Immunofenotipizzazione delle emoblastosi

I progressi significativi nella ricerca ematologica degli ultimi anni sono associati all'utilizzo di moderni metodi immunologici e di strumenti automatizzati per l'analisi e la selezione delle cellule del sangue periferico e del midollo osseo: i citofluorimetri. Gli studi morfologici e citochimici tradizionali sulle cellule substrato della malattia (sangue, midollo osseo rosso, linfonodi, milza, ecc.) in molti casi, soprattutto nelle malattie linfoproliferative, non consentono di identificare l'intera varietà di varianti tra forme morfologicamente simili e di stabilire la fonte di origine del clone patologico. Questi problemi possono essere risolti solo studiando le caratteristiche immunologiche delle cellule. Ogni fase di differenziazione delle cellule emopoietiche corrisponde a un proprio insieme di antigeni, che secondo la classificazione internazionale sono chiamati differenziazione e sono suddivisi in cluster di differenziazione, denominati CD.

Nelle alterazioni neoplastiche, un blocco della differenziazione può verificarsi in qualsiasi fase dello sviluppo cellulare normale, con conseguente formazione di un clone di cellule patologiche che determinano il substrato patologico e presentano le stesse caratteristiche immunologiche (o fenotipiche). Studiando questi marcatori sulle cellule, è possibile determinare a quale forma e variante della malattia corrispondono, ovvero, in base al fenotipo immunologico delle cellule, condurre una diagnosi differenziale, cosa più difficile nelle malattie linfoproliferative, poiché le cellule principali del substrato patologico della malattia sono cellule morfologicamente pressoché identiche.

La fenotipizzazione consente l'utilizzo di anticorpi monoclonali per la tipizzazione di blasti e cellule del sangue mature della serie mielo-, mono- e linfocitaria in base alla presenza di antigeni di differenziazione (recettori) nella parete cellulare. La sezione "Valutazione dello stato immunitario dell'organismo" descrive parzialmente le caratteristiche e il valore diagnostico dello studio dei marcatori cellulari; di seguito è riportata una breve descrizione dei marcatori antigenici cellulari in relazione alla diagnosi di emoblastosi. I seguenti antigeni (marcatori) possono essere rilevati sulle membrane delle cellule del sangue e del midollo osseo rosso.

