Ruolo di enzimi e citochine nella patogenesi dell'osteoartrite

Negli ultimi anni, molta attenzione dei ricercatori si è concentrata sull'identificazione delle proteasi responsabili della degradazione della matrice extracellulare (ECM) della cartilagine articolare nell'osteoartrosi. Secondo le teorie moderne, le metalloproteasi della matrice (MMP) svolgono un ruolo importante nella patogenesi dell'osteoartrosi. Nei pazienti con osteoartrosi, si riscontra un aumento dei livelli di tre MMP: collagenasi, stromelisina e gelatinasi. La collagenasi è responsabile della degradazione del collagene nativo, la stromelisina del collagene di tipo IV, dei proteoglicani e della laminina, la gelatinasi della gelatina, dei collageni di tipo IV, Vh XI e dell'elastina. Inoltre, si ipotizza la presenza di un altro enzima, l'aggrecanasi, che possiede le stesse proprietà delle MMP ed è responsabile della proteolisi degli aggregati di proteoglicani cartilaginei.

Nella cartilagine articolare umana sono stati identificati tre tipi di collagenasi, i cui livelli sono significativamente elevati nei pazienti con osteoartrite: collagenasi-1 (MMP-1), collagenasi-2 (MMP-8) e collagenasi-3 (MMP-13). La coesistenza di tre diversi tipi di collagenasi nella cartilagine articolare suggerisce che ognuno di essi svolga un ruolo specifico. Infatti, le collagenasi-1 e -2 sono localizzate principalmente nella zona superficiale e intermedia superiore della cartilagine articolare, mentre la collagenasi-3 si trova nella zona intermedia inferiore e nella zona profonda. Inoltre, i risultati dello studio immunoistochimico hanno dimostrato che con la progressione dell'osteoartrite, il livello di collagenasi-3 raggiunge un plateau e persino diminuisce, mentre il livello di collagenasi-1 aumenta gradualmente. Vi sono prove che nell'osteoartrite, la collagenasi-1 sia principalmente coinvolta nel processo infiammatorio nella cartilagine articolare, mentre la collagenasi-3 è coinvolta nel rimodellamento tissutale. La collagenasi-3, espressa nella cartilagine dei pazienti affetti da OA, degrada il collagene di tipo II in modo più intenso rispetto alla collagenasi-1.

Tra i rappresentanti del secondo gruppo di metalloproteasi, tre sono stati identificati anche nella stromelisina umana: stromelisina-1 (MMP-3), stromelisina-2 (MMP-10) e stromelisina-3 (MMP-11). Oggi è noto che solo la stromelisina-1 è coinvolta nel processo patologico dell'osteoartrosi. La stromelisina-2 non è rilevata nella membrana sinoviale dei pazienti con osteoartrosi, ma è presente in quantità molto piccole nei fibroblasti sinoviali dei pazienti con artrite reumatoide. Anche la stromelisina-3 è presente nella membrana sinoviale dei pazienti con artrite reumatoide in prossimità dei fibroblasti, soprattutto nelle zone di fibrosi.

Nel gruppo delle gelatinasi presenti nel tessuto cartilagineo umano ne sono state identificate solo due: la gelatinasi da 92 kD (gelatinasi B o MMP-9) e la gelatinasi da 72 kD (gelatinasi A o MMP-2); nei pazienti affetti da osteoartrite si riscontra un aumento del livello della gelatinasi da 92 kD.

Recentemente, è stato identificato un altro gruppo di MMP localizzate sulla superficie delle membrane cellulari, chiamate MMP di tipo membrana (MMP-MT). Questo gruppo comprende quattro enzimi: MMP-MT1 e MMP-MT-4. L'espressione di MMP-MT è stata riscontrata nella cartilagine articolare umana. Sebbene MMP-MT-1 abbia proprietà collagenasi, entrambi gli enzimi MMP-MT-1 e MMP-MT-2 sono in grado di attivare la gelatinasi-72 kDa e la collagenasi-3. Il ruolo di questo gruppo di MMP nella patogenesi dell'OA richiede chiarimenti.

Le proteinasi sono secrete sotto forma di zimogeno, che viene attivato da altre proteinasi o da composti organici del mercurio. L'attività catalitica delle MMP dipende dalla presenza di zinco nella zona attiva dell'enzima.

