Per determinare la sensibilità a streptomicina, isoniazide, rifampicina ed etambutolo, vengono utilizzati additivi di arricchimento e antibiotici inclusi nel kit SIRE. Per determinare la sensibilità alla pirazinamide, viene utilizzato il kit PZA. Durante il test, le provette contenenti i farmaci vengono inoculate con una sospensione di micobatteri tubercolari, così come le provette di controllo con una diluizione 100 volte della sospensione per tutti i farmaci, ad eccezione della pirazinamide, per la quale la diluizione della sospensione è 10 volte. Il criterio di stabilità è l'indicatore di crescita dei micobatteri pari a 100 GU quando la crescita nella provetta di controllo raggiunge 400 GU (vedere "Metodi colturali per l'isolamento dei micobatteri"). I risultati vengono registrati e interpretati automaticamente e impostati dal programma inserito o selezionato.

Le concentrazioni finali in provetta con terreno nutritivo liquido vengono utilizzate come concentrazioni critiche. Attualmente, le concentrazioni critiche sono state sviluppate sia per i farmaci di prima linea che per alcuni farmaci di seconda linea. È importante notare che la determinazione della sensibilità dei micobatteri tubercolari alla cicloserina e all'acido aminosalicilico viene eseguita solo su terreni nutritivi per uova.

Un protocollo dettagliato per lavorare con il sistema descritto consente di effettuare test di sensibilità ai farmaci sia su una coltura isolata (con un terreno nutritivo denso) sia utilizzando la crescita primaria dei micobatteri in una provetta MGIT. Quest'ultima opzione riduce significativamente i tempi necessari per condurre gli studi colturali, consentendo di ottenere risultati completi sulla coltura dei micobatteri tubercolari (incluse le informazioni sulla sensibilità ai farmaci) entro 3 settimane dalla raccolta del materiale, mentre il metodo tradizionale può fornirli solo entro il terzo mese. Risultati tempestivi, quando il paziente è nella fase intensiva del trattamento, possono compensare il costo relativamente elevato degli studi.

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Differenziazione dei micobatteri

Considerando che i terreni nutritivi utilizzati non sono strettamente selettivi, la successiva differenziazione dei micobatteri isolati è considerata obbligatoria. La necessità di differenziare i micobatteri è dovuta a una serie di caratteristiche dei processi patologici causati dai rappresentanti del genere: il diverso decorso ed esito della tubercolosi e della micobatteriosi, la presenza di resistenza naturale ad alcuni farmaci antitubercolari.

È noto che l'identificazione primaria dei micobatteri del complesso M. tuberculosis dai micobatteri non tubercolari viene effettuata in base alle seguenti caratteristiche: velocità di crescita su terreni nutritivi densi, formazione di pigmenti, morfologia delle colonie, presenza di resistenza agli acidi e temperatura ottimale per la crescita.

Purtroppo non esiste un singolo metodo di laboratorio in grado di distinguere in modo affidabile i micobatteri del complesso M. tuberculosis da altri micobatteri acidoresistenti; tuttavia, una combinazione dei segni sopra descritti con i risultati di una serie di test biochimici indicati di seguito consente l'identificazione dei micobatteri del complesso M. tuberculosis con una probabilità fino al 95%.

Per differenziare i micobatteri del complesso M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii e altri) dai micobatteri non tubercolari a crescita lenta, si utilizzano test biochimici di base per rilevare la presenza dei seguenti segni:

• capacità di produrre acido nicotinico (test della niacina):
• attività nitrato reduttasi;
• catalasi termostabile;
• crescita su terreno di coltura con salicilato di sodio (1 mg/ml).

Come test aggiuntivo, è possibile utilizzare anche test di crescita su un terreno contenente 500 μg/ml di acido para-nitrobenzoico o cloruro di sodio al 5%.

Molti laboratori batteriologici identificano questi microrganismi solo a livello complesso, il che è dovuto alle limitate capacità dei laboratori e alle capacità metodologiche degli specialisti.

Nella maggior parte dei casi, i seguenti test sono sufficienti per differenziare M. tuberculosis da M. bovis: niacina, nitrato reduttasi, pirazinamide e registrazione della crescita su un terreno contenente 2 μg/ml di idrazide dell'acido tiofene-2-carbossilico. Si tenga presente che i micobatteri del complesso M. tuberculosis sono caratterizzati dal seguente insieme di caratteristiche:

• crescita lenta (più di 3 settimane);
• temperatura di crescita tra 35-37 ^° C;
• assenza di pigmentazione (color avorio);
• colorazione acido-resistente pronunciata;
• test positivo della niacina;
• test positivo della nitrato reduttasi;
• assenza di catalasi termostabile (68 ^o C).
• mancanza di crescita su terreno Lowenstein-Jensen contenente:
  • 1000 µg/ml di acido salicilico di sodio,
  • 500 mcg/ml di acido para-nitrobenzoico,
  • cloruro di sodio al 5%:
• crescita in presenza di 1-5 μg/ml di acido tiofene-2-carbossilico.

L'importanza della differenziazione dei micobatteri isolati aumenterà significativamente con l'aumento della frequenza di registrazione dei casi di HIV/AIDS associati a tubercolosi o micobatteriosi. Attualmente, non vi è alcuna certezza assoluta sulla capacità dei laboratori regionali di svolgere correttamente questo volume di lavoro.

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Diagnostica immunologica della tubercolosi

Esistono numerosi fenomeni universali, preparati e test immunologici che sono stati inizialmente scoperti specificamente nella tubercolosi o nel modello di risposta immunitaria ai micobatteri. Tra questi figurano BCG e tubercolina, fenomeni come il DST cutaneo (test alla tubercolina - reazioni di Pirquet e Mantoux), la reazione alla somministrazione sottocutanea di tubercolina ad animali sensibilizzati (fenomeno di Koch). Anche alcuni dei primi anticorpi nelle malattie infettive sono stati scoperti nella tubercolosi. Naturalmente, maggiore è la comprensione dei meccanismi dell'immunità antitubercolare e del loro controllo genetico, più ampio può essere l'uso di metodi e preparati immunologici che influenzano l'immunità per risolvere problemi pratici di tisiologia.

