Cellule staminali embrionali

La scoperta delle cellule staminali embrionali non è avvenuta per caso, ma è avvenuta sul terreno preparato della ricerca scientifica nel campo della biologia dello sviluppo. Il termine "cellula staminale" fu introdotto in medicina nel 1908 al congresso della società ematologica di Berlino da Aleksandr Maximov in relazione alle cellule ematopoietiche. Molto prima dell'isolamento e della produzione di linee stabili di cellule staminali embrionali pluripotenti, le cellule staminali terato-(embriocarcinoma) venivano utilizzate negli studi sui processi di sviluppo precoce, con l'aiuto delle quali venivano studiati meccanismi sconosciuti dell'embriogenesi, tra cui la sequenza di espressione dei geni precoci e i prodotti proteici della loro attività.

Ma la totipotenza del genoma umano è irrimediabilmente persa nel processo evolutivo? No, e l'embriogenesi ne è la prova. Se è così, quando, in linea di principio, si realizzerà il secondo percorso evolutivo? Probabilmente, quando l'uomo entrerà nello spazio, dove le condizioni ambientali saranno relativamente costanti per un tempo sufficientemente lungo. La perdita di tessuto osseo (demineralizzazione delle ossa in assenza di gravità), che è soggetto molto lentamente a rimodellamento e rigenerazione, può essere considerata il primo passo nel processo di adattamento dell'uomo, come specie, all'esistenza in condizioni spaziali. Tuttavia, il prezzo per il secondo percorso evolutivo sarà diverso: il prezzo per il ritorno della totipotenza e dell'assoluta plasticità di tutte le cellule sarà la sterilità. Quindi, in questo mondo di "camaleonti evolutivi", dovremo riprodurci senza meiosi, per gemmazione. Ma vivremo a lungo. L'immortalità della telomerasi è l'immortalità di un'ameba. In un organismo multicellulare, le cellule staminali sono il substrato della longevità quantitativa e qualitativa.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Fonti di cellule staminali embrionali

Oggi, le fonti di cellule staminali embrionali per la ricerca di laboratorio sono linee di teratocarcinoma murino (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) e teratocarcinoma umano (NTERA-2, TERA-2, clone H-9), nonché linee ESC di Trauneon. Tuttavia, la disponibilità di un passaporto cellulare dettagliato che indichi il fenotipo immunitario, i risultati dell'analisi cromosomica, i profili di espressione dell'mRNA, i recettori esposti e le proteine di segnalazione intracellulare non compensa le significative carenze delle linee ESC di teratocarcinoma: la rapida perdita di totipotenza e l'impossibilità di utilizzarle in studi clinici, mentre la differenziazione mista in coltura rende molto difficile isolare una linea specializzata pura da una popolazione cellulare eterogenea. Pertanto, la fonte delle linee ESC create per scopi clinici è solitamente la massa cellulare interna della blastocisti, i singoli blastomeri degli embrioni allo stadio di 8 cellule, le cellule della morula degli stadi successivi e le cellule germinali primordiali.

È importante notare che le cellule di teratocarcinoma, pur possedendo la proprietà di essere pluripotenti, sono caratterizzate da un potenziale pluripotente significativamente inferiore rispetto alle cellule staminali embrionali (ESC). La loro integrazione con cellule embrionali raramente porta alla formazione di chimere, che, inoltre, non formano mai gameti con il genotipo delle cellule di teratocarcinoma. Si ritiene che ciò sia dovuto alla frequente insorgenza di anomalie cromosomiche durante la coltura delle cellule di teratocarcinoma: perdita del cromosoma Y, varie trisomie, delezioni o traslocazioni.

Sono stati fatti ripetuti tentativi di isolare una linea di cellule staminali embrionali umane (ESC), ma questo compito non è stato risolto, poiché le blastocisti umane normali sono difficili da accedere. Inoltre, la frequenza di anomalie cromosomiche nell'uomo è maggiore rispetto all'embriogenesi animale. La stragrande maggioranza degli embrioni umani precoci ottenuti dopo la fecondazione in vitro presenta un mosaicismo cromosomico caotico e spesso presenta aberrazioni numeriche e strutturali. Anche successivamente, allo stadio di blastocisti, solo il 20-25% degli embrioni umani è costituito da cellule con un cariotipo normale. Era praticamente impossibile utilizzare tali embrioni per creare cellule staminali embrionali umane (ESC), poiché gli zigoti venivano solitamente coltivati fino allo stadio di due o quattro blastomeri e poi trapiantati nell'utero. Solo relativamente di recente è stata sviluppata una tecnica affidabile per coltivare ovociti umani fecondati fino allo stadio di blastocisti. L'introduzione di questa tecnica nella pratica della fecondazione in vitro non solo ha aumentato la frequenza di esiti di impianto positivi, ma ha anche reso le blastocisti normali un oggetto più accessibile.