L'attività biologica delle MMP è controllata da specifici TIMP. Ad oggi, sono stati identificati tre tipi di TIMP presenti nei tessuti articolari umani: TIMP-1–TIMP-3. Un quarto tipo di TIMP è stato identificato e clonato, ma non è ancora stato rilevato nei tessuti articolari umani. Queste molecole si legano specificamente al sito attivo delle MMP, sebbene alcune di esse siano in grado di legare il sito attivo della progelatinasi da 72 kD (TIMP-2, -3, -4) e della progelatinasi da 92 kD (TIMP-1 e -3). Le evidenze suggeriscono che nell'OA vi sia uno squilibrio tra MMP e TIMP nella cartilagine articolare, con conseguente relativa carenza di inibitori, probabilmente dovuta in parte a un aumento del livello di MMP attive nel tessuto. TIMP-1 e -2 si trovano nella cartilagine articolare e sono sintetizzati dai condrociti. Nell'osteoartrosi, solo il TIMP di tipo I è presente nella membrana sinoviale e nel liquido sinoviale. Il TIMP-3 si trova esclusivamente nella matrice extracellulare (ECM). Il TIMP-4 condivide quasi il 50% della sua sequenza amminoacidica con il TIMP-2 e il 38% con il TIMP-1. In altre cellule bersaglio, il TIMP-4 è responsabile della modulazione dell'attivazione della progelatinasi da 72 kDa sulla superficie cellulare, indicando un ruolo importante come regolatore tessuto-specifico del rimodellamento dell'ECM.

Un altro meccanismo per controllare l'attività biologica delle MMP è la loro attivazione fisiologica. Si ritiene che gli enzimi della famiglia delle serina e cisteina proteasi, come rispettivamente AP/plasmina e catepsina B, siano attivatori fisiologici delle MMP. Livelli elevati di urochinasi (uAP) e plasmina sono stati riscontrati nella cartilagine articolare di pazienti con osteoartrite.

Nonostante diversi tipi di catepsine siano presenti nei tessuti articolari, la catepsina-B è considerata l'attivatore più probabile delle MMP nella cartilagine. Inibitori fisiologici delle proteasi a serina e cisteina sono stati riscontrati nei tessuti articolari umani. L'attività dell'inibitore di AP-1 (IAI-1), così come delle proteasi a cisteina, è ridotta nei pazienti con osteoartrite. Analogamente a MMP/TIMP, è lo squilibrio tra le proteasi a serina e cisteina e i loro inibitori a spiegare l'aumentata attività delle MMP nella cartilagine articolare dei pazienti con osteoartrite. Inoltre, le MMP sono in grado di attivarsi a vicenda. Ad esempio, la stromelisina-1 attiva la collagenasi-1, la collagenasi-3 e la gelatinasi a 92 kDa; la collagenasi-3 attiva la gelatinasi a 92 kDa; la MMP-MT attiva la collagenasi-3 e la gelatinasi a 72 kDa potenzia questa attivazione; L'MMP-MT attiva anche la gelatinasi da 72 kDa. Le citochine possono essere suddivise in tre gruppi: distruttive (infiammatorie), regolatorie (incluse quelle antinfiammatorie) e anaboliche (fattori di crescita).

Tipi di citochine (secondo van den Berg WB et al)

Distruttivo	Interleuchina-1 TNF-α Fattore inibitorio della leucemia Interleuchina-17
Normativa	Interleuchina-4 Interleuchina-10 Interleuchina-13 Inibitori enzimatici
Anabolizzanti	Fattori di crescita insulino-simili TGF-b Proteine morfogenetiche ossee Proteine morfogenetiche derivate dalla cartilagine

Le citochine distruttive, in particolare IL-1, inducono un aumento del rilascio di proteasi e inibiscono la sintesi di proteoglicani e collagene da parte dei condrociti. Le citochine regolatrici, in particolare IL-4 e IL-10, inibiscono la produzione di IL-1, aumentano la produzione dell'antagonista del recettore dell'IL-1 (IL-1RA) e riducono i livelli di NO sintasi nei condrociti. Pertanto, IL-4 contrasta IL-1 in tre direzioni: 1) ne riduce la produzione, prevenendone gli effetti, 2) aumenta la produzione del principale "scavenger" IL-1RA e 3) riduce la produzione del principale "messaggero" secondario NO. Inoltre, IL-4 riduce la degradazione enzimatica tissutale. In vivo, l'effetto terapeutico ottimale si ottiene con una combinazione di IL-4 e IL-10. Fattori anabolici come TGF-β e IGF-1 in realtà non interferiscono con la produzione o l'azione dell'IL-1, ma mostrano l'attività opposta, ad esempio stimolando la sintesi di proteoglicani e collagene, sopprimendo l'attività delle proteasi, e il TGF-β inibisce anche il rilascio di enzimi e stimola i loro inibitori.