Il problema pratico più importante e complesso al momento è considerato l'individuazione della tubercolosi nel processo di screening di massa della popolazione. Tuttavia, nonostante le numerose segnalazioni di "successi" (su materiale limitato), non esiste un metodo immunologico (riproducibile "in qualsiasi mani") o un farmaco adatto a questi scopi.

I metodi immunologici, in particolare gli studi sierologici (determinazione di antigeni, anticorpi) e i test di provocazione alla tubercolina, sono ampiamente utilizzati nella pratica clinica.

Tra gli studi immunologici utilizzati nella diagnosi differenziale, i metodi sierologici, che determinano antigeni e anticorpi in diversi ambienti del corpo, occupano il primo posto.

La specificità della determinazione degli anticorpi contro il Mycobacterium tuberculosis dipende dagli antigeni utilizzati nell'analisi immunitaria. Sono stati proposti numerosi antigeni, il primo dei quali è la tubercolina PPD:

• PPD e altre preparazioni complesse da fluido di coltura;
• disintegrante ultrasonico;
• Estratto di Triton e altre preparazioni complesse di pareti cellulari;
• 5-antigene (Daniele);
• 60-antigene (Coccito);
• lipoarabinomannano;
• fattore cordonale (trealosio-6,6-di-micolato);
• glicolipidi fenolici e altri glicolipidi;
• lipopolisaccaridi;
• antigene legante la fibronectina;
• proteine (il più delle volte ricombinanti); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 KDA, ecc.

Grazie a molti anni di ricerca condotta da scienziati russi e stranieri, sono stati identificati i principali modelli di formazione di anticorpi e l'efficacia della diagnosi sierologica della tubercolosi: più complesso è l'antigene, maggiore è la sensibilità e minore la specificità dei test. La specificità varia nei diversi Paesi a seconda del grado di infezione della popolazione con M. tuberculosis e micobatteri non tubercolari, della vaccinazione BCG, ecc. Nei bambini, l'informatività della sierodiagnostica è inferiore rispetto agli adulti. Nella tubercolosi primaria (più spesso nei bambini), la determinazione delle IgM è più informativa; nella tubercolosi secondaria, delle IgG. Nelle persone con infezione da HIV, l'informatività della sierodiagnostica nella determinazione degli anticorpi è ridotta. L'efficacia della determinazione degli anticorpi dipende da diversi "momenti clinici": l'attività del processo (presenza o assenza di "isolamento" dei micobatteri, presenza di cavità di decomposizione, grado di infiltrazione), la prevalenza del processo, la durata del suo decorso.

La sensibilità del metodo immunoenzimatico (EIA) è di circa il 70%. L'insufficiente efficacia dello studio è dovuta alla sua bassa specificità. In precedenza, si era valutata la possibilità di utilizzare lo screening sierologico in gruppi ad alto rischio, in particolare tra le persone con alterazioni polmonari post-tubercolari.

Per aumentare la specificità dell'ELISA, si ricercano antigeni più specifici, inclusi quelli ottenuti tramite ingegneria genetica: ESAT-6, ecc. (vedi sopra). L'uso di antigeni strettamente specifici (38 kDa, ESAT) aumenta la specificità, ma riduce significativamente la sensibilità dell'analisi. Oltre all'ELISA (sistemi di test di laboratorio sperimentali, come il kit Pathozyme ELISA), vengono offerti anche kit immunocromatografici a filtrazione laterale (Mycodot), nonché altri test simili (analisi a punti di membrana) con valutazione visiva del risultato. L'esecuzione di questi test richiede dai 10 ai 30 minuti; non richiedono attrezzature speciali, ma richiedono la valutazione visiva dei risultati, il che è associato a una certa soggettività. Questi metodi presentano all'incirca le stesse caratteristiche di sensibilità e specificità (rispettivamente del 70% e del 90-93%) dell'ELISA tradizionale.

L'uso di metodi di analisi immunitaria ha un certo valore come metodo aggiuntivo da considerare nel complesso dei metodi utilizzati nella diagnosi differenziale della tubercolosi, in particolare nella diagnosi delle sue forme extrapolmonari. Il metodo ELISA è più efficace nella diagnosi di meningite tubercolare quando esaminato il liquido cerebrospinale. In questo caso, la sensibilità dell'analisi è dell'80-85% e la specificità del 97-98%. Esistono informazioni sull'efficacia della determinazione degli anticorpi contro Mycobacterium tuberculosis nel liquido lacrimale nella diagnosi di uveite tubercolare.

Induzione della sintesi dell'interferone gamma in vitro

L'interferone gamma (IFN-γ) è un fattore di protezione immunitaria specifica, che si realizza attivando i sistemi enzimatici dei macrofagi. L'induzione della sintesi di IFN-γ da parte dei linfociti T sensibilizzati è causata dalla loro interazione con gli antigeni micobatterici.

Come antigeni vengono utilizzati sia la tubercolina PPD che antigeni specifici ottenuti mediante ingegneria genetica, in particolare l'antigene ESAT-6 (antigene secreto precocemente con un peso molecolare di 6 kDa) e CFP-10 (proteina del filtrato di coltura, 10 kDa). Gli antigeni geneticamente modificati o ricombinanti sono assenti nelle cellule del vaccino BCG e di altri micobatteri. Quando si utilizza la tubercolina, i risultati del test di induzione con IFN-γ sono paragonabili ai risultati del test cutaneo alla tubercolina (correlazione diretta). Quando si utilizzano antigeni geneticamente modificati, i risultati del test sono più specifici e non dipendono dalla precedente vaccinazione con BCG. Quando si esaminano individui vaccinati che non hanno avuto contatti con l'infezione tubercolare, la specificità del test è del 99%. La sensibilità del test tra i pazienti tubercolari varia dall'81 all'89%.

Sono stati sviluppati test e metodi diagnostici basati sulla coltura a breve termine di cellule del sangue intero o cellule mononucleate isolate dal sangue con antigeni di micobatteri tubercolari in vitro, seguita dalla determinazione della concentrazione di IFN-γ o dal conteggio del numero di linfociti T che sintetizzano IFN-γ. La concentrazione di interferone sintetizzato in provetta viene determinata mediante ELISA utilizzando anticorpi monoclonali che legano IFN-γ. Successivamente, utilizzando la calibrazione di IFN-γ standard, viene determinata la sua concentrazione nella provetta o nei pozzetti della piastra.