Un'altra fonte di cellule staminali pluripotenti sono le cellule germinali primordiali, che, a differenza delle popolazioni progenitrici più avanzate dell'epitelio germinale, non presentano beta-integrina sulla loro superficie, ma esprimono un'elevata attività della fosfatasi alcalina. È opportuno notare che le popolazioni di cellule staminali formatesi da cellule germinali primordiali sono state studiate sperimentalmente fin dagli anni '80. A quel tempo, fu sviluppata una tecnica per isolare le cellule germinali primordiali dai rudimenti della gonade dell'embrione di topo. I primi risultati infruttuosi della coltura di cellule germinali primordiali in vitro suggerirono l'inutilità di questi tentativi, poiché le cellule, sebbene sopravvissute, non proliferavano e morivano entro il primo giorno. Successivamente si è stabilito che le cellule germinali primordiali di topo si riproducono in vitro solo in presenza di fattori di crescita polipeptidici specifici solubili e legati alla membrana nel terreno di coltura. I risultati di numerosi studi hanno dimostrato che per la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule germinali primarie è necessaria la presenza nel terreno di coltura non solo di LIF, ma anche di fattori Steel (SIF) legati alla membrana e solubili. Questi peptidi sono prodotti dalle cellule somatiche di embrioni omozigoti per la mutazione Steel, e uno di essi è un ligando del proto-oncogene cKit.

Le cellule germinali primarie dei mammiferi e degli esseri umani hanno un'origine extragonadica e sono la fonte dello sviluppo clonale della linea cellulare germinale. L'origine della linea cellulare germinale primordiale, così come di tutti i tessuti embrionali e del mesoderma extraembrionale, è l'epiblasto (ectoderma primario) degli embrioni precoci, che presenta un'organizzazione strutturale a mosaico. Utilizzando il metodo di rimozione microchirurgica di varie parti dell'embrione precoci, è stata stabilita una zona di localizzazione nell'epiblasto del clone dei precursori impegnati delle cellule germinali primordiali. Utilizzando la rodamina destrano, utilizzata come marcatore cellulare, è stato stabilito che i precursori delle cellule germinali primordiali sono localizzati nella regione prossimale dell'epiblasto, in prossimità dell'ectoderma extraembrionale. La linea cellulare germinale primordiale deriva da un clone di 45 cellule, la cui allocazione avviene all'inizio della gastrulazione. Successivamente, il clone segrega e, durante la gastrulazione, le cellule germinali primarie entrano nel mesoderma extraembrionale e si trovano alla base del rudimento dell'allantoide, dietro la stria primaria. Da lì, le cellule germinali primarie migrano verso la parte ventrale dell'endoderma dell'intestino posteriore e poi si muovono attivamente lungo il mesentere, popolando le creste genitali al termine della migrazione. Durante la migrazione, così come nei primi 2-3 giorni di localizzazione nel rudimento gonadico, le cellule germinali primarie proliferano attivamente e subiscono otto cicli replicativi. Se all'inizio della migrazione si trovano circa 50 cellule germinali primarie, nelle creste genitali degli embrioni di topo di dodici giorni di sviluppo il numero di cellule germinali primarie supera le 25.000.

La somiglianza funzionale tra ESC e cellule germinali primordiali è dimostrata dalla completa integrazione di queste ultime nella blastocisti, con la sostituzione della massa cellulare interna e il successivo sviluppo completo dell'embrione, i cui tessuti sono costituiti esclusivamente dai discendenti delle cellule germinali primordiali. Anche le cellule germinali primordiali di topo si sono rivelate identiche alle ESC, dimostrando la capacità di differenziarsi in diverse direzioni, di formare corpi embrionali in vitro e di formare teratomi in vivo quando somministrate per via sottocutanea a topi immunodeficienti, simili ai teratomi testicolari spontanei nei topi 129/ter.

Si è scoperto che aggiungendo al terreno di coltura LIF, SIF legato alla membrana e SIF solubile, le cellule germinali primarie isolate di embrioni di topo di 8 giorni sopravvivono e si riproducono in coltura per 4 giorni, per poi morire. Inoltre, il periodo in cui si osserva la morte delle cellule germinali primarie in coltura coincide con lo stadio di sviluppo degli embrioni di topo (12,5-13,5 giorni), quando le cellule germinali primarie femminili entrano in meiosi nei rudimenti delle gonadi e le divisioni mitotiche vengono bloccate nelle cellule germinali primarie maschili. Tuttavia, se al terreno di coltura vengono aggiunti non solo i fattori di crescita LIF e SIF, ma anche FGF2, le cellule germinali primarie continuano a proliferare e nelle sottocolture si formano colonie di cellule capaci di moltiplicarsi anche dopo la rimozione dei fattori di crescita (SIF e FGF) dal terreno di coltura. Tali cellule possono essere coltivate a lungo su un substrato di fibroblasti embrionali senza l'aggiunta del fattore di crescita solubile LIF. È stato proposto di chiamare queste linee cellulari stabili ottenute da cellule germinali primordiali cellule germinali embrionali. Questo termine non ha alcun successo, poiché è impossibile ottenere cellule germinali embrionali in grado di compiere le fasi successive di ovogenesi o spermatogenesi quando si coltivano cellule EG. Ciò è dovuto al fatto che le linee cellulari EG, sebbene provengano da cellule germinali primordiali, acquisendo le proprietà delle cellule staminali pluripotenti embrionali in coltura, perdono la capacità di impegnarsi in linee germinali. In altre parole, le cellule germinali primordiali, una volta coltivate, perdono le proprietà di precursori dei gameti e si trasformano in cellule pluripotenti simili alle ESC.