• CD2 è una glicoproteina transmembrana monomerica. È presente sulla superficie di tutti i linfociti T circolanti nel sangue e su alcuni linfociti NK. CD2 è coinvolto nel processo di attivazione alternativa dei linfociti T. Il rilevamento di CD2 mediante anticorpi monoclonali nella pratica clinica viene utilizzato per la fenotipizzazione di leucemie acute a cellule T, linfomi, condizioni infiammatorie croniche e immunodeficienze.
• Il CD3 è un complesso proteico associato al recettore antigene-specifico delle cellule T ed è il principale marcatore funzionale dei linfociti T. Facilita il trasferimento del segnale di attivazione dalla membrana al citoplasma cellulare. La determinazione del CD3 è indicata per la diagnosi di leucemia acuta a cellule T, linfomi (il CD3 non è espresso nelle neoplasie linfoidi non-T) e malattie da immunodeficienza.
• Il CD4 è una glicoproteina transmembrana espressa da una sottopopolazione di cellule T-helper (induttori), che costituiscono il 45% dei linfociti del sangue periferico. Nelle fasi precoci dello sviluppo linfocitario nel timo, gli antigeni CD4, così come il CD8, sono espressi da tutti i linfociti corticali. I timociti midollari, il cui fenotipo è simile a quello delle cellule T CD4+ mature del sangue periferico (T-helper), esprimono già i recettori CD4 o CD8. Nel sangue periferico, fino al 5% delle cellule presenta sia marcatori CD4 che CD8. Una minore espressione di CD4 è possibile su alcune cellule della serie monocitaria. Il CD4 è espresso nella maggior parte dei casi di linfoma a cellule T, inclusa la micosi fungoide, così come nella leucemia a cellule T associata a HTLV (HTLV - virus linfotropico T umano).
• Il CD5 è una glicoproteina a catena singola presente su tutti i linfociti T maturi e sulla maggior parte dei timociti, ed è debolmente espresso dai linfociti B. Il CD5 è presente sulle cellule neoplastiche della leucemia linfatica cronica a cellule B e del linfoma centrocitico. In altri tipi di malattie linfoidi maligne – linfoma follicolare, leucemia a cellule capellute, linfoma a grandi cellule – il CD5 non è espresso.
• Il CD7 è una proteina a catena singola, il marcatore più precoce della differenziazione delle cellule T. È espresso dai pro-linfociti T ancor prima della loro migrazione verso il timo. Il CD7 è rilevato sulla maggior parte delle cellule NK, mentre una debole espressione si osserva sui monociti. I linfociti B e i granulociti non contengono questo antigene. La determinazione del CD7 è utilizzata per diagnosticare i linfomi e la leucemia linfoblastica infantile a cellule T.
• Il CD8 è una proteina costituita da due catene polipeptidiche legate da ponti disolfuro. È espresso da una sottopopolazione di linfociti T citotossici e soppressori, che costituiscono il 20-35% dei linfociti del sangue periferico. Questo antigene è espresso anche dai linfociti NK, dai timociti corticali, dal 30% dei timociti midollari e da una sottopopolazione di cellule rosse del midollo osseo. Il CD8 viene studiato per quantificare il contenuto di linfociti T soppressori (vedere la sezione "Linfociti T soppressori nel sangue" sopra).

