Cellule staminali e medicina plastica rigenerativa

Oggi, sono pochi i medici praticanti che ignorano lo sviluppo di una nuova direzione nel trattamento delle malattie più gravi, precedentemente incurabili dalla medicina tradizionale e alternativa. Stiamo parlando della medicina rigenerativo-plastica, basata sull'utilizzo del potenziale rigenerativo delle cellule staminali. Intorno a questa direzione in via di sviluppo si sono sviluppati un dibattito scientifico senza precedenti e un clamore pseudoscientifico, in gran parte creato grazie alle iperboli informative del World Wide Web. In brevissimo tempo, gli studi di laboratorio sulle capacità terapeutiche delle cellule staminali sono andati oltre la sperimentazione e hanno iniziato a essere attivamente introdotti nella medicina pratica, il che ha sollevato una serie di problemi di natura scientifica, etica, religiosa, legale e legislativa. Le istituzioni statali e pubbliche si sono chiaramente rivelate impreparate alla velocità del passaggio delle cellule staminali dalle piastre di Petri ai sistemi per la somministrazione endovenosa, che non è vantaggioso né per la società nel suo complesso né per la specifica persona sofferente. Non è facile comprendere l'inimmaginabile quantità di informazioni sulle potenzialità delle cellule staminali, sia in termini di quantità che di qualità, anche per gli specialisti (che non ce ne sono, perché ognuno cerca di padroneggiare da solo la nuova tendenza scientifica), per non parlare dei medici che non si occupano direttamente di medicina plastica rigenerativa.

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Perché sono necessari tali esperimenti, e sono davvero necessari?

A prima vista, la creazione di chimere cellulari interspecie è il frutto della fantasia sfrenata di uno scienziato fanatico che ha dimenticato la bioetica. Tuttavia, è proprio questo approccio ad aver ampliato significativamente le nostre conoscenze fondamentali sull'embriogenesi, poiché ha permesso di calcolare il numero di cellule necessarie per l'organogenesi (la formazione di fegato, cervello, pelle e organi del sistema immunitario). Inoltre (forse questo è l'aspetto principale nella biologia delle cellule staminali embrionali), i genetisti hanno a disposizione uno strumento unico, con l'aiuto del quale è possibile stabilire la funzione dei geni durante la chimerizzazione degli embrioni. Innanzitutto, viene utilizzata una speciale tecnica a doppio knockout per "spegnere" la coppia di geni studiata nelle cellule staminali embrionali. Successivamente, tali cellule staminali embrionali vengono introdotte in una blastocisti e vengono monitorati i cambiamenti che si verificano nel corpo dell'embrione chimerico in via di sviluppo. In questo modo, sono state stabilite le funzioni dei geni sf-1 (sviluppo della ghiandola surrenale e degli organi genitali), urt-l (sviluppo renale), muoD (sviluppo del muscolo scheletrico) e gata-l-4 (sviluppo dell'eritropoiesi e della linfopoiesi). Inoltre, geni umani non ancora studiati possono essere introdotti (trasfettati) nelle cellule staminali embrionali (ESC) di animali da laboratorio per determinarne la funzione utilizzando un embrione chimerico.

Tuttavia, di norma, giustificare un esperimento con l'acquisizione di nuove conoscenze fondamentali non trova il sostegno di un vasto pubblico. Facciamo un esempio del significato applicativo della chimerizzazione con le cellule staminali embrionali (ESC). Innanzitutto, si tratta dello xenotrapianto, ovvero il trapianto di organi animali nell'uomo. Teoricamente, la creazione di chimere cellulari uomo-suino permette di ottenere un animale con caratteristiche antigeniche molto più vicine al donatore di ESC, il che in diverse situazioni cliniche (diabete mellito, cirrosi epatica) può salvare la vita di una persona malata. È vero, per questo dobbiamo prima imparare a restituire la proprietà della totipotenza al genoma di una cellula somatica matura, per poi poterla introdurre in un embrione di maiale in via di sviluppo.

Oggi, la capacità delle cellule staminali embrionali (ESC) di dividersi quasi all'infinito in condizioni di coltura speciali viene sfruttata per produrre massa cellulare totipotente con successiva differenziazione in cellule specializzate, come i neuroni dopaminergici, che vengono poi trapiantate in un paziente affetto da morbo di Parkinson. In questo caso, il trapianto è necessariamente preceduto dalla differenziazione mirata della massa cellulare ottenuta in cellule specializzate necessarie per il trattamento e dalla purificazione di queste ultime dagli elementi cellulari indifferenziati.

Come si è poi scoperto, la minaccia della carcinogenesi era ben lungi dall'essere l'unico ostacolo al trapianto cellulare. Spontaneamente, le cellule staminali embrionali (ESC) nei corpi embrionali si differenziano in modo eterogeneo, ovvero formano derivati di un'ampia varietà di linee cellulari (neuroni, cheratinociti, fibroblasti, endoteliociti). In questo caso, nel campo visivo del microscopio, i cardiomiociti si distinguono tra le cellule di vari fenotipi, ognuno dei quali si contrae a un ritmo proprio. Tuttavia, per curare un paziente, è necessario disporre di popolazioni cellulari pure: neuroni in caso di ictus, cardiomiociti in caso di infarto del miocardio, cellule β del pancreas in caso di diabete mellito, cheratinociti in caso di ustioni, ecc.

