Diagnosi delle malattie mitocondriali

Valutazione della natura dell'ereditarietà e della manifestazione dei segni clinici delle malattie mitocondriali

Poiché le malattie miotocondriali possono in alcuni casi essere causate da danni al genoma nucleare, la trasmissione della malattia corrisponderà alle leggi mendeliane dell'ereditarietà. Nei casi in cui lo sviluppo della malattia è causato da mutazioni nel DNA mitocondriale, l'ereditarietà corrisponderà al tipo mitocondriale, ovvero sarà trasmessa per via materna. Infine, quando la patologia si sviluppa con danno simultaneo ai geni dei genomi nucleare e mitocondriale, l'ereditarietà sarà complessa e determinata da diversi fattori. A questo proposito, nell'analisi genealogica, in base a una caratteristica formale (la natura dell'ereditarietà secondo il pedigree), è possibile distinguere i più diversi tipi di ereditarietà: autosomica dominante, autosomica recessiva, legata al cromosoma X e mitocondriale.

Lo sviluppo di malattie miotocondriali come il disturbo del metabolismo dell'acido piruvico o la beta-ossidazione degli acidi grassi, ciclo di Krebs, è associato a mutazioni dei geni del genoma nucleare. Queste patologie sono caratterizzate da ereditarietà autosomica recessiva, quando i genitori sono portatori di mutazioni (eterozigoti) e il figlio è portatore di entrambe le mutazioni ereditarie, trasmesse sia dal padre che dalla madre (omozigote). I genitori sono generalmente sani, e una malattia simile o i suoi microsegni dovrebbero essere ricercati nei fratelli e nelle sorelle del bambino malato (fratelli probandi) e nei parenti sia da parte di madre che di padre (cugini).

Nel caso di un tipo di ereditarietà recessiva legata al cromosoma X (ad esempio, aciduria glutarica neonatale di tipo II o deficit della subunità E1 del complesso piruvico, malattia di Menkes, ecc.), i maschi sono più spesso colpiti e le madri sono portatrici delle mutazioni e le trasmettono ai figli maschi. L'ereditarietà materna differisce da quella legata al cromosoma X in quanto entrambi i sessi sono affetti. In questi casi, nell'analisi del pedigree, è necessario analizzare l'incidenza della malattia negli uomini, poiché non si manifesta nelle donne. Il pedigree non mostra la trasmissione della malattia lungo la linea padre-figlio, poiché il padre può trasmettere solo il cromosoma Y al figlio maschio.

Quando una malattia si sviluppa a causa di un danno al genoma mitocondriale (ad esempio, diverse malattie della catena respiratoria, la neuropatia ottica di Leber, le sindromi MELAS, MERF, NARP, ecc.), si traccia l'ereditarietà materna, poiché il bambino eredita i mitocondri dalla madre e questa può trasmetterli sia ai maschi che alle femmine. Pertanto, entrambi i sessi sono colpiti in egual misura. A questo proposito, la trasmissione della malattia lungo la linea materna dovrebbe essere tracciata nel pedigree.

Quando si analizza un albero genealogico e si cercano sintomi di malattie mitocondriali nei parenti, è importante ricordare che la gravità della malattia (espressività del segno) può variare notevolmente, il che può essere dovuto al diverso numero di mitocondri danneggiati, alla natura del danno, alla diversa distribuzione delle mutazioni nelle cellule, ecc. Pertanto, non è sempre possibile rilevare segni evidenti di malattia. In alcuni casi, vengono rilevati sintomi singoli o cancellati, oppure segni che possono essere individuati durante la ricerca mirata.

Lo sviluppo della patologia mitocondriale può essere associato a danni a vaste aree di mitocondri, le cosiddette microdelezioni (ad esempio, sindrome di Kearns-Sayre, sindrome di Pearson, alcune forme di diabete mellito con sordità, oftalmoplegia esterna progressiva, ecc.). In questi casi, i sintomi caratteristici spesso non si riscontrano nei parenti, poiché lo sviluppo delle malattie è associato alla comparsa di nuove mutazioni avvenute nello zigote subito dopo la fecondazione dell'ovulo ( mutazione de novo ). La malattia è sporadica. Spesso, insieme a queste malattie, vengono ereditate in modo autosomico dominante diverse condizioni associate a mutazioni multiple del DNA mitocondriale: ad esempio, alcune forme di encefalomiopatia, miopatia con danni oculari, nonostante la presenza di mutazioni del mtDNA (delezioni multiple), hanno un'ereditarietà di tipo autosomico dominante.

Tuttavia, a differenza dell'ereditarietà mendeliana, l'ereditarietà autosomica dominante nella patologia mitocondriale è caratterizzata da un gran numero di individui affetti nelle generazioni successive.