Nel test Elispot, il numero di cellule T che sintetizzano IFN-γ viene conteggiato sulla superficie di una capsula rivestita con anticorpi anti-IFN-γ.

Gli sviluppatori del test diagnostico in vitro per l'induzione di IFN-γ, approvato dalla Food and Drug Administration statunitense, sostengono che il test non sia in grado di distinguere l'infezione tubercolare latente dalla tubercolosi attiva. Pertanto, nelle regioni con un alto tasso di infezione, il test non ha alcun valore diagnostico diretto. Tuttavia, nel nostro Paese, può essere utilizzato per distinguere l'infezione tubercolare nei bambini dall'allergia post-vaccinazione, nonché per valutare il livello di immunità specifica durante il trattamento.

Attualmente è in fase di studio un sistema di test nazionale per determinare l'induzione della sintesi di IFN-γ da parte di specifici antigeni della tubercolosi in vitro.

Stato immunitario e decorso della tubercolosi, immunocorrezione

Durante il trattamento della tubercolosi si verificano alterazioni dell'antigenemia e dello stato del sistema immunitario delle persone.

I dati sulle alterazioni degli essudati e dei tessuti sono in gran parte contraddittori. L'unica cosa che si può osservare con piena giustificazione è che i granulomi tubercolari, di norma, contengono un numero significativo di linfociti T attivati.

È opportuno soffermarsi su altri due punti necessari per comprendere il ruolo dei meccanismi immunologici nel trattamento della tubercolosi negli esseri umani:

• I pazienti affetti da AIDS hanno un'incidenza particolarmente elevata di sviluppare una resistenza multipla ai farmaci;
• In caso di resistenza multipla ai farmaci (e in assenza di infezione da HIV), i disturbi immunitari (principalmente l'immunità delle cellule T) sono particolarmente significativi.

Nella tubercolosi sono ampiamente utilizzati vari metodi di immunocorrezione: si tratta innanzitutto di farmaci che agiscono principalmente sull'immunità delle cellule T e sul sistema dei fagociti mononucleati (ormoni del timo, isofoni, licopidi, poliossidonio, ecc.), nonché sui micobatteri interi (attenuati) e sui loro componenti.

Diagnostica biologica molecolare della tubercolosi

I metodi di biologia molecolare nella diagnostica delle malattie infettive includono principalmente metodi basati sulla manipolazione di materiale genomico di patogeni batterici e virali al fine di identificare materiale genetico specifico - sezioni di DNA con una sequenza nucleotidica specifica per una data specie o ceppo di patogeno - per analizzare sequenze di DNA specifiche nei geni che determinano la sensibilità del patogeno a determinati farmaci, nonché per analizzare l'attività funzionale di determinati geni del patogeno. I metodi di biologia molecolare si sono diffusi nella ricerca scientifica e trovano applicazione pratica nella diagnostica e nel monitoraggio di varie infezioni batteriche e virali dopo la scoperta della reazione a catena della polimerasi nel 1985 da parte di Carrie Mullis (Premio Nobel 1989).

Principi e capacità del metodo della reazione a catena della polimerasi

La PCR consente l'amplificazione (moltiplicazione) di una sequenza nucleotidica (un frammento di DNA patogeno) in provetta in poche ore, per milioni di volte. L'esecuzione della reazione in presenza di singole catene di DNA determina l'eccezionale sensibilità dell'analisi.

La sequenza nucleotidica di determinate sezioni della catena del DNA determina l'unicità genetica del microrganismo, il che spiega l'elevata specificità della PCR.

L'importanza di questo metodo per la rilevazione e lo studio delle caratteristiche del Mycobacterium tuberculosis è dovuta alle caratteristiche biologiche del microrganismo, che ha una crescita molto lenta: il tempo di raddoppiamento del DNA del Mycobacterium tuberculosis durante la loro coltivazione è di 12-24 ore.

Il principio del metodo PCR è l'amplificazione: moltiplicazione multipla, milioni di volte, di sezioni di una sequenza specifica di DNA in un microvolume di provetta con ripetizione ciclica delle seguenti tre fasi di reazione, ciascuna delle quali avviene in un diverso regime di temperatura:

• Fase I - denaturazione del DNA a doppio filamento per riscaldamento con divergenza delle sue catene;
• Fase II - legame complementare (ibridazione) dei primer (oligonucleotidi di priming) con le sezioni terminali delle catene di un frammento di DNA strettamente specifico selezionato per l'amplificazione;
• Fase III: completamento della catena dei frammenti di DNA mediante DNA polimerasi termostabile.

Per l'amplificazione, la provetta deve contenere molecole di DNA della matrice. Quattro tipi di deossinucleosidi trifosfati (nucleotidi) contenenti le corrispondenti basi azotate: adenina (A), timina (T), guanina (G), citosina (C); oligonucleotidi di priming (primer) sintetizzati artificialmente e costituiti da 18-20 coppie di basi; un enzima termostabile, la DNA polimerasi, con un optimum di temperatura di 68-72 ^° C, e ioni magnesio.

La specificità della PCR dipende dalla scelta del frammento di DNA. In base a questa, vengono sintetizzati gli oligonucleotidi primer fiancheggianti. La specificità dell'ibridazione e del completamento della catena di DNA è determinata dal principio di complementarietà delle seguenti coppie di basi azotate: adenina-timina, guanina-citosina.

Per determinare il genoma dei micobatteri del complesso tubercolare, il bersaglio di amplificazione più efficace nella maggior parte dei sistemi di test è il frammento di DNA IS6110, che nella maggior parte dei ceppi di micobatteri tubercolari presenta un numero significativo (10-20) di ripetizioni nel genoma, il che garantisce, oltre alla specificità, un'elevata sensibilità dell'analisi. Allo stesso tempo, sono stati descritti ceppi di micobatteri tubercolari con un numero ridotto di ripetizioni o l'assenza del frammento IS6110.