La fase successiva nello sviluppo della trapiantologia cellulare è stata associata allo sviluppo di tecnologie per ottenere un numero sufficiente (milioni di cellule) di tali popolazioni cellulari pure. La ricerca dei fattori che causano il differenziamento diretto delle cellule staminali embrionali (ESC) è stata di natura empirica, poiché la sequenza della loro sintesi durante l'embriogenesi rimaneva sconosciuta. Inizialmente, si è stabilito che la formazione del sacco vitellino è indotta dall'aggiunta di cAMP e acido retinoico alla coltura di ESC. Linee cellulari emopoietiche sono state formate in presenza di 1L-3, SCF, fattore di crescita dei fibroblasti (FGH), fattore di crescita insulino-simile (IGF-1), 1L-6 e fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF) nel terreno di coltura. Le cellule del sistema nervoso sono state formate dalle ESC dopo la rimozione del LIF e dello strato di fibroblasti, che fungeva da nutrimento. Dopo il trattamento con acido retinoico in presenza di siero fetale, le cellule staminali embrionali (ESC) hanno iniziato a differenziarsi in neuroni e i cardiomiociti sono stati ottenuti aggiungendo dimetilsolfossido (DMSO), che fornisce un rilascio mirato di molecole di segnalazione idrofobiche al nucleo cellulare. In questo caso, l'accumulo di specie attive dell'ossigeno nel terreno di coltura, così come la stimolazione elettrica, hanno contribuito alla formazione di cardiomiociti contrattili maturi.

Sono stati investiti ingenti sforzi e risorse per trovare le condizioni per la differenziazione delle cellule staminali embrionali (ESC) in cellule pancreatiche produttrici di insulina. Tuttavia, è diventato presto chiaro che diverse linee cellulari specializzate (cellule β pancreatiche, cellule immunitarie ed endocrine, adipociti) non derivano dalle ESC quando stimolate secondo il principio "un fattore stimolante - una linea cellulare". Questo principio si è rivelato valido solo per un numero limitato di linee cellulari. In particolare, la formazione di neuroni può essere indotta dall'acido retinoico, dalle cellule muscolari dal fattore di crescita trasformante β (TCP-β), dalle linee eritroidi dall'1L-6, e dalle linee monocito-mieloidi dall'1L-3. Inoltre, gli effetti di questi fattori sulla differenziazione delle ESC si sono rivelati strettamente dose-dipendenti.

Iniziò la fase di ricerca di combinazioni di fattori di crescita che avrebbero fatto avanzare le cellule staminali embrionali (ESC) alle fasi successive dell'embriogenesi, con la formazione del mesoderma (fonte di cardiomiociti, muscoli scheletrici, epitelio dei tubuli renali, mieloeritropoiesi e cellule muscolari lisce), dell'ectoderma (epidermide, neuroni, retina) e dell'endoderma (epitelio dell'intestino tenue e delle ghiandole secretorie, pneumociti). La natura sembrava costringere i ricercatori a procedere lungo il percorso dell'embriogenesi, ripetendone le fasi in una capsula di Petri, senza dare la possibilità di ottenere immediatamente e facilmente il risultato desiderato. E tali combinazioni di fattori di crescita furono trovate. L'activina A in combinazione con TGF-β si rivelò un potente stimolatore della formazione di cellule mesodermiche dalle ESC, bloccando al contempo lo sviluppo dell'endoderma e dell'ectoderma. L'acido retinoico e una combinazione di segnali della proteina morfogenetica del midollo osseo (BMP-4) e del fattore di crescita epidermico (EGF) attivano la formazione di cellule ectodermiche e mesodermiche, bloccando lo sviluppo dell'endoderma. Si osserva una crescita cellulare intensiva di tutti e tre i foglietti germinativi, con l'effetto simultaneo di due fattori sulle cellule staminali embrionali (ESC): il fattore di crescita degli epatociti (HGF) e il fattore di crescita delle cellule nervose.

Pertanto, per ottenere le linee cellulari necessarie, è necessario innanzitutto trasferire le cellule staminali embrionali allo stadio di formazione delle cellule di un foglietto germinale, e quindi selezionare una nuova combinazione di fattori di crescita in grado di indurre la differenziazione mirata di ecto-, meso- ed endoderma in cellule specializzate necessarie per il trapianto nel paziente. Il numero di combinazioni di fattori di crescita oggi disponibili è di migliaia, la maggior parte delle quali è brevettata, alcune non sono affatto divulgate dalle aziende biotecnologiche.

Era giunto il momento di purificare le cellule ottenute dalle impurità cellulari indifferenziate. Le cellule differenziate in coltura sono state marcate con marcatori di linee cellulari mature e passate attraverso un selezionatore immunofenotipico laser ad alta velocità. Il raggio laser le ha individuate nel flusso cellulare generale e le ha indirizzate lungo un percorso separato. Gli animali da laboratorio sono stati i primi a ricevere il materiale cellulare purificato ottenuto. Era giunto il momento di valutare l'efficacia dell'utilizzo di derivati delle cellule staminali embrionali (ESC) su modelli di malattie e processi patologici. Uno di questi modelli era il morbo di Parkinson sperimentale, che è ben riprodotto negli animali utilizzando composti chimici che distruggono i neuroni dopaminergici. Poiché la malattia nell'uomo si basa su una carenza acquisita di neuroni dopaminergici, l'uso della terapia cellulare sostitutiva in questo caso era patogeneticamente giustificato. Negli animali con emiparkinsonismo sperimentale, circa la metà dei neuroni dopaminergici ottenuti dalle ESC e introdotti nelle strutture cerebrali ha attecchito. Ciò è stato sufficiente a ridurre significativamente le manifestazioni cliniche della malattia. I tentativi di ripristinare la funzionalità delle strutture del sistema nervoso centrale danneggiate in seguito a ictus sperimentali, lesioni e persino rotture del midollo spinale si sono rivelati molto efficaci.

Tuttavia, va notato che quasi tutti i casi di utilizzo efficace di derivati ESC differenziati per la correzione della patologia sperimentale sono stati intrapresi nella fase acuta della situazione patologica simulata. I risultati del trattamento a distanza non sono stati altrettanto confortanti: dopo 8-16 mesi, l'effetto positivo del trapianto cellulare è scomparso o è diminuito drasticamente. Le ragioni di ciò sono abbastanza chiare. La differenziazione delle cellule trapiantate in vitro o in loco morbi porta inevitabilmente all'espressione di marcatori cellulari di estraneità genetica, che provocano un attacco immunitario da parte dell'organismo del ricevente. Per risolvere il problema dell'incompatibilità immunologica, è stata utilizzata l'immunosoppressione tradizionale, parallelamente alla quale gli studi clinici hanno iniziato a realizzare il potenziale della transdifferenziazione e della correzione genetica di cellule staminali emopoietiche e mesenchimali autologhe, che non causano un conflitto immunitario.