Infine, alcune malattie mitocondriali, spesso associate alla deplezione dei mitocondri del mtDNA o alla loro assenza nelle cellule, possono essere ereditate con modalità autosomica recessiva. Tra queste, forme congenite di miopatia, cardiomiopatia, sindrome da neurodistress, acidosi lattica, danno epatico, ecc.

Lo studio della natura della trasmissione ereditaria della malattia è importante per la prognosi medica e genetica e richiede un'analisi approfondita dei segni clinici con la conoscenza dei meccanismi di formazione della patologia mitocondriale e dei tipi della sua ereditarietà.

La manifestazione clinica varia ampiamente dai primi giorni di vita all'età adulta. Nell'analizzare questo indicatore, è necessario tenere conto delle forme nosologiche, poiché ciascuna di esse ha una certa età di esordio.

I disturbi metabolici osservati nelle malattie mitocondriali sono progressivi nella stragrande maggioranza dei casi. I sintomi iniziali sono spesso lievi, poi progrediscono e possono portare a gravi patologie invalidanti. Rare forme di patologia, come la miopatia infantile benigna e alcune forme di neuropatia ottica di Leber, possono essere benigne e soggette a regressione.

Durante gli esami di laboratorio, si presta attenzione ai segni caratteristici delle malattie mitocondriali:

• presenza di acidosi;
• livelli elevati di lattato e piruvato nel sangue, un aumento dell'indice lattato/piruvato superiore a 15, che aumenta soprattutto con il carico di glucosio o l'esercizio fisico;
• iperchetonemia;
• ipoglicemia;
• iperammoniemia;
• aumento delle concentrazioni di acetoacetato e 3-idrossibutirrato;
• aumento del rapporto acido 3-idrossibutirrico/acido acetaacetico nel sangue;
• aumento dei livelli di aminoacidi nel sangue e nelle urine (alanina, glutammina, acido glutammico, valina, leucina, isoleucina);
• livelli elevati di acidi grassi nel sangue;
• iperescrezione di acidi organici nelle urine;
• diminuzione dei livelli di carnitina nel sangue;
• aumento del contenuto di mioglobina nei fluidi biologici;
• riduzione dell'attività degli enzimi mitocondriali nei miociti e nei fibroblasti.

Il valore diagnostico di questi indicatori è maggiore in presenza di un carico alimentare rispetto a quello a stomaco vuoto. Nella pratica, un test diagnostico si è dimostrato efficace: la determinazione del lattato nel sangue in presenza di un carico di glucosio, che consente di individuare con maggiore precisione l'insufficienza della catena respiratoria in seguito a un ulteriore carico di glucosio.

Per la diagnosi di laboratorio della disfunzione mitocondriale e delle sue specifiche forme nosologiche, i metodi biochimici convenzionali e di routine non sono sufficienti; è necessario condurre test specifici. Analizzare l'attività enzimatica nelle biopsie muscolari scheletriche è particolarmente utile rispetto ad altri tessuti. È possibile determinare l'attività degli enzimi della catena respiratoria, in particolare della citrato sintetasi, della succinato deidrogenasi e della citocromo C ossidasi.

Dati provenienti da studi genetici morfologici e molecolari

Gli studi morfologici sono di particolare importanza nella diagnosi di patologia mitocondriale. Data la loro elevata utilità informativa, spesso sono richiesti la biopsia del tessuto muscolare e l'esame istochimico delle biopsie ottenute. Informazioni importanti possono essere ottenute esaminando simultaneamente il materiale mediante microscopia ottica ed elettronica.

Uno dei marcatori più importanti delle malattie mitocondriali è il fenomeno delle fibre rosse "sfilacciate" [il fenomeno RRF (ragged red fibres)], scoperto nel 1963. È associato alla formazione di mitocondri anomali geneticamente alterati lungo il bordo della fibra muscolare a causa di proliferazione e accumulo focale. Questo fenomeno viene rilevato al microscopio ottico utilizzando una speciale colorazione di Gomori, ma negli ultimi anni sono stati utilizzati diversi marcatori mitocondriali e diversi metodi immunologici per questo scopo.

Altri segni morfologici della patologia mitocondriale includono:

• un forte aumento delle dimensioni dei mitocondri;
• accumulo di glicogeno, lipidi e conglomerati di calcio nel sottosarcolemma;
• riduzione dell'attività degli enzimi mitocondriali;
• distribuzione interrotta dei granuli di attività degli enzimi succinato deidrogenasi (SDH), NADH ossidoreduttasi, citocromo C ossidasi, ecc.