Estrazione di molecole di DNA da un campione biologico

Per eseguire la PCR, le molecole di DNA del patogeno devono essere isolate dal materiale biologico in un volume minimo, con una quantità minima di DNA non specifico e vari inibitori dell'enzima DNA polimerasi.

La preparazione dei campioni deve essere effettuata in condizioni che impediscano la contaminazione incrociata dei campioni in studio con molecole di DNA isolate. Ciò richiede il trattamento preliminare della stanza con luce ultravioletta, dei pavimenti e delle superfici di lavoro di tavoli e dispositivi con soluzioni contenenti cloro. È inoltre necessario utilizzare guanti puliti, provette monouso e puntali per pipette automatiche.

Per isolare il DNA del Mycobacterium tuberculosis da campioni clinici (liquido cerebrospinale, lavaggio bronchiale) che non contengono un gran numero di leucociti, detriti cellulari o sali, è sufficiente centrifugare il campione a 3-4 mila giri al minuto, aggiungere al sedimento 20-30 µl di una soluzione al 2% di Triton X-100 e riscaldare a 90 ^° C per 30 minuti.

La preparazione del campione di espettorato richiede una liquefazione efficiente, in genere utilizzando idrossido di sodio al 4% e N-acetil-L-cisteina (NALC) a 50-80 mg per campione, a seconda della viscosità del campione. La soluzione di NALC deve essere preparata ex tempore, oppure la polvere di NALC può essere aggiunta direttamente al campione a secco. Dopo la liquefazione, i campioni devono essere centrifugati per 15 minuti a 3.500-4.000 giri/min (3.000 g) in provette da 50 ml con tappo a vite, ovvero nelle stesse condizioni raccomandate per la preparazione dell'espettorato pre-colturale.

Per estrarre il DNA dai sedimenti, il metodo più comunemente utilizzato è basato sull'uso di una soluzione 5-6 molare di isotiocianato di guanidina come reagente di lisi e di particelle microporose di ossido di silicio ("terra di diatomee") che assorbono le molecole di DNA. Sostanze non specifiche, inclusi eventuali inibitori, vengono quindi lavate in una soluzione 2,5 molare di isotiocianato di guanidina e una soluzione di etanolo, dopodiché le molecole di DNA vengono desorbite in acqua e questi campioni vengono utilizzati per eseguire la PCR. Per semplificare la tecnologia di estrazione del DNA, la "terra di diatomee" viene spesso sostituita da microparticelle magnetiche rivestite di ossido di silicio. In questo caso, viene utilizzato uno speciale supporto magnetico per microprovette per far precipitare le particelle anziché centrifugarle.

In Russia è stato sviluppato un metodo originale di separazione immunomagnetica dei micobatteri con successiva estrazione del DNA patogeno. Per la separazione immunomagnetica dei micobatteri tubercolari, vengono utilizzate ferroparticelle di 3-5 μm, rivestite di ossido di silicio, a cui vengono legati anticorpi policlonali (di coniglio) contro i micobatteri tubercolari mediante un legame chimico. I campioni di espettorato, dopo lisi alcalina, vengono neutralizzati con una soluzione acida di Tris-HCl e incubati con un adsorbente immunomagnetico. Le immunoferroparticelle vengono quindi raccolte utilizzando una barra magnetica con punta sostituibile, trasferite in una microprovetta e precipitate. Vengono aggiunti 20-30 μl di una soluzione di Triton X-100 al 2% e riscaldati per 30 minuti a 90 ^° C. Il surnatante viene utilizzato come matrice di DNA per l'analisi PCR.

Un problema complesso è l'estrazione del DNA del micobatterio tubercolare dai campioni bioptici. Per la lisi bioptica, l'enzima proteinasi K viene utilizzato a una concentrazione finale di 200-500 mg/l a una temperatura di 56 ^° C per una notte. Successivamente, il DNA viene estratto utilizzando uno dei metodi noti. L'eccesso di DNA aspecifico nell'analisi PCR dei campioni bioptici causa spesso l'inibizione della reazione, che richiede ripetute estrazioni del DNA.

Metodi di rilevamento dei risultati

Dopo il completamento della reazione, i frammenti amplificati del DNA del patogeno vengono identificati utilizzando vari metodi.

Il metodo dell'elettroforesi su gel è ben noto. In questo caso, il frammento di DNA ottenuto viene identificato da un controllo positivo contenente il frammento di DNA specifico desiderato, oppure da una dimensione (numero di coppie di nucleotidi) del frammento precedentemente nota, determinata utilizzando un marcatore molecolare standard.

In presenza di un colorante specifico, il bromuro di etidio, presente nel DNA a doppio filamento, il frammento di DNA sintetizzato si rivela come una banda che brilla sotto l'influenza della luce ultravioletta.

La dimensione del frammento di DNA, determinata mediante elettroforesi in base alla distanza percorsa dall'inizio, deve corrispondere a un marcatore di peso molecolare noto o a un controllo positivo.

Altri metodi per determinare i risultati della PCR si basano sull'ibridazione dei prodotti della PCR a singolo filamento con un oligonucleotide complementare, una sonda di DNA marcata con biotina, seguita dal rilevamento mediante una reazione enzimatica, ad esempio legando un coniugato streptavidina-fosfatasi alcalina alla biotina.

Sulla base di questo tipo di rilevamento sono stati creati analizzatori PCR in cui il rilevamento dei risultati della PCR viene effettuato automaticamente in seguito alla lettura della densità ottica nei campioni dopo che è avvenuta la reazione enzimatica.

Gli svantaggi di questi metodi includono la possibilità di contaminazione intralaboratorio con frammenti piuttosto corti di molecole di DNA. Quando queste molecole entrano nei campioni appena analizzati, diventano una matrice per la PCR e portano a risultati falsi positivi.

A questo proposito, per prevenire risultati falsi positivi, vengono introdotte regole rigorose per la separazione e l'isolamento delle stanze per l'estrazione del DNA dai campioni biologici; stanze per la rilevazione dei risultati (elettroforesi) dalla zona pulita. Queste stanze rappresentano una zona di probabile contaminazione. Un'altra zona isolata è una camera bianca per l'introduzione dei campioni di DNA in esame in provette con la miscela di reazione per la PCR. Infine, si presume che il dispositivo principale, l'amplificatore di DNA, debba essere portato in una stanza separata, possibilmente un ufficio.