Le citochine proinfiammatorie sono responsabili dell'aumento della sintesi ed espressione delle MMP nei tessuti articolari. Vengono sintetizzate nella membrana sinoviale e poi diffondono nella cartilagine articolare attraverso il liquido sinoviale. Le citochine proinfiammatorie attivano i condrociti, che a loro volta sono in grado di produrre citochine proinfiammatorie. Nelle articolazioni affette da osteoartrosi, il ruolo di effettori dell'infiammazione è svolto principalmente dalle cellule della membrana sinoviale. Sono i sinovociti di tipo macrofagico a secernere proteasi e mediatori infiammatori. Tra questi, IL-f, TNF-α, IL-6, fattore inibitorio della leucemia (LIF) e IL-17 sono i più "coinvolti" nella patogenesi dell'osteoartrosi.

Sostanze biologicamente attive che stimolano la degradazione della cartilagine articolare nell'osteoartrite

• Interleuchina-1
• Interleuchina-3
• Interleuchina-4
• TNF-α
• Fattori stimolanti le colonie: macrofagi (monociti) e granulociti-macrofagi
• Sostanza P
• PGE ₂
• Attivatori del plasminogeno (tipi tissutali e urochinasi) e plasmina
• Metalloproteasi (collagenasi, ellastasi, stromelisine)
• Catepsine A e B
• Trilsin
• Lipopolisaccaridi batterici
• Fosfolipasi Ag

I dati della letteratura indicano che IL-1 e, probabilmente, TNF-α sono i principali mediatori della distruzione del tessuto articolare nell'osteoartrosi. Tuttavia, non è ancora noto se agiscano indipendentemente l'uno dall'altro o se esista una gerarchia funzionale tra di essi. Modelli animali di osteoartrosi hanno dimostrato che il blocco di IL-1 previene efficacemente la distruzione della cartilagine articolare, mentre il blocco di TNF-α porta solo a una riduzione dell'infiammazione nei tessuti articolari. Concentrazioni aumentate di entrambe le citochine sono state riscontrate nella membrana sinoviale, nel liquido sinoviale e nella cartilagine dei pazienti. Nei condrociti, sono in grado di aumentare la sintesi non solo di proteasi (principalmente MMP e AP), ma anche di collageni minori, come quelli di tipo I e III, e di ridurre la sintesi di collageni di tipo II e IX e di proteoglicani. Queste citochine stimolano anche le specie reattive dell'ossigeno e i mediatori infiammatori come la _PGE2. Il risultato di tali cambiamenti macromolecolari nella cartilagine articolare nell'osteoartrite è l'inefficacia dei processi riparativi, che porta a un'ulteriore degradazione della cartilagine.

Le citochine proinfiammatorie sopra menzionate modulano i processi di soppressione/attivazione delle MMP nell'osteoartrosi. Ad esempio, lo squilibrio tra i livelli di TIMP-1 e di MMP nella cartilagine nell'osteoartrosi potrebbe essere mediato dall'IL-1, poiché uno studio in vitro ha dimostrato che un aumento delle concentrazioni di IL-1 beta porta a una diminuzione delle concentrazioni di TIMP-1 e a un aumento della sintesi di MMP da parte dei condrociti. Anche la sintesi di AP è modulata dall'IL-1 beta. La stimolazione in vitro dei condrociti della cartilagine articolare con IL-1 causa un aumento dose-dipendente della sintesi di AP e una netta diminuzione della sintesi di iAP-1. La capacità dell'IL-1 di ridurre la sintesi di iAP-1 e stimolare la sintesi di AP è un potente meccanismo per la generazione di plasmina e l'attivazione delle MMP. Inoltre, la plasmina non è solo un enzima che attiva altri enzimi, ma partecipa anche al processo di degradazione della cartilagine mediante proteolisi diretta.

L'IL-ip viene sintetizzata come precursore inattivo con una massa di 31 kDa (pre-IL-ip) e, dopo la scissione del peptide segnale, viene convertita in una citochina attiva con una massa di 17,5 kDa. Nei tessuti articolari, tra cui la membrana sinoviale, il liquido sinoviale e la cartilagine articolare, l'IL-ip si trova in forma attiva e studi in vivo hanno dimostrato la capacità della membrana sinoviale nell'osteoartrosi di secernere questa citochina. Alcune serina proteasi sono in grado di convertire la pre-IL-ip nella sua forma bioattiva. Nei mammiferi, tali proprietà sono state riscontrate in una sola proteasi, appartenente alla famiglia degli enzimi specifici dell'aspartato di cisteina, chiamata enzima di conversione dell'IL-1β (ICF, o caspasi-1). Questo enzima è in grado di convertire specificamente la pre-IL-ip in IL-ip "matura" biologicamente attiva con una massa di 17,5 kDa. L'ICF è un proenzima (p45) da 45 kD localizzato nella membrana cellulare. Dopo la scissione proteolitica del proenzima p45, si formano due subunità, note come p10 e p20, caratterizzate da un'attività enzimatica.