Nei pazienti affetti da malattie mitocondriali, la microscopia ottica del tessuto muscolare può rivelare segni morfologici aspecifici: necrosi locale delle fibre muscolari, accumulo di masse sarcoplasmatiche, presenza di lisi di aree sottosarcolemmali del sarcoplasma, basofilia del sarcoplasma, aumento del numero dei nuclei muscolari, attivazione dei processi di rigenerazione, ecc.

Lo studio del ruolo del fenomeno delle fibre rosse "stracciate" ha dimostrato la sua importanza per la diagnosi di condizioni come MELAS, MERRF, sindrome di Kearns-Sayre, oftalmoplegia cronica progressiva e altre associate a mutazioni del mtDNA. Questo fenomeno può manifestarsi in altre patologie: distrofia muscolare di Duchenne, dermatomiosite, distrofia miotonica, assunzione di farmaci (clofibrato) e altre condizioni patologiche. Pertanto, oltre alle malattie mitocondriali primarie, il fenomeno RRF può accompagnare disfunzioni mitocondriali secondarie.

Attualmente, l'esame istochimico e microscopico elettronico del tessuto muscolare per rilevare segni di insufficienza mitocondriale è diventato molto diffuso. In alcuni casi, questi esami sono utili nella diagnosi, soprattutto se il quadro morfologico del tessuto muscolare è normale, come dimostrato dai dati della microscopia ottica.

Segni microscopici elettronici: rilevamento di proliferazione mitocondriale, alterazione della loro forma e dimensione, disorganizzazione e ingrossamento delle creste, accumulo di mitocondri anomali sotto il sarcolemma, accumulo di lipidi e inclusioni paracristalline anomale (costituite principalmente da proteine) o osmofile localizzate tra le membrane interna ed esterna o all'interno delle creste, cluster sferici, spesso localizzati nella matrice (costituita principalmente da trigliceridi), ecc.

In alcuni pazienti si possono rilevare anomalie citochimiche nei leucociti.

Il complesso di studi biochimici e morfologici è integrato da moderni metodi di diagnostica molecolare (rilevamento di mutazioni nucleari o mitocondriali), eseguiti in laboratori specializzati nella diagnostica del DNA. Nelle malattie mitocondriali, vengono rilevati vari tipi di mutazioni: mutazioni puntiformi, delezioni, duplicazioni, anomalie quantitative del DNA, ecc.

In assenza di mutazioni nel mtDNA, se si sospetta una patologia mitocondriale, viene eseguito uno studio del DNA nucleare.

Criteri diagnostici

Esistono due gruppi di criteri diagnostici per le malattie mitocondriali. Criteri diagnostici principali (primo gruppo).

• Clinico:
  • diagnosi accertate: MERRF, MELAS, NARP, MNGIE, sindromi di Pearson, neuropatia di Leber, malattie di Leigh e di Alpers;
  • la presenza di 2 o di una combinazione dei seguenti segni:
    • lesione multisistemica, patognomonica per patologie della catena respiratoria;
    • decorso progressivo con episodi di esacerbazione o presenza di mutazioni mitocondriali nella famiglia;
    • esclusione di malattie metaboliche e di altro tipo mediante l'esecuzione di test appropriati.
• Istologico: rilevamento del fenomeno RRF in più del 2% del tessuto muscolare.
• Enzimatico:
  • fibre citocromo c ossidasi-negative;
  • riduzione dell'attività degli enzimi del complesso della catena respiratoria (<20% del normale nei tessuti, <30% nelle cellule o in diversi tessuti).
• Funzionale: diminuzione della sintesi di ATP nei fibroblasti di oltre 3 deviazioni standard.
• Genetica molecolare: mutazioni patogeneticamente significative del DNA nucleare o mtDNA.

Criteri diagnostici aggiuntivi (secondo gruppo).

• Clinici: sintomi aspecifici che si manifestano nelle malattie della catena respiratoria (morte fetale, ridotta attività motoria del feto, morte neonatale precoce, disturbi del movimento, disturbi dello sviluppo, compromissione del tono muscolare nel periodo neonatale).
• Istologico - piccola percentuale di fenomeno RRF, accumulo sottosarcolemmatico di mitocondri o loro anomalie.
• Enzimatico - bassa attività degli enzimi del complesso respiratorio (20-30% della norma nei tessuti, 30-40% nelle cellule o linee cellulari).
• Funzionale: diminuzione della sintesi di ATP nei fibroblasti di 2-3 deviazioni standard o assenza di crescita dei fibroblasti in un mezzo con galattosio.
• Genetica molecolare: rilevamento di mutazioni nel DNA nucleare o mtDNA con un presunto collegamento patogenetico.
• Metabolico: rilevamento di uno o più metaboliti che indicano un disturbo nella bioenergetica cellulare.

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