Per prevenire la contaminazione da parte dei prodotti di reazioni precedenti (ampliconi), alcuni sistemi di PCR contengono il deossinucleoside uridina al posto del deossinucleoside timidina, che viene costruito nella posizione corrispondente durante la sintesi della catena in vitro, ovvero la base azotata timina presente nel DNA nativo viene sostituita dall'uracile. L'uracil DNA glicosilasi aggiunta alla miscela di reazione del materiale analizzato distrugge solo i frammenti contaminanti con deossiuridina, ma non il DNA nativo analizzato contenente deossitimidina. Il successivo riscaldamento a 94 ^° C inattiva questo enzima e non interferisce con l'amplificazione in PCR.

Esiste un sistema di test basato sull'amplificazione isotermica dell'rRNA, per il quale vengono prima eseguite la trascrizione inversa e la sintesi delle molecole di DNA, che a loro volta costituiscono la matrice per la successiva sintesi di molecole di RNA. Gli ampliconi di RNA vengono rilevati utilizzando una sonda di DNA colorata con acridina durante l'ibridazione in una soluzione in provetta. Questo metodo, oltre all'elevata sensibilità, presenta il vantaggio di condurre l'analisi in un'unica provetta, prevenendo così la contaminazione. Secondo gli autori, la sensibilità di questo metodo nei campioni respiratori raggiunge il 90% con una specificità del 99-100%.

Nella PCR in tempo reale vengono implementati nuovi metodi di rilevamento. Questi metodi differiscono principalmente per il fatto che la PCR e la rilevazione dei risultati vengono eseguite simultaneamente in una provetta chiusa. Ciò non solo semplifica tecnologicamente il metodo di analisi, ma previene anche la contaminazione dei locali di laboratorio e dei campioni con i prodotti della PCR precedente.

Nella PCR in tempo reale, i risultati vengono rilevati dalla fluorescenza derivante dall'ibridazione di una sonda di DNA fluorogenica con uno specifico frammento di DNA amplificato durante la PCR. La struttura delle sonde di DNA fluorogeniche è costruita in modo tale che il marcatore fluorescente venga rilasciato a seguito di una reazione enzimatica o si allontani dalla molecola di quencher della fluorescenza solo in seguito a ibridazione specifica con la molecola di DNA desiderata amplificata durante la PCR. All'aumentare del numero di molecole ibridate con la sonda, l'aumento della fluorescenza fino a un livello rilevabile è proporzionale al numero di molecole del prodotto amplificato. Poiché il numero di molecole di frammento di DNA raddoppia durante ogni ciclo di PCR, il numero di cicli a partire dai quali viene rilevata e aumenta la fluorescenza è inversamente proporzionale al numero di molecole di DNA presenti nel campione originale. Se nella reazione vengono introdotte diverse concentrazioni note di molecole del corrispondente frammento di DNA del micobatterio tubercolare come calibratore, è possibile calcolare il numero di genomi di DNA nel materiale in studio utilizzando un programma per computer.

Ogni campione standard viene duplicato. Il criterio quantitativo è il numero minimo di cicli di PCR necessari per l'insorgenza e la crescita di fluorescenza rilevabile. L'asse delle ascisse rappresenta il numero di cicli; l'asse delle ordinate rappresenta il valore di fluorescenza. Le concentrazioni di DNA sono inversamente proporzionali al numero di cicli necessari affinché la fluorescenza appaia. Le finestre nella colonna di destra (21-32) mostrano il numero di cicli per le concentrazioni corrispondenti. Le differenze tra le concentrazioni decuplicate dei frammenti di DNA 10 ² -10 ⁶ ml sono 3,2-3,4 cicli. Per due pazienti, le concentrazioni dei frammenti IS6110 erano circa 10 ³ /ml e 10 ⁴ /ml. Considerando il numero di ripetizioni (6-20) dei frammenti analizzati nel genoma di Mycobacterium tuberculosis, il numero di Mycobacterium tuberculosis nei campioni clinici è rispettivamente di circa 100 e 1000 cellule.

Applicazione della PCR nella diagnosi della tubercolosi

Il metodo PCR è ampiamente utilizzato per la diagnosi rapida della tubercolosi, ovvero per la rilevazione di Mycobacterium tuberculosis in campioni clinici: espettorato, lavaggi bronchiali, essudato pleurico, urina, liquido cerebrospinale, punture di osteolisi, aspirati del tratto genitale femminile e varie biopsie. In uno studio condotto in Olanda su circa 500 campioni di espettorato e lavaggi bronchiali di 340 pazienti con diagnosi confermata di tubercolosi polmonare, è stata studiata la sensibilità comparativa dei metodi PCR, coltura e microscopia a striscio. La sensibilità dell'analisi è stata rispettivamente del 92,6%, 88,9% e 52,4%. La specificità di tutti i metodi è stata di circa il 99%.

È stata confrontata l'efficienza di rilevamento di Mycobacterium tuberculosis mediante microscopia a striscio, semina su terreno di coltura Lowenstein-Jensen, sistema di test VASTES e analisi PCR. La PCR ha dimostrato una sensibilità del 74,4%, la microscopia del 33,8%, la semina su terreno solido del 48,9% e VASTES del 55,8%. Il tempo medio di rilevamento per la semina su terreno di coltura Lowenstein-Jensen è di 24 giorni. VASTES 13 giorni, PCR 1 giorno.

Viene inoltre discusso il potenziale dell'impiego della PCR come metodo sensibile e rapido per monitorare l'efficacia del trattamento della tubercolosi.

Il rilevamento del DNA del Mycobacterium tuberculosis mediante il metodo PCR con chemioterapia efficace è determinato in un periodo di tempo più lungo: in media 1,7 mesi rispetto all'escrezione batterica determinata mediante microscopia a fluorescenza e 2,5 mesi rispetto all'esame batteriologico.