• Il CD10 è un'endopeptidasi associata alla membrana cellulare. Il CD10 è espresso dalle forme giovani di linfociti B e da una sottopopolazione di linfociti corticali. Il CD10 è espresso da tutte le cellule linfoblastiche (LLA).
• Il CD11c è espresso sulla membrana cellulare dai macrofagi, dai monociti, dai granulociti, dalle cellule NK e dalle cellule leucemiche a cellule capellute.
• CD13 è una glicoproteina espressa dalle cellule della linea mielomonocitica (cellule progenitrici, neutrofili, basofili, eosinofili, monociti e cellule leucemiche mieloidi). È assente nei linfociti T e B, negli eritrociti e nelle piastrine.
• Il CD14 è una glicoproteina di membrana di superficie. È espresso principalmente da monociti e macrofagi. Il CD14 è presente in oltre il 95% dei monociti nel sangue periferico e nel midollo osseo. Una forte espressione di CD14 si osserva nella leucemia mieloblastica acuta. Questo antigene non è espresso nella leucemia linfoblastica acuta e cronica.
• Il CD15 è un oligosaccaride. È coinvolto nella fagocitosi e nella chemiotassi. Questo antigene è presente sulla superficie dei granulociti maturi e delle cellule di Berezovsky-Sternberg. L'espressione dell'antigene CD15 è rilevata nel morbo di Hodgkin. Nei linfomi non-Hodgkin, il CD15 non viene rilevato nella maggior parte dei casi.
• Il CD16 è espresso sulla superficie di granulociti, monociti, macrofagi e cellule NK. Tutti i linfociti che esprimono questo antigene hanno la capacità di citotossicità cellulare anticorpo-dipendente. Il CD16 viene determinato durante la tipizzazione delle leucemie mieloidi croniche, per caratterizzare le cellule NK.
• Il CD19 è una glicoproteina presente su tutti i linfociti B periferici e su tutti i precursori delle cellule B. È assente dalle plasmacellule. È il marcatore più precoce delle cellule B e svolge un ruolo importante nella regolazione dell'attivazione e della proliferazione delle cellule B. Il CD19 è espresso su tutte le cellule neoplastiche della leucemia acuta di origine B ed è presente anche in alcune forme di leucemia monoblastica acuta.
• Il CD20 è una proteina non glicosilata. Nell'ontogenesi dei linfociti B, l'antigene CD20 compare dopo il CD19, nella fase di differenziazione pre-cellulare dei linfociti. È assente dalla membrana plasmatica delle plasmacellule. È espresso nella leucemia linfoblastica acuta (LLA), nella leucemia linfatica cronica a cellule B, nella leucemia a cellule capellute, nel linfoma di Burkitt e molto raramente nella leucemia monoblastica acuta.
• Il CD21 è una glicoproteina presente in quantità significative sui linfociti B negli organi linfoidi e in piccole quantità sulle cellule B del sangue periferico. Il CD21 è un recettore per il virus di Epstein-Barr.
• Il CD22 è una proteina costituita da due catene polipeptidiche. È espresso sulla membrana della maggior parte dei linfociti B, comprese le cellule precursori (prolinfociti). L'antigene non è espresso sui linfociti B (plasmacellule) dopo la loro attivazione. L'espressione più pronunciata di CD22 si riscontra sulle cellule della leucemia a cellule capellute, debole nella leucemia mieloide e nella leucemia linfoblastica acuta non-T.
• Il CD23 è una glicoproteina espressa in misura molto più elevata dai linfociti B attivati del sangue periferico. Il CD23 media la citotossicità IgE-dipendente e la fagocitosi da parte di macrofagi ed eosinofili.
• CD25 è una glicoproteina a catena singola identificata come recettore a bassa affinità per l'IL-2. Questo recettore è espresso sui linfociti T attivati e, in minor quantità, sui linfociti B attivati. Nel sangue periferico di individui sani, l'antigene è presente su oltre il 5% delle cellule linfoidi.
• Il CD29 è un recettore della fibronectina. È ampiamente distribuito nei tessuti ed è espresso dai leucociti. La rilevazione del CD29 sulle cellule del sangue periferico viene utilizzata per tipizzare una sottopopolazione di linfociti T con fenotipo CD4+CD29+, chiamati helper di tipo 2 (Th2). Queste cellule partecipano alla risposta immunitaria umorale producendo linfochine.
• Il CD33 è una glicoproteina transmembrana. È presente sulla superficie delle cellule della serie mieloide e monocitaria. Si trova sulla superficie dei monociti e, in misura minore, dei granulociti nel sangue periferico. Circa il 30% delle cellule rosse del midollo osseo esprime CD33, inclusi mieloblasti, promielociti e mielociti. L'antigene è assente dalle membrane delle cellule staminali pluripotenti. La determinazione del CD33 viene utilizzata per caratterizzare le cellule nelle leucemie di origine mieloide. Le cellule leucemiche di origine linfoide ed eritroide non esprimono CD33.
• Il CD34 è una fosfoglicoproteina espressa dalle cellule progenitrici emopoietiche, comprese le cellule staminali monopotenti. L'espressione più pronunciata di Ag si osserva nei progenitori precoci; con la maturazione delle cellule, l'espressione del marcatore diminuisce. Il CD34 si trova anche sulle cellule endoteliali. La determinazione del CD34 viene utilizzata per caratterizzare le cellule nelle leucemie mieloblastiche e linfoblastiche acute. Nelle leucemie linfatiche croniche e nei linfomi, l'espressione dell'antigene CD34 non viene rilevata.