Che cosa è la medicina plastica rigenerativa?

L'evoluzione ha determinato due opzioni principali per la fine della vita di una cellula: la necrosi e l'apoptosi, che a livello tissutale corrispondono ai processi di proliferazione e rigenerazione. La proliferazione può essere considerata una sorta di sacrificio, quando il riempimento del difetto del tessuto danneggiato avviene grazie alla sua sostituzione con elementi del tessuto connettivo: pur mantenendo l'integrità strutturale, l'organismo perde parzialmente la funzione dell'organo interessato, il che determina il successivo sviluppo di reazioni compensatorie con ipertrofia o iperplasia degli elementi strutturali e funzionali rimasti intatti. La durata del periodo di compensazione dipende dal volume delle lesioni strutturali causate dai fattori di alterazione primaria e secondaria, dopodiché, nella stragrande maggioranza dei casi, si verifica uno scompenso, un brusco deterioramento della qualità e una riduzione della durata della vita umana. La rigenerazione fisiologica assicura i processi di rimodellamento, ovvero la sostituzione delle cellule invecchiate e morenti attraverso i meccanismi di morte cellulare naturale (apoptosi) con nuove cellule provenienti dalle riserve di cellule staminali del corpo umano. I processi di rigenerazione riparativa coinvolgono anche le risorse cellulari degli spazi staminali, che però vengono mobilitate in condizioni patologiche legate a malattie o danni tissutali, innescando la morte cellulare attraverso meccanismi di necrosi.

L'attenzione di scienziati, medici, stampa, televisione e pubblico al problema dello studio della biologia delle cellule staminali embrionali (ESC) è dovuta, innanzitutto, all'elevato potenziale della terapia cellulare o, come la chiamiamo, plastica-rigenerativa. Lo sviluppo di metodi per il trattamento delle patologie umane più gravi (patologie degenerative del sistema nervoso centrale, lesioni del midollo spinale e del cervello, morbo di Alzheimer e di Parkinson, sclerosi multipla, infarto del miocardio, ipertensione arteriosa, diabete mellito, malattie autoimmuni e leucemia, ustioni e processi neoplastici costituiscono un elenco tutt'altro che completo) si basa sulle proprietà uniche delle cellule staminali, che consentono la creazione di nuovi tessuti per sostituire, come si credeva in precedenza, aree tissutali irreversibilmente danneggiate di un organismo malato.

I progressi della ricerca teorica sulla biologia delle cellule staminali negli ultimi 10 anni sono stati realizzati grazie all'emergere spontaneo di aree della medicina plastica rigenerativa, la cui metodologia non solo è facilmente sistematizzabile, ma la richiede. Il primo e più rapido ambito di applicazione pratica del potenziale rigenerativo delle cellule staminali è diventato la terapia plastica rigenerativa sostitutiva. Il suo percorso è facilmente tracciabile nella letteratura scientifica: dagli esperimenti su animali con necrosi miocardica ai lavori degli ultimi anni volti a ripristinare la carenza post-infarto dei cardiomiociti o a reintegrare la perdita di cellule β del pancreas e di neuroni dopaminergici del sistema nervoso centrale.

Trapianto di cellule

La base della medicina rigenerativo-plastica sostitutiva è il trapianto cellulare. Quest'ultimo dovrebbe essere definito come un complesso di misure mediche, durante le quali il corpo del paziente è a diretto contatto con cellule vitali di origine auto-, allo-, iso- o xenogenica per un periodo di tempo breve o lungo. Il mezzo di trapianto cellulare è una sospensione di cellule staminali o loro derivati, standardizzata in base al numero di unità di trapianto. Un'unità di trapianto è il rapporto tra il numero di unità formanti colonie in coltura e il numero totale di cellule trapiantate. Metodi di trapianto cellulare: somministrazione endovenosa, intraperitoneale, sottocutanea di una sospensione di cellule staminali o loro derivati; somministrazione di una sospensione di cellule staminali o loro derivati nei ventricoli cerebrali, nei vasi linfatici o nel liquido cerebrospinale.

Il trapianto di cellule allologhe e autologhe impiega due approcci metodologici fondamentalmente diversi per l'implementazione del potenziale pluripotente, multipotente o polipotente delle cellule staminali, in vivo o in vitro. Nel primo caso, l'introduzione delle cellule staminali nell'organismo del paziente avviene senza la loro differenziazione preliminare, nel secondo, dopo la riproduzione in coltura, la differenziazione mirata e la purificazione dagli elementi indifferenziati. Tra le numerose tecniche metodologiche della terapia cellulare sostitutiva, si distinguono chiaramente tre gruppi di metodi: la sostituzione di midollo osseo e cellule del sangue, la sostituzione di cellule di organi e tessuti molli, la sostituzione di elementi rigidi e solidi del corpo (cartilagine, ossa, tendini, valvole cardiache e vasi capacitivi). Quest'ultima direzione dovrebbe essere definita medicina ricostruttiva e rigenerativa, poiché il potenziale di differenziazione delle cellule staminali viene realizzato su una matrice, una struttura biologicamente inerte o assorbibile, la cui forma ricorda quella della parte del corpo da sostituire.

Un altro modo per aumentare l'intensità dei processi rigenerativo-plastici nei tessuti danneggiati è quello di mobilizzare le risorse staminali del paziente stesso utilizzando fattori di crescita esogeni, come i fattori stimolanti le colonie di granulociti e granulociti-macrofagi. In questo caso, la rottura delle connessioni stromali porta a un aumento del rilascio di cellule staminali emopoietiche nel flusso sanguigno generale, che nell'area del danno tissutale promuovono i processi di rigenerazione grazie alla loro intrinseca plasticità.