Diagnosi delle forme extrapolmonari di tubercolosi

L'importanza della PCR come metodo sensibile è particolarmente grande per le forme extrapolmonari, poiché è proprio in queste forme che i metodi clinici e radiologici e i metodi batteriologici tradizionali per la determinazione del Mycobacterium tuberculosis nei materiali diagnostici risultano inefficaci.

Esaminando i campioni di urina, i risultati dell'analisi PCR sono stati positivi in 16 dei 17 pazienti con tubercolosi attiva dell'apparato urinario e negativi in 4 pazienti con tubercolosi renale inattiva e 39 pazienti con malattie non tubercolari dell'apparato urinario.

È stata dimostrata l'efficacia dell'analisi PCR nello studio di aspirati midollari in pazienti con febbre di origine sconosciuta e sospetta natura tubercolare della malattia. Per la diagnosi di linfoadenite tubercolare nei bambini, sono stati studiati 102 aspirati e campioni bioptici di 67 bambini con sospetta linfoadenite tubercolare. Sono stati ottenuti risultati positivi: con PCR in tempo reale - 71,6%, microscopia a fluorescenza - 46,3%, studio colturale - 41,8%. Nello studio di 50 biopsie linfonodali in pazienti con malattia da graffio di gatto, tutti i risultati sono stati negativi. Pertanto, è stata dimostrata una specificità del 100% dell'analisi PCR. Nello stesso lavoro, è stata dimostrata la possibilità di rilevare M. avium nella biopsia linfonodale.

La diagnosi di tubercolosi genitale femminile in caso di infertilità è notoriamente uno dei problemi diagnostici più complessi. Risultati positivi sono stati ottenuti negli studi PCR su biopsie endometriali, aspirati endometriali e campioni di fluido della tasca di Douglas in 14 (56%) delle 25 pazienti esaminate laparoscopicamente con sospetta tubercolosi. La microscopia dello striscio e gli studi colturali hanno prodotto rispettivamente 1 e 2 risultati positivi. Questi casi erano anche positivi alla PCR. La maggior parte dei risultati PCR positivi si è verificata in casi con caratteristiche tipiche della tubercolosi secondo l'esame istologico; un numero minore si è verificato in casi con sospetta tubercolosi secondo laparoscopia. Solo un risultato PCR positivo è stato ottenuto in assenza di dati laparoscopici per la tubercolosi.

Nella diagnosi di forme extrapolmonari di tubercolosi, i medici spesso si interrogano sulla possibilità di identificare il patogeno esaminando campioni di sangue con il metodo PCR. I dati della letteratura indicano che il rilevamento del DNA di Mycobacterium tuberculosis da campioni di sangue è possibile nelle forme avanzate di infezione da HIV. Il DNA di Mycobacterium tuberculosis è stato rilevato solo in pazienti con tubercolosi generalizzata di vari organi sottoposti a trapianto renale e immunodepressione.

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Identificazione delle specie di micobatteri

Il metodo PCR può essere molto efficace per l'identificazione rapida dei micobatteri del complesso tubercolare e di alcuni tipi di micobatteri non tubercolari dopo aver ottenuto la loro crescita primaria. In questo caso, l'uso della PCR può far risparmiare 7-10 giorni necessari per la successiva identificazione colturale di un risultato positivo. Lo studio PCR è tecnicamente molto semplice, poiché non richiede una complessa preparazione del campione di materiale clinico per ottenere un'elevata sensibilità. Esaminando 80 colture positive in un sistema di test di questo tipo (MB BacT. di Organon), tutti i risultati positivi dell'analisi PCR erano strettamente specifici e sono stati eseguiti entro 1 giorno. Per identificare altri tipi di micobatteri ottenuti in coltura, il DNA del patogeno viene ibridato con sonde di DNA specifiche marcate con acridina e i ceppi vengono rilevati mediante la comparsa di chemiluminescenza utilizzando un chemiluminometro o su strisce di nitrocellulosa con valutazione visiva dopo l'ibridazione. Questo kit identifica un numero limitato di specie: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii e M. gordonae.

A. Telenti et al. hanno anche sviluppato un metodo relativamente semplice ed economico per l'identificazione di specie di micobatteri clinicamente importanti, basato sulla PCR e sul successivo trattamento con due enzimi di restrizione (enzimi in grado di tagliare una molecola di DNA in punti specifici). In questo caso, un frammento di DNA codificante per una proteina da shock termico (65 kDa) viene amplificato, dopodiché il frammento di DNA ottenuto tramite PCR, di 439 coppie di nucleotidi, viene trattato separatamente con due enzimi: Bste II e Nae III. Successivamente, mediante elettroforesi su gel di agarosio, i due prodotti ottenuti vengono analizzati, determinandone le dimensioni (numero di coppie di nucleotidi) utilizzando un set di frammenti di DNA standard (marcatori molecolari del DNA) di lunghezza compresa tra 100 e 1000 coppie di nucleotidi. In ciascuna delle specie definite (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. fortuitum) si trovano 2 o 3 frammenti di DNA di diverse dimensioni per ciascun enzima di restrizione. La combinazione dei frammenti di DNA risultanti di diverse dimensioni consente di differenziare queste specie l'una dall'altra.

È in fase di sviluppo una tecnologia per i microarray di DNA biologico che aiuterà a identificare più di 100 specie di micobatteri in un unico studio.

L'identificazione delle specie può essere effettuata anche mediante amplificazione PCR della regione variabile dell'rRNA 16S seguita dal sequenziamento degli ampliconi in confronto alla struttura primaria corrispondente, il che consente l'identificazione di oltre 40 specie di micobatteri.

La PCR può anche essere utilizzata per identificare le specie all'interno del complesso dei micobatteri tubercolari, inclusa la differenziazione tra M. bovis e M. bovis BCG. Questo viene fatto analizzando la presenza o l'assenza di determinati geni nelle regioni genomiche RD1, RD9 e RD10. RD1 è assente in M. bovis BCG, ma è presente in specie virulente, tra cui M. bovis.