• Il CD41a è espresso dalle piastrine e dai megacariociti. Gli anticorpi monoclonali per rilevare il CD41a vengono utilizzati per diagnosticare la leucemia megacarioblastica. Nella tromboastenia di Glanzmann, l'espressione di questo antigene è assente o significativamente soppressa.
• Il CD42b è una glicoproteina di membrana costituita da due catene polipeptidiche. Il marcatore viene rilevato sulla superficie delle piastrine e dei megacariociti. Nella pratica clinica, il rilevamento del CD42b viene utilizzato per diagnosticare la trombocitopatia - sindrome di Bernard-Soulier.
• Il CD45RA appartiene alla classe delle glicoproteine transmembrana. È un antigene leucocitario comune. È espresso sulla membrana cellulare dei linfociti B, in misura minore sui linfociti T e sui timociti midollari maturi. Il marcatore non è espresso dai granulociti.
• Il CD45RO è un'isoforma a basso peso molecolare del CD45RA, un antigene leucocitario comune. Viene rilevato sui linfociti T (linfociti T della memoria), una sottopopolazione di linfociti B, monociti e macrofagi. Gli anticorpi monoclonali anti-CD45RO interagiscono con la maggior parte dei timociti, una sottopopolazione di linfociti T CD4+ e CD8+ quiescenti, e con i linfociti T maturi attivati. Anche le cellule di origine mielomonocitaria, i granulociti e i monociti trasportano questo antigene. Viene rilevato nei linfomi centroblastici e immunoblastici.
• Il CD46 è un dimero O-glicosilato. È ampiamente distribuito nei tessuti ed è espresso da linfociti T e B, monociti, granulociti, cellule NK, piastrine, cellule endoteliali e fibroblasti, ma è assente dalla superficie dei globuli rossi. Il CD46 fornisce protezione tissutale dal complemento.
• Il CD61 è un antigene piastrinico. È espresso sulle piastrine del sangue periferico e del midollo osseo rosso, nonché sui megacariociti e sui megacarioblasti. La sua determinazione è utilizzata come marcatore nella leucemia megacarioblastica acuta. L'espressione dell'antigene è assente o soppressa nei pazienti con tromboastenia di Glanzmann.
• CD95, noto anche come Fas o APO-1, è una glicoproteina transmembrana appartenente alla famiglia dei recettori del fattore di necrosi tumorale. È espresso in quantità significative sui linfociti T (CD4+ e CD8+) nel sangue periferico e, in misura minore, sui linfociti B e sulle cellule NK. Questo antigene è espresso anche su granulociti, monociti, cellule tissutali e cellule neoplastiche. Il legame di CD95 al ligando di Fas (CD95L) induce l'apoptosi nelle cellule.
• Il CD95L, o ligando di Fas, è una proteina di membrana appartenente alla famiglia dei recettori del fattore di necrosi tumorale. Questo antigene è espresso dai linfociti T citotossici, dalle cellule NK e molto spesso dalle cellule tumorali; è il principale induttore dell'apoptosi nelle cellule.
• L'HLA-DR è un determinante monomorfico delle molecole di classe II del complesso maggiore di istocompatibilità (HLA) umano. Il marcatore è espresso sulle cellule di Langerhans, sulle cellule dendritiche degli organi linfoidi, su alcuni tipi di macrofagi, sui linfociti B, sui linfociti T attivati e sulle cellule epiteliali del timo. Lo studio di questo marcatore viene utilizzato per la determinazione quantitativa dei linfociti T attivati con fenotipo CD3+ HLA-DR+.

Utilizzando una diversa selezione di anticorpi monoclonali contro i marcatori, è possibile creare un ritratto fenotipico delle cellule caratteristiche di una determinata forma di leucemia.

Oltre all'impiego di metodi di immunofenotipizzazione per la diagnosi e la diagnosi differenziale delle emoblastosi, il loro utilizzo nel processo terapeutico per valutare lo stato di remissione e la popolazione residua di cellule leucemiche si è dimostrato particolarmente importante. Conoscendo il "ritratto" fenotipico delle cellule blastiche durante il periodo di diagnosi, questi marcatori consentono di individuare le cellule del clone leucemico durante il periodo di remissione e, grazie all'aumento del loro numero, di prevedere lo sviluppo di una recidiva molto prima (1-4 mesi) della comparsa dei suoi segni clinici e morfologici.

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