I metodi della medicina rigenerativa mirano quindi a stimolare i processi di ripristino delle funzioni perdute, sia attraverso la mobilitazione delle riserve staminali del paziente stesso, sia introducendo materiale cellulare allogenico.

Un importante risultato pratico della scoperta delle cellule staminali embrionali è la clonazione terapeutica basata sulla comprensione dei meccanismi che innescano l'embriogenesi. Se il segnale iniziale per l'inizio dell'embriogenesi è il complesso pre-mRNA situato nel citoplasma dell'ovocita, allora l'introduzione del nucleo di una qualsiasi cellula somatica nell'ovulo enucleato dovrebbe innescare il programma di sviluppo embrionale. Oggi sappiamo già che circa 15.000 geni partecipano all'attuazione del programma di embriogenesi. Cosa succede loro in seguito, dopo la nascita, durante le fasi di crescita, maturità e invecchiamento? La risposta a questa domanda è stata data dalla pecora Dolly: vengono preservati. Utilizzando i più moderni metodi di ricerca, è stato dimostrato che i nuclei delle cellule adulte conservano tutti i codici necessari per la formazione delle cellule staminali embrionali, dei foglietti germinativi, dell'organogenesi e della maturazione di restrizione (uscita verso la differenziazione e la specializzazione) di linee cellulari di origine mesenchimale, ecto-, endo- e mesodermica. La clonazione terapeutica come direzione si è formata già nelle prime fasi dello sviluppo della trapiantologia cellulare e prevede il ripristino della totipotenza delle cellule somatiche del paziente per ottenere materiale da trapianto geneticamente identico.

La scoperta delle cellule staminali è iniziata "dalla fine", poiché il termine introdotto in biologia e medicina da A. Maksimov si riferiva alle cellule staminali del midollo osseo, che danno origine a tutti gli elementi cellulari maturi del sangue periferico. Tuttavia, anche le cellule staminali emopoietiche, come le cellule di tutti i tessuti di un organismo adulto, hanno un loro predecessore meno differenziato. La fonte comune di tutte le cellule somatiche è la cellula staminale embrionale. È opportuno notare che i concetti di "cellule staminali embrionali" e "cellule staminali embrionali" non sono affatto identici. Le cellule staminali embrionali furono isolate da J. Thomson dalla massa cellulare interna della blastocisti e trasferite in linee cellulari a lunga vita. Solo queste cellule possiedono un facsimile di "ESC". Leroy Stevens, che scoprì le cellule staminali embrionali in esperimenti sui topi, le chiamò "cellule staminali embrionali pluripotenti", riferendosi alla capacità delle ESC di differenziarsi in derivati di tutti e tre i foglietti germinativi (ecto-, meso- ed endoderma). Tuttavia, tutte le cellule dell'embrione nelle fasi successive dello sviluppo sono anche cellule staminali, poiché danno origine a un numero enorme di cellule che formano il corpo di un adulto. Per definirle, proponiamo il termine "cellule progenitrici pluripotenti embrionali".

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Tipi di cellule staminali

La moderna classificazione delle cellule staminali si basa sul principio della loro divisione in base alla loro capacità (potenza) di dare origine a linee cellulari, definita come toti-, pluri-, multi-, poli-, bi- e unipotenza. La totipotenza, ovvero la capacità di ricreare un organismo geneticamente programmato nella sua interezza, è posseduta dalle cellule zigotiche, dai blastomeri e dalle cellule staminali embrionali (cellule della massa interna della blastocisti). Un altro gruppo di cellule totipotenti, che si formano in fasi successive dello sviluppo embrionale, è rappresentato dalle cellule germinali primarie della zona genitale embrionale (tubercoli genitali). La pluripotenza, ovvero la capacità di differenziarsi in cellule di qualsiasi organo o tessuto, è insita nelle cellule embrionali dei tre foglietti germinativi: ecto-, meso- ed endoderma. Si ritiene che la multipotenza, ovvero la capacità di formare qualsiasi cellula all'interno di una linea specializzata, sia caratteristica di soli due tipi di cellule: le cosiddette cellule staminali mesenchimali, che si formano nella cresta neurale e sono i precursori di tutte le cellule della base del tessuto connettivo dell'organismo, comprese le cellule della neuroglia, nonché le cellule staminali ematopoietiche, che danno origine a tutte le linee cellulari del sangue. Inoltre, si distinguono cellule staminali bipotenti e unipotenti, in particolare le cellule precursori delle cellule staminali mieloidi, linfoidi, monocitiche e megacariocitiche. L'esistenza di cellule staminali unipotenti è stata chiaramente dimostrata utilizzando l'esempio delle cellule epatiche: la perdita di una parte significativa del tessuto epatico viene compensata dall'intensa divisione di epatociti poliploidi differenziati.

Durante lo sviluppo, tutti gli organi e i tessuti si formano a seguito della proliferazione e della differenziazione della massa cellulare interna della blastocisti, le cui cellule sono, in senso stretto, cellule staminali embrionali totipotenti. Il primo lavoro sull'isolamento delle cellule staminali embrionali fu condotto da Evans, il quale dimostrò che le blastocisti impiantate nel cervello dei topi danno origine a teratocarcinomi, le cui cellule, una volta clonate, formano linee di cellule staminali embrionali pluripotenti (il nome originale di queste cellule - cellule di carcinoma embrionale o, in abbreviazione, ECС - non è attualmente utilizzato). Questi dati sono stati confermati da numerosi altri studi in cui le cellule staminali embrionali sono state ottenute coltivando cellule di blastocisti di topi e altre specie animali, nonché di esseri umani.