Determinazione della sensibilità al farmaco del Mycobacterium tuberculosis mediante PCR

I compiti dei metodi di genetica molecolare per determinare la sensibilità o la resistenza ai farmaci di Mycobacterium tuberculosis si riducono all'identificazione di mutazioni in determinate sequenze nucleotidiche di geni noti. I metodi principali si basano sulla lettura diretta (sequenziamento) di queste sequenze dopo amplificazione, oppure sull'ibridazione di frammenti di DNA marcati con biotina amplificati durante PCR con sonde a DNA. Entrambe le opzioni prevedono l'identificazione di sostituzioni nelle sequenze nucleotidiche che, quando si utilizzano sonde a DNA, portano all'assenza o all'ibridazione incompleta su una membrana di nitrocellulosa, utilizzando un coniugato enzimatico (streptavidina-fosfatasi alcalina): il metodo LIPA-Rif-TB.

Il metodo di misurazione della fluorescenza in sonde di DNA fissate localmente su microregioni complementari a mutazioni note in regioni geniche amplificate mediante PCR, responsabili della sensibilità o della resistenza ai farmaci, è chiamato metodo dei microbiochip. L'algoritmo di base per condurre questo studio è il seguente. Dopo l'isolamento del DNA da un campione clinico o da una coltura micobatterica, è necessario eseguire una PCR per amplificare i frammenti corrispondenti del gene groB, responsabile della sensibilità al farmaco alla rifampicina, o i geni katG e inhA, che codificano per le proteine micobatteriche responsabili della sensibilità all'isoniazide. I risultati della PCR vengono valutati mediante elettroforesi su gel di agarosio, che conferma la ricezione dei corrispondenti frammenti di DNA della lunghezza desiderata. Successivamente, viene eseguito un secondo ciclo di PCR per introdurre un marcatore fluorescente nel DNA. I risultati della PCR vengono nuovamente confermati mediante elettroforesi su gel. Successivamente, si esegue l'ibridazione (incubazione notturna) con successivo lavaggio del materiale ottenuto su un biochip, costituito da un gran numero di brevi catene di DNA (sonde) fissate su una piccola piastra di vetro, complementari alle sequenze nucleotidiche del micobatterio tubercolare farmaco-sensibile nei punti di possibili mutazioni, nonché alle sequenze mutanti responsabili della resistenza ai farmaci. La posizione delle sonde di DNA sulla piastra è rigorosamente definita e viene stabilito il livello di fluorescenza osservato durante l'ibridazione per la determinazione del risultato mediante uno speciale dispositivo di lettura. A questo proposito, i risultati dell'analisi vengono determinati utilizzando uno speciale programma informatico.

Negli ultimi anni sono stati sviluppati metodi alternativi per determinare la sensibilità al farmaco del Mycobacterium tuberculosis basati sulla tecnologia PCR in tempo reale, che consente di condurre questi studi in provetta chiusa.

La Figura 13-13 mostra il risultato dell'analisi di colture cliniche di Mycobacterium tuberculosis per la determinazione della resistenza al farmaco della rifampicina mediante PCR in tempo reale: 218 - campione di controllo (sensibile alla rifampicina); 93 - controllo positivo per la mutazione Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - controllo positivo per la mutazione Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - campioni sperimentali. Risultato del calcolo delle curve cinetiche di amplificazione per 4 canali: canale 1: 393 - controllo positivo per la mutazione Ser-Trp TCG-TGG; canale 2: 4482 - controllo positivo per la mutazione Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - campioni sperimentali; canale 4: curve cinetiche di amplificazione di tutti i campioni partecipanti all'esperimento. Controllo positivo della reazione di amplificazione. Conclusioni: L'analisi ha rivelato le seguenti mutazioni che determinano la resistenza alla rifampicina: nei campioni 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Lo stesso principio è stato utilizzato per determinare la resistenza al farmaco isoniazide da parte dei geni katG e inhA, che determinano le mutazioni più frequenti.

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Identificazione del ceppo di Mycobacterium tuberculosis

Il metodo più studiato per l'identificazione del ceppo di Mycobacterium tuberculosis è una tecnologia chiamata polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP), che si basa sulla frammentazione (restrizione) del DNA di Mycobacterium tuberculosis da parte dell'enzima Pvu II e sulla successiva ibridazione dei frammenti ottenuti con specifiche sequenze presenti sul DNA del suo elemento ripetuto IS6110. La variabilità intraspecifica è dovuta al diverso numero di ripetizioni IS6110 e alla loro posizione sul DNA, nonché alla diversa distanza tra determinati punti di attacco dell'enzima di restrizione (siti di restrizione) e l'elemento IS6110. Questa tecnologia è molto complessa e richiede molto lavoro. Dopo aver trattato il DNA isolato dalla coltura di Mycobacterium tuberculosis con l'enzima di restrizione, viene eseguita un'elettroforesi su gel, quindi frammenti di DNA di diverse lunghezze vengono trasferiti su una membrana di nitrocellulosa, ibridati con frammenti dell'elemento IS6110 e i risultati vengono rilevati mediante una reazione enzimatica. Il pattern di bande specifico risultante caratterizza il DNA di uno specifico ceppo di micobatterio tubercolare. L'analisi computerizzata rivela l'identità o la parentela dei ceppi. Nonostante il metodo RFLP sia il più discriminante, ovvero riveli il maggior numero di differenze nei ceppi analizzati, risulta inefficace con un numero ridotto (inferiore a 5) di ripetizioni IS6110, osservate in alcuni ceppi. Le Figure 13-14 mostrano i risultati della tipizzazione RFLP dei ceppi.

Un'alternativa potrebbe essere il metodo di spoligotipizzazione, ovvero l'analisi del polimorfismo delle sequenze di DNA spaziatore, intermedie tra le ripetizioni dirette della regione DR. Quando si esegue lo spoligotipizzazione dei ceppi, la PCR viene eseguita con primer che limitano la regione DR, dopodiché si formano frammenti di diversa lunghezza che si ibridano con regioni di DNA intermedie variabili. L'analisi delle sequenze spaziatrici della regione DR sembra, secondo i ricercatori, più semplice, produttiva e adatta allo screening primario dei ceppi e all'analisi epidemiologica preliminare, nonché allo studio diretto di materiale clinico.