Il TNF-α viene sintetizzato anche come precursore legato alla membrana con una massa di 26 kDa; tramite scissione proteolitica, viene rilasciato dalla cellula come forma solubile attiva con una massa di 17 kDa. La scissione proteolitica è effettuata dall'enzima di conversione del TNF-α (TNF-AC), appartenente alla famiglia delle adamalizine. AR Amin et al. (1997) hanno riscontrato un'aumentata espressione dell'mRNA di TNF-AC nella cartilagine articolare di pazienti con osteoartrite.

L'attivazione biologica di condrociti e sinovociti da parte di IL-1 e TNF-α è mediata dal legame a specifici recettori sulla superficie cellulare: IL-R e TNF-α. Sono stati identificati due tipi di recettori per ciascuna citochina: IL-IP di tipo I e II e TNF-R di tipo I (p55) e II (p75). IL-1PI e p55 sono responsabili della trasmissione del segnale nelle cellule del tessuto articolare. IL-1R di tipo I ha un'affinità leggermente maggiore per IL-1β rispetto a IL-1α; IL-1R di tipo II, al contrario, ha un'affinità maggiore per IL-1α rispetto a IL-β. Non è ancora chiaro se l'IL-IP di tipo II possa mediare i segnali dell'IL-1 o se serva solo per l'inibizione competitiva dell'associazione di IL-1 con IL-1R di tipo I. I condroiti e i fibroblasti sinoviali dei pazienti con osteoartrosi contengono grandi quantità di IL-1PI e p55, il che a sua volta spiega l'elevata sensibilità di queste cellule alla stimolazione da parte delle corrispondenti citochine. Questo processo porta sia a un aumento della secrezione di enzimi proteolitici sia alla distruzione della cartilagine articolare.

Non si può escludere il coinvolgimento dell'IL-6 nel processo patologico dell'osteoartrite. Questa ipotesi si basa sulle seguenti osservazioni:

• L'IL-6 aumenta il numero di cellule infiammatorie nella membrana sinoviale,
• L'IL-6 stimola la proliferazione dei condrociti,
• L'IL-6 potenzia gli effetti dell'IL-1 nell'aumento della sintesi di MMP e nell'inibizione della sintesi dei proteoglicani.

Tuttavia, l'IL-6 è in grado di indurre la produzione di TIMP, ma non influenza la produzione di MMP, quindi si ritiene che questa citochina sia coinvolta nel processo di inibizione della degradazione proteolitica della cartilagine articolare, che avviene tramite un meccanismo di feedback.

Un altro membro della famiglia IL-6 è LIF, una citochina prodotta dai condrociti ottenuti da pazienti con osteoartrosi in risposta alla stimolazione delle citochine proinfiammatorie IL-1p e TNF-α. LIF stimola il riassorbimento dei proteoglicani cartilaginei, nonché la sintesi di MMP e la produzione di NO. Il ruolo di questa citochina nell'osteoartrosi non è stato ancora completamente chiarito.

L'IL-17 è un omodimero di 20-30 kDa con un effetto simile a quello dell'IL-1, ma molto meno pronunciato. L'IL-17 stimola la sintesi e il rilascio di diverse citochine proinfiammatorie, tra cui IL-1p, TNF-α, IL-6 e MMP nelle cellule bersaglio, come i macrofagi umani. Inoltre, l'IL-17 stimola la produzione di NO da parte dei condrociti. Come il LIF, il ruolo dell'IL-17 nella patogenesi dell'OA è stato poco studiato.

Il radicale libero inorganico NO svolge un ruolo importante nella degradazione della cartilagine articolare nell'OA. I condrociti isolati da pazienti con osteoartrite producono quantità maggiori di NO sia spontaneamente che dopo stimolazione con citochine proinfiammatorie rispetto alle cellule normali. Un elevato contenuto di NO è stato riscontrato nel liquido sinoviale e nel siero di pazienti con osteoartrite, a causa dell'aumentata espressione e sintesi della NO sintasi indotta (hNOC), l'enzima responsabile della produzione di NO. Recentemente, è stato clonato il DNA dell'hNOC specifico dei condrociti ed è stata determinata la sequenza amminoacidica dell'enzima. La sequenza amminoacidica indica un'identità del 50% e una similarità del 70% con l'hNOC specifico dell'endotelio e del tessuto nervoso.