Negli ultimi anni, la letteratura ha riportato sempre più spesso la plasticità delle cellule staminali, intesa non solo come la capacità di queste ultime di differenziarsi in diversi tipi cellulari in diverse fasi dello sviluppo, ma anche di subire dedifferenziazione (transdifferenziazione, retrodifferenziazione). Si ammette cioè la possibilità fondamentale di riportare una cellula somatica differenziata allo stadio di sviluppo embrionale con ricapitolazione (ritorno) della pluripotenza e la sua implementazione in ripetuti differenziamenti con la formazione di cellule di tipo diverso. In particolare, si segnala che le cellule staminali emopoietiche sono capaci di transdifferenziazione con la formazione di epatociti, cardiomioblasti ed endoteliociti.

Continuano i dibattiti scientifici sulla divisione delle cellule staminali in base alla loro plasticità, ovvero si stanno formando la terminologia e il glossario del trapianto cellulare, il che ha un significato pratico diretto, poiché la maggior parte dei metodi di medicina plastica rigenerativa si basa sullo sfruttamento delle proprietà plastiche e sulla capacità delle cellule staminali di differenziarsi in diverse linee cellulari.

Il numero di pubblicazioni nel campo dei problemi fondamentali e applicati della medicina plastica rigenerativa è in rapido aumento. È già stata delineata una gamma di diversi approcci metodologici volti all'utilizzo ottimale del potenziale plastico rigenerativo delle cellule staminali. Cardiologi ed endocrinologi, neurologi e neurochirurghi, trapiantologi ed ematologi hanno identificato le loro aree di interesse urgente. Oculisti, tisologi, pneumologi, nefrologi, oncologi, genetisti, pediatri, gastroenterologi, terapisti e pediatri, chirurghi e ostetrici-ginecologi sono alla ricerca di una soluzione ai problemi urgenti relativi alle capacità plastiche delle cellule staminali: tutti i rappresentanti della medicina moderna sperano di avere l'opportunità di curare malattie precedentemente considerate fatali.

Il trapianto di cellule sarà la prossima “panacea”?

Questa domanda si pone giustamente in tutti i medici e gli scienziati attenti che analizzano lo stato attuale della scienza medica. La situazione è complicata dal fatto che da una parte del campo di confronto scientifico si trovano "sani conservatori", dall'altra "malati fanatici" della trapiantologia cellulare. Ovviamente, la verità, come sempre, è tra di loro, nella "terra di nessuno". Senza toccare questioni di diritto, etica, religione e moralità, consideriamo i pro e i contro delle aree designate della medicina plastica rigenerativa. La "brezza leggera" dei primi rapporti scientifici sulle possibilità terapeutiche delle cellule staminali embrionali (ESC) si è trasformata in un "vento tempestoso" un anno dopo la loro scoperta, che si è trasformato in un "tornado informativo" nel 2003. La prima serie di pubblicazioni ha riguardato le questioni della coltura di cellule staminali embrionali, della loro riproduzione e della differenziazione guidata in vitro.

Si è scoperto che per una riproduzione illimitata di cellule staminali embrionali in coltura è necessario osservare rigorosamente una serie di condizioni. Tre fattori devono essere presenti nel terreno condizionato: interleuchina-6 (IL-6), fattore delle cellule staminali (SCF) e fattore inibitore della leucasi (LIF). Inoltre, le cellule staminali embrionali devono essere coltivate su un substrato (strato di cellule nutrici) di fibroblasti embrionali e in presenza di siero fetale di vitello. Se queste condizioni sono soddisfatte, le cellule staminali embrionali (ESC) in coltura crescono come cloni e formano corpi embrionali, aggregati di cloni in sospensione di cellule sferiche. La caratteristica più importante del clone ESC è che in coltura il corpo embrionale smette di crescere quando nell'aggregato si accumulano 50-60, massimo 100 cellule. Durante questo periodo, si verifica uno stato di equilibrio: il tasso di divisione cellulare all'interno del clone è uguale al tasso di apoptosi (morte cellulare programmata) alla sua periferia. Dopo aver raggiunto tale equilibrio dinamico, le cellule periferiche del corpo embrionale vanno incontro a differenziazione spontanea (solitamente con la formazione di frammenti endodermici del sacco vitellino, angioblasti ed endoteliociti) con perdita di totipotenza. Pertanto, per ottenere una quantità sufficiente di massa cellulare totipotente, il corpo embrionale deve essere disaggregato settimanalmente con il trapianto di singole cellule staminali embrionali in un nuovo terreno nutritivo, un processo piuttosto laborioso.

La scoperta delle cellule staminali embrionali non ha risposto alla domanda su cosa esattamente e come inneschi i programmi embriogenetici criptati nel DNA dello zigote. Non è ancora chiaro come si svolga il programma genomico durante la vita umana. Allo stesso tempo, lo studio delle cellule staminali embrionali ha permesso di sviluppare un concetto sui meccanismi che mantengono la toti-, pluri- e multipotenza delle cellule staminali durante la loro divisione. La principale caratteristica distintiva di una cellula staminale è la sua capacità di autoriprodursi. Ciò significa che una cellula staminale, a differenza di una cellula differenziata, si divide in modo asimmetrico: una delle cellule figlie dà origine a una linea cellulare specializzata e la seconda mantiene la toti-, pluri- o multipotenza del genoma. Non è ancora chiaro perché e come questo processo avvenga nelle fasi iniziali dell'embriogenesi, quando la massa cellulare interna in divisione della blastocisti è interamente totipotente e il genoma delle ESC è in uno stato dormiente (dormiente, inibito). Se durante la divisione di una cellula normale il processo di duplicazione è necessariamente preceduto dall'attivazione e dall'espressione di un intero complesso di geni, allora durante la divisione delle cellule staminali embrionali (ESC) questo non avviene. La risposta alla domanda "perché" è stata ottenuta dopo la scoperta di mRNA preesistente (pre-mRNA) nelle ESC, alcuni dei quali si formano nelle cellule follicolari e sono immagazzinati nel citoplasma dell'ovulo e dello zigote. La seconda scoperta ha risposto alla domanda "come": nelle ESC sono stati trovati enzimi speciali chiamati "editasi". Le editasi svolgono tre importanti funzioni. In primo luogo, forniscono una lettura epigenetica alternativa (senza la partecipazione del genoma) e la duplicazione del pre-mRNA. In secondo luogo, implementano il processo di attivazione del pre-mRNA (splicing - eliminazione degli introni, ovvero delle sezioni inattive di RNA che inibiscono il processo di sintesi proteica sull'mRNA), dopodiché inizia l'assemblaggio delle molecole proteiche nella cellula. In terzo luogo, le editasi promuovono la formazione di mRNA secondari, che sono repressori dei meccanismi di espressione genica, mantenendo la densità della cromatina e lo stato inattivo dei geni. Prodotti proteici sintetizzati su questi mRNA secondari, chiamati proteine silenziatrici o guardiani del genoma, sono presenti nelle cellule uovo umane.