Ovviamente, un metodo più efficace e tecnologicamente accessibile è il VNTR (abbreviazione di "VNTR"), ovvero il metodo per determinare il numero variabile di ripetizioni tandem esatte nel DNA del Mycobacterium tuberculosis. Questo metodo si basa esclusivamente sull'uso della PCR e non richiede ulteriori manipolazioni. Poiché il numero di ripetizioni tandem nei diversi ceppi e nei diversi loci è diverso, frammenti di dimensioni diverse vengono determinati e analizzati sull'elettroforegramma risultante dei prodotti di PCR. Secondo i ricercatori, con l'aiuto del VNTR, si ottiene un maggiore grado di discriminazione dei ceppi rispetto al metodo RFLP.

Negli ultimi anni è stata posta molta attenzione sulla diffusione di ceppi di Mycobacterium tuberculosis della famiglia W-Beijing (a volte chiamati ceppo di Pechino), che sono in gran parte resistenti ai farmaci.

Requisiti fondamentali per la qualità della ricerca in biologia molecolare

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Principali documenti normativi per la conduzione della PCR

Ordinanze del Ministero della Salute della Federazione Russa: n. 45 del 7.02.2000; n. 109 del 21.03.2003; n. 64 del 21.02.2000. Linee guida: 1.3.1888-04 "Organizzazione del lavoro durante la ricerca PCR di materiale infetto da agenti biologici patogeni dei gruppi di patogenicità III-IV"; 1.3.1794-03 "Organizzazione del lavoro durante la ricerca PCR di materiale infetto da microrganismi dei gruppi di patogenicità I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 "Disinfezione del materiale di prova infetto da batteri dei gruppi di patogenicità I-IV durante l'utilizzo del metodo PCR", 2001. Appendice 11 alle Istruzioni sui metodi unificati di ricerca microbiologica per l'individuazione, la diagnosi e il trattamento della tubercolosi.

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Personale

Gli studi di biologia molecolare possono essere svolti da medici specialisti in diagnostica di laboratorio clinica, batteriologi, virologi, biologi di laboratorio di diagnostica clinica, nonché da specialisti con formazione medica secondaria che abbiano seguito corsi di specializzazione e formazione avanzata secondo le modalità stabilite.

Disposizione dei locali del laboratorio

Sono necessarie le seguenti strutture di laboratorio:

• Area di elaborazione dei campioni: laboratorio adattato per lavorare con agenti infettivi dei gruppi di patogenicità III-IV, in conformità con le Linee guida metodologiche 13.1888-04.
• L'area per la preparazione delle miscele di reazione PCR è una stanza di laboratorio che garantisce protezione dalla contaminazione interna del laboratorio: un'area "pulita".
• • Se si utilizza l'elettroforesi o l'ibridazione per analizzare i prodotti della PCR, la stanza di laboratorio in cui i frammenti di DNA amplificati vengono estratti dalla provetta di amplificazione e, di conseguenza, possono entrare nell'ambiente, in conformità con i requisiti per i laboratori PCR (Linee Guida Metodologiche 1.3.1794-03, Linee Guida Metodologiche 1.3.1888-04) deve essere completamente isolata dalle stanze specificate nei paragrafi precedenti. Deve essere escluso lo spostamento di personale, attrezzature, materiali e oggetti dall'area di elettroforesi all'area di elaborazione dei campioni e all'area "pulita", nonché il trasferimento di aria attraverso il sistema di ventilazione o a causa di correnti d'aria. Quest'area non è necessaria per la rilevazione fluorimetrica dei prodotti della PCR.
• La sala per la documentazione e l'elaborazione dei risultati è dotata di computer e delle attrezzature d'ufficio necessarie. Questa sala può contenere apparecchiature che garantiscono il rilevamento dei prodotti della PCR senza aprire la provetta: rilevatori fluorescenti per PCR e termociclatori per PCR in tempo reale.

I requisiti sanitari ed epidemiologici per il trattamento primario dell'espettorato sono simili ai requisiti microbiologici standard per lavorare con Mycobacterium tuberculosis.

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Set completo di attrezzature da laboratorio per la diagnostica PCR

Il kit di laboratorio comprende le attrezzature per le seguenti stanze.

• sala di preparazione dei campioni, contiene la seguente attrezzatura: cappa a flusso laminare di classe di protezione II "SP-1.2": termostato a stato solido con coperchio riscaldato per provette Eppendorf; microcentrifuga a 13.000 giri/min; centrifuga ("Vortex"); frigorifero con intervallo di temperatura da -20 ^° C a +10 ^° C; pipette a volume variabile della serie "Proline"; pompa con pallone di raccolta OM-1; rack per pipette; rack per postazione di lavoro 200x0,5 ml; rack per postazione di lavoro 50x1,5 ml; rack per lo stoccaggio di provette 80x1,5 ml;
• sala preparazione miscele di reazione: camera protettiva PCR box ("Laminar-C. 110 cm); centrifuga "Vortex"; pipette a volume variabile della serie "Proline"; rack per pipette; rack per postazione di lavoro 200x0,2 ml; rack per lo stoccaggio di provette 80x1,5 ml; frigorifero con intervallo di temperatura da -20 ^° C a +10 ^° C;
• Sala elettroforesi: camera elettroforesi orizzontale; fonte di alimentazione; transilluminatore;
• Amplificatore di DNA o analizzatore di acidi nucleici (PCR in tempo reale) con computer e software; può essere installato in qualsiasi stanza disponibile. Se si utilizza la tecnologia PCR in tempo reale, non è necessaria una sala per elettroforesi.

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Controllo di qualità esterno

Per garantire di ottenere risultati oggettivamente affidabili, i laboratori devono partecipare a un sistema di valutazione esterna della qualità della ricerca di laboratorio.

I partecipanti al sistema di controllo qualità ricevono: 12 fiale con sospensioni liofilizzate di cellule batteriche, due delle quali contengono E. coli, 3 fiale con micobatteri della tubercolosi (ceppo avirulento) a una concentrazione di 10 ² /ml; 3 fiale con cellule di un ceppo simile a una concentrazione di 10 ⁴ /ml; 2 fiale ciascuna con micobatteri non tubercolari M. avium-intracellulare e M. kansasii a una concentrazione di 10 ⁵ /ml.

I test inviati per la valutazione esterna della qualità vengono pre-testati in due laboratori indipendenti con vasta esperienza nel settore.

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