L'NO inibisce la sintesi delle macromolecole dell'ECM della cartilagine articolare e stimola la sintesi di MMP. Inoltre, un aumento della produzione di NO è accompagnato da una diminuzione della sintesi dell'antagonista dell'IL-IP (IL-1RA) da parte dei condrociti. Pertanto, un aumento del livello di IL-1 e una diminuzione di IL-1RA portano a un'iperstimolazione di NO nei condrociti, che a sua volta porta a una maggiore degradazione della matrice cartilaginea. Esistono studi sull'effetto terapeutico in vivo di un inibitore selettivo dell'hNOC sulla progressione dell'osteoartrosi sperimentale.

Gli inibitori naturali delle citochine sono in grado di impedire direttamente il legame delle citochine ai recettori della membrana cellulare, riducendone l'attività proinfiammatoria. Gli inibitori naturali delle citochine possono essere suddivisi in tre classi in base al loro meccanismo d'azione.

La prima classe di inibitori include antagonisti recettoriali che impediscono il legame del ligando al suo recettore competendo per il sito di legame. Ad oggi, un inibitore di questo tipo è stato trovato solo per l'IL-1: si tratta dell'inibitore competitivo del sistema IL-1/ILIP IL-1 PA, già menzionato. L'IL-1 PA blocca molti effetti osservati nei tessuti articolari nell'osteoartrite, tra cui la sintesi di prostaglandine da parte delle cellule sinoviali, la produzione di collagenasi da parte dei condrociti e la degradazione del midollo osseo della cartilagine articolare.

L'IL-1RA è presente in diverse forme: una solubile (rIL-1RA) e due intercellulari (μIL-lPAI e μIL-1RAP). L'affinità della forma solubile dell'IL-1RA è 5 volte superiore a quella delle forme intercellulari. Nonostante un'intensa ricerca scientifica, la funzione di quest'ultima rimane sconosciuta. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che l'inibizione dell'attività dell'IL-1β richiede una concentrazione di IL-1RA da 10 a 100 volte superiore al normale, mentre in vivo è necessario un aumento di mille volte della concentrazione di IL-1RA. Questo fatto potrebbe spiegare in parte la relativa carenza di IL-1RA e l'eccesso di IL-1 nella sinovia dei pazienti con osteoartrosi.

La seconda classe di inibitori naturali delle citochine sono i recettori solubili delle citochine. Esempi di tali inibitori nell'uomo correlati alla patogenesi dell'osteoartrite sono rIL-1R e pp55. I recettori solubili delle citochine sono forme accorciate dei recettori normali; quando si legano alle citochine, ne impediscono il legame ai recettori di membrana delle cellule bersaglio, agendo attraverso il meccanismo dell'antagonismo competitivo.

Il principale precursore dei recettori solubili è l'IL-1RP legato alla membrana. L'affinità di rIL-IP per IL-1 e IL-1RA è diversa. Pertanto, rIL-1RN ha un'affinità maggiore per IL-1β rispetto a IL-1RA, e rIL-1PI mostra un'affinità maggiore per IL-1RA rispetto a IL-ip.

Esistono anche due tipi di recettori solubili per il TNF: pp55 e pp75. Come i recettori solubili per l'IL-1, anche questi si formano per "dispersione". In vivo, entrambi i recettori sono presenti nei tessuti delle articolazioni colpite. Il ruolo dei recettori solubili del TNF nella patogenesi dell'osteoartrosi è dibattuto. Si presume che a basse concentrazioni stabilizzino la struttura tridimensionale del TNF e aumentino l'emivita della citochina bioattiva, mentre alte concentrazioni di pp55 e pp75 possono ridurre l'attività del TNF per antagonismo competitivo. Probabilmente, pp75 può agire da trasportatore del TNF, facilitandone il legame al recettore di membrana.

La terza classe di inibitori naturali delle citochine è rappresentata da un gruppo di citochine antinfiammatorie, che includono TGF-beta, IL-4, IL-10 e IL-13. Le citochine antinfiammatorie riducono la produzione di proteine pro-infiammatorie e di alcune proteasi, e stimolano la produzione di IL-1RA e TIMP.