Ecco come viene presentato oggi il meccanismo di formazione delle linee cellulari immortali di cellule staminali embrionali. In parole povere, il segnale per avviare il programma di embriogenesi, le cui fasi iniziali consistono nella formazione di una massa cellulare totipotente, proviene dal citoplasma dell'ovulo. Se in questa fase la massa cellulare interna della blastocisti, ovvero le cellule staminali embrionali (ESC), viene isolata da ulteriori segnali regolatori, il processo di autoriproduzione cellulare avviene in un ciclo chiuso senza la partecipazione dei geni del nucleo cellulare (epigeneticamente). Se tale cellula viene fornita di materiale nutritivo e isolata dai segnali esterni che promuovono la differenziazione della massa cellulare, si dividerà e riprodurrà la propria specie all'infinito.

I primi risultati dei tentativi sperimentali di utilizzare cellule staminali totipotenti per il trapianto furono piuttosto impressionanti: l'introduzione di cellule staminali embrionali nei tessuti di topi con un sistema immunitario indebolito da immunosoppressori portò allo sviluppo di tumori nel 100% dei casi. Tra le cellule della neoplasia, la cui fonte erano le cellule staminali embrionali (ESC), erano presenti derivati differenziati del materiale cellulare esogeno totipotente, in particolare neuroni, ma la crescita di teratocarcinomi ridusse a zero il valore dei risultati ottenuti. Allo stesso tempo, nei lavori di L. Stevens, le ESC introdotte nella cavità addominale formavano grandi aggregati in cui si formavano frammentariamente muscoli embrionali, cuore, capelli, pelle, ossa, muscoli e tessuto nervoso. (I chirurghi che hanno aperto cisti dermoidi dovrebbero avere familiarità con questo quadro). È interessante notare che le cellule embrioblastiche di topo sospese si comportano esattamente allo stesso modo: la loro introduzione nei tessuti di animali adulti immunocompromessi causa sempre la formazione di teratocarcinomi. Ma se da un tumore di questo tipo si isola una linea pura di cellule staminali embrionali (ESC) e la si introduce nella cavità addominale, si formano ancora una volta derivati somatici specializzati di tutti e tre i foglietti germinali, senza segni di carcinogenesi.

Pertanto, il problema successivo da risolvere era la purificazione del materiale cellulare dalle impurità delle cellule indifferenziate. Tuttavia, anche con un'altissima efficienza di differenziazione cellulare mirata, fino al 20% delle cellule in coltura conserva il proprio potenziale totipotente, che in vivo, purtroppo, si concretizza nella crescita tumorale. Un'altra "fionda" della natura: sulla scala del rischio medico, la garanzia di guarigione del paziente si bilancia con la garanzia della sua morte.

La relazione tra cellule tumorali e cellule progenitrici embrionali pluripotenti (EPPC), il cui sviluppo è più avanzato rispetto alle ESC, è piuttosto ambigua. I risultati dei nostri studi hanno dimostrato che l'introduzione di EPPC in vari tumori trapiantabili nei ratti può portare alla disintegrazione del tessuto tumorale (G), a un rapido aumento della massa tumorale (D), alla sua riduzione (E-3), oppure non influenzare le dimensioni della necrosi focale centrale spontanea del tessuto neoplastico (I, K). È ovvio che il risultato dell'interazione tra EPPC e cellule tumorali è determinato dal set totale di citochine e fattori di crescita da esse prodotti in vivo.

È degno di nota che le cellule staminali embrionali, rispondendo con carcinogenesi al contatto con i tessuti adulti, siano perfettamente assimilate alla massa cellulare dell'embrione, integrandosi in tutti gli organi dell'embrione. Tali chimere, costituite dalle cellule staminali embrionali stesse e dalle cellule staminali embrionali del donatore, sono chiamate animali allofeni, sebbene, in realtà, non siano chimere fenotipiche. Il sistema emopoietico, la cute, il tessuto nervoso, il fegato e l'intestino tenue subiscono la massima chimerizzazione cellulare quando le cellule staminali embrionali vengono introdotte in un embrione precoce. Sono stati descritti casi di chimerizzazione dei genitali. L'unica zona inviolabile per le cellule staminali embrionali sono le cellule germinali primarie.

Ciò significa che l'embrione conserva le informazioni genetiche dei suoi genitori, il che protegge la purezza e la continuazione sia del genere che della specie.

In condizioni di blocco della divisione cellulare dell'embrione precoce mediante citoclazina, l'introduzione di cellule staminali embrionali nella blastocisti porta allo sviluppo di un embrione le cui cellule germinali primarie, come tutte le altre, sono state formate da cellule staminali embrionali di un donatore. Ma in questo caso, l'embrione stesso è completamente donatore, geneticamente estraneo al corpo della madre surrogata. I meccanismi di un tale blocco naturale del potenziale di mescolanza di informazioni ereditarie proprie ed estranee non sono ancora stati chiariti. Si può presumere che in questo caso si realizzi il programma di apoptosi, i cui determinanti ci sono ancora sconosciuti.

È importante notare che l'embriogenesi di animali di specie diverse non è mai coordinata: quando si attua il programma di organogenesi del donatore nel corpo dell'embrione ricevente di cellule staminali embrionali xenogeniche, l'embrione muore in utero e viene riassorbito. Pertanto, l'esistenza di chimere "ratto-topo", "maiale-mucca", "uomo-ratto" dovrebbe essere intesa come mosaicismo cellulare, ma non morfologico. In altre parole, quando le cellule staminali embrionali (ESC) di una specie di mammifero vengono introdotte nella blastocisti di un'altra specie, si sviluppa sempre una prole della specie materna, nella quale, tra le cellule proprie di quasi tutti gli organi, si trovano inclusioni e talvolta gruppi di unità strutturali e funzionali costituite da materiale geneticamente estraneo derivato dalle cellule staminali embrionali (ESC). Il termine "maiale umanizzato" non può essere inteso come la designazione di una sorta di mostro dotato di intelligenza o caratteristiche esteriori di un essere umano. Si tratta semplicemente di un animale, le cui cellule corporee provengono in parte da cellule staminali embrionali umane introdotte nella blastocisti di un maiale.

Prospettive per l'uso delle cellule staminali

È noto da tempo che le malattie associate alla genopatologia delle cellule emopoietiche e linfoidi vengono spesso eliminate dopo il trapianto allogenico di midollo osseo. La sostituzione del proprio tessuto emopoietico con cellule geneticamente normali provenienti da un donatore correlato porta alla guarigione parziale e talvolta completa del paziente. Tra le malattie genetiche trattate con il trapianto allogenico di midollo osseo, vale la pena menzionare la sindrome da immunodeficienza combinata, l'agammaglobulinemia legata al cromosoma X, la granulomatosi cronica, la sindrome di Wiskott-Aldrich, le malattie di Gaucher e di Hurler, l'adrenoleucodistrofia, la leucodistrofia metacromatica, l'anemia falciforme, la talassemia, l'anemia di Fanconi e l'AIDS. Il problema principale nell'uso del trapianto allogenico di midollo osseo nel trattamento di queste malattie è legato alla selezione di un donatore consanguineo HbA-compatibile, per la cui ricerca con successo sono necessari in media 100.000 campioni di tessuto emopoietico del donatore tipizzato.

La terapia genica consente di correggere un difetto genetico direttamente nelle cellule staminali emopoietiche del paziente. Teoricamente, la terapia genica offre gli stessi vantaggi del trapianto allogenico di midollo osseo nel trattamento delle malattie genetiche del sistema emopoietico, ma senza tutte le possibili complicazioni immunologiche. Tuttavia, ciò richiede una tecnica che consenta l'efficace trasferimento di un gene completo nelle cellule staminali emopoietiche e il mantenimento del livello richiesto di espressione, che in alcuni tipi di patologie ereditarie potrebbe non essere molto elevato. In questo caso, anche un leggero reintegro del prodotto proteico del gene carente produce un effetto clinico positivo. In particolare, nell'emofilia B, il 10-20% del livello normale di fattore IX è più che sufficiente per ripristinare il meccanismo interno di coagulazione del sangue. La modificazione genetica di materiale cellulare autologo si è dimostrata efficace nell'emiparkinsonismo sperimentale (distruzione unilaterale di neuroni dopaminergici). La trasfezione di fibroblasti embrionali di ratto con un vettore retrovirale contenente il gene della tirosina idrossilasi ha assicurato la sintesi di dopamina nel sistema nervoso centrale: la somministrazione intracerebrale di fibroblasti trasfettati ha ridotto drasticamente l'intensità delle manifestazioni cliniche di un modello sperimentale del morbo di Parkinson negli animali da esperimento.

La prospettiva di utilizzare le cellule staminali per la terapia genica di patologie umane ha posto numerose nuove sfide a medici e sperimentatori. Gli aspetti problematici della terapia genica sono associati allo sviluppo di un sistema sicuro ed efficace per il trasporto genico nella cellula bersaglio. Attualmente, l'efficienza del trasferimento genico in grandi cellule di mammifero è molto bassa (1%). Metodicamente, questo problema viene risolto in vari modi. Il trasferimento genico in vitro prevede la trasfezione di materiale genetico nelle cellule del paziente in coltura, con il successivo reinserimento nell'organismo del paziente. Questo approccio dovrebbe essere riconosciuto come ottimale quando si utilizzano geni introdotti in cellule staminali del midollo osseo, poiché i metodi per il trasferimento di cellule emopoietiche dall'organismo alla coltura e viceversa sono ben consolidati. I retrovirus sono più spesso utilizzati per il trasferimento genico in cellule emopoietiche in vitro. Tuttavia, la maggior parte delle cellule staminali emopoietiche si trova in uno stato dormiente, il che complica il trasporto di informazioni genetiche mediante retrovirus e richiede la ricerca di nuovi metodi per un trasporto genico efficace nelle cellule staminali dormienti. Attualmente, vengono utilizzati metodi di trasferimento genico come la trasfezione, la microiniezione diretta di DNA nelle cellule, la lipofezione, l'elettroporazione, la "pistola genica", l'accoppiamento meccanico con biglie di vetro, la trasfezione di epatociti con accoppiamento recettore-dipendente del DNA all'asialoglicoproteina e l'introduzione aerosol del transgene nelle cellule dell'epitelio alveolare dei polmoni. L'efficienza del trasferimento di DNA con questi metodi è del 10,0-0,01%. In altre parole, a seconda del metodo di introduzione delle informazioni genetiche, ci si può aspettare un successo in 10 pazienti su 100 o in 1 paziente su 10.000. È ovvio che un metodo efficace e al tempo stesso sicuro per il trasferimento di geni terapeutici deve ancora essere sviluppato.

Una soluzione fondamentalmente diversa al problema del rigetto di materiale cellulare allogenico in trapiantologia cellulare è l'uso di alte dosi di cellule progenitrici embrionali pluripotenti per ottenere l'effetto di reinstallazione del sistema di controllo dell'omeostasi antigenica di un organismo adulto (effetto Kukharchuk-Radchenko-Sirman), la cui essenza risiede nell'induzione della tolleranza immunologica attraverso la creazione di una nuova base di cellule immunocompetenti con simultanea riprogrammazione del sistema di controllo dell'omeostasi antigenica. Dopo l'introduzione di alte dosi di EPPC, queste ultime si fissano nei tessuti del timo e del midollo osseo. Nel timo, le EPPC, sotto l'influenza di uno specifico microambiente, si differenziano in cellule dendritiche, interdigitate ed elementi epitelio-stromali. Durante la differenziazione delle EPPC nel timo del ricevente, insieme alle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) del ricevente, vengono espresse anche le molecole MHC geneticamente determinate nelle cellule del donatore, vale a dire che viene stabilito un doppio standard di molecole MHC, in base al quale si realizza una selezione positiva e negativa dei linfociti T.

Pertanto, il rinnovamento del legame effettore del sistema immunitario del ricevente avviene attraverso i noti meccanismi di selezione positiva e negativa dei linfociti T, ma attraverso il doppio standard delle molecole MHC: le EPPC del ricevente e del donatore.

La riprogrammazione del sistema immunitario mediante EPPC non solo consente il trapianto cellulare senza il successivo utilizzo a lungo termine di immunosoppressori, ma apre anche prospettive completamente nuove nel trattamento delle malattie autoimmuni e fornisce un punto di partenza per lo sviluppo di nuove idee sul processo di invecchiamento umano. Per comprendere i meccanismi dell'invecchiamento, abbiamo proposto una teoria dell'esaurimento degli spazi staminali del corpo. Secondo l'affermazione principale di questa teoria, l'invecchiamento è una riduzione permanente delle dimensioni degli spazi staminali del corpo, intesi come un pool di cellule staminali regionali ("adulte") (cellule staminali mesenchimali, neuronali, emopoietiche, cellule progenitrici della pelle, del tratto digerente, dell'epitelio endocrino, cellule pigmentate delle pieghe ciliari, ecc.), che reintegrano le perdite cellulari del tessuto corrispondente nel processo di rimodellamento corporeo. Il rimodellamento corporeo è il rinnovamento della composizione cellulare di tutti i tessuti e organi ad opera delle cellule staminali, che continua per tutta la vita di un organismo multicellulare. Il numero di cellule negli spazi staminali è determinato geneticamente, il che determina la dimensione limitata (potenziale proliferativo) di ciascun spazio staminale. A sua volta, la dimensione degli spazi staminali determina il tasso di invecchiamento di singoli organi, tessuti e sistemi corporei. Dopo l'esaurimento delle riserve cellulari degli spazi staminali, l'intensità e il tasso di invecchiamento di un organismo multicellulare sono determinati dai meccanismi di invecchiamento delle cellule somatiche differenziate entro il limite di Hayflick.

Pertanto, nella fase di ontogenesi postnatale, l'espansione degli spazi staminali può non solo aumentare significativamente la durata della vita, ma anche migliorarne la qualità ripristinando il potenziale di rimodellamento corporeo. L'espansione degli spazi staminali può essere ottenuta introducendo elevate dosi di cellule progenitrici embrionali pluripotenti allogeniche, a condizione che il sistema immunitario del ricevente venga simultaneamente riprogrammato, il che aumenta significativamente la durata della vita dei topi anziani coinvolti nell'esperimento.

La teoria della deplezione dello spazio staminale può cambiare le idee esistenti non solo sui meccanismi dell'invecchiamento, ma anche sulla malattia stessa, nonché sulle conseguenze del suo trattamento farmacologico. In particolare, la malattia può svilupparsi a seguito di una patologia delle cellule staminali dello spazio staminale (oncopatologia). La deplezione della riserva di cellule staminali mesenchimali interrompe i processi di rimodellamento del tessuto connettivo, portando alla comparsa di segni esterni dell'invecchiamento (rughe, rilassamento cutaneo, cellulite). La deplezione della riserva di cellule staminali endoteliali causa lo sviluppo di ipertensione arteriosa e aterosclerosi. Le dimensioni inizialmente ridotte dello spazio staminale del timo determinano la sua precoce involuzione permanente legata all'età. L'invecchiamento precoce è una conseguenza della riduzione patologica iniziale delle dimensioni di tutti gli spazi staminale del corpo. La stimolazione farmacologica e non farmacologica delle riserve di cellule staminali migliora la qualità della vita riducendone la durata, poiché riduce le dimensioni degli spazi staminale. La scarsa efficacia dei moderni geroprotettori è dovuta al loro effetto protettivo sulle cellule somatiche differenziate invecchiate e non sugli spazi staminali del corpo.

In conclusione, vorremmo sottolineare ancora una volta che la medicina rigenerativo-plastica rappresenta una nuova direzione nel trattamento delle patologie umane, basata sull'utilizzo del potenziale rigenerativo-plastico delle cellule staminali. In questo caso, per plasticità si intende la capacità delle cellule staminali, esogene o endogene, di impiantarsi e dare origine a nuovi germogli cellulari specializzati in aree tissutali danneggiate di un organismo malato. L'oggetto della medicina rigenerativo-plastica sono le malattie umane fatali attualmente incurabili, le patologie ereditarie, le malattie in cui i metodi della medicina tradizionale ottengono solo un effetto sintomatico, nonché i difetti anatomici del corpo, il cui ripristino è l'obiettivo della chirurgia rigenerativo-plastica. A nostro avviso, è prematuro considerare i primi tentativi di ricreare organi interi e funzionalmente completi a partire dalle cellule staminali come un'area separata della medicina pratica. L'oggetto della medicina rigenerativo-plastica sono le cellule staminali, che, a seconda della fonte da cui provengono, presentano un diverso potenziale rigenerativo-plastico. La metodologia della medicina plastica rigenerativa si basa sul trapianto di cellule staminali o dei loro derivati.