È stato osservato che i teratomi non si formano quando le cellule EG vengono introdotte in topi immunodeficienti. Si presume che la perdita della capacità delle cellule EG umane di dare origine a teratomi sia dovuta al fatto che queste linee non sono state create direttamente da cellule germinali primarie coltivate, ma sono state ottenute da cellule isolate da corpi embrionali. Pertanto, è possibile che siano discendenti di cellule pluripotenti, ma già impegnate.

È importante notare che esistono differenze fondamentali tra le cellule EG e le cellule germinali primordiali. Queste ultime non consentono di ottenere embrioni chimerici di topo, il che indica la mancata capacità delle cellule germinali primordiali di integrarsi nella massa cellulare interna o trofectoderma. Le caratteristiche della popolazione di cellule germinali primordiali sono più simili a quelle delle linee impegnate di cellule somatiche di embrioni successivi, la cui introduzione nella blastocisti non porta alla formazione di embrioni chimerici.

Una modifica della tecnica di coltura dei corpi embrionali ottenuti per aggregazione di cellule EG ha permesso di ottenere un'altra popolazione di cellule pluripotenti, chiamate "cellule derivate dai corpi embrionali" (cellule EBD), mediante selezione su terreni selettivi. La capacità delle cellule EBD di proliferare a lungo in coltura ha permesso di creare linee cellulari stabili di cellule 'commissionate'. Sono stati ottenuti cloni di cellule che esprimevano un'ampia gamma di marcatori di mRNA e proteine di cellule specializzate. Questo approccio ha infine dimostrato che le cellule germinali primarie umane sono pluripotenti e si differenziano in vitro in diversi tipi cellulari: neuroni, neuroglia, endotelio vascolare, cellule ematopoietiche, cellule muscolari ed endodermiche.

Fonti alternative di cellule staminali embrionali

Una fonte alternativa di linee ESC umane potrebbe essere rappresentata dalle cellule ibride. L'impianto nell'utero di mucche pseudogravide di un costrutto eterogeneo ottenuto dalla fusione per elettroporazione di cellule somatiche del feto umano con un ovulo bovino da cui è stato precedentemente rimosso il pronucleo permette di ottenere una massa cellulare interna da un embrione artificiale in fase di sviluppo preimpianto. A tale scopo, al primo stadio si ottiene una blastocisti da un ovulo bovino con un nucleo cellulare umano trapiantato.

Nella seconda fase, un embrioblasto viene isolato dalla blastocisti e da questo si estraggono le cellule staminali embrionali (ESC) utilizzando il metodo Thomson. È interessante notare che i migliori risultati nell'isolamento delle linee ESC con questo metodo sono stati ottenuti utilizzando nuclei di cellule follicolari o cellule germinali primarie che rimangono nel corpo umano in stato di ibernazione. Ciò è dovuto al fatto che i nuclei delle cellule umane trapiantate in un ovulo bovino devono presentare telomeri non accorciati e un'elevata attività telomeasica, il che contribuisce a prevenire l'invecchiamento precoce dei cloni ESC ottenuti da un ovulo ibrido (Repin, 2001). È noto che le proteine marcatrici intracellulari più importanti delle ESC sono Oct3, Oct4, Tcf e Groucho, che appartengono alle cosiddette proteine silenziatrici della cromatina. I silenziatori forniscono un impacchettamento particolarmente compatto di eterocromatina, che impedisce la formazione di loop eucromatinici. L'impacchettamento della cromatina mediato da queste proteine è correlato alla totipotenza del genoma delle ESC. Ad oggi è stato stabilito che gli ovociti bovini e umani maturi sono gli unici tipi di cellule specializzate che contengono elevate concentrazioni di proteine silenziatrici nel citoplasma. Su questa base, è stato sviluppato un metodo per ottenere cellule staminali embrionali (ESC) ibride trasferendo nuclei di cellule somatiche in ovociti bovini enucleati. Studi preliminari in vitro hanno dimostrato che il citoplasma degli ovociti bovini ripristina la totipotenza del genoma dei nuclei di cellule somatiche umane dopo 12-24 ore di coltivazione.

Di particolare interesse sono i dati sulle peculiarità dello sviluppo preimpianto degli embrioni umani, che indicano una sostituzione più tardiva delle cellule totipotenti con una popolazione di cellule pluripotenti rispetto ai topi. Uno studio sulle trasformazioni cellulari ha mostrato che le cellule del trofoblasto derivano anche dalle cellule della massa cellulare interna delle blastocisti umane, oltre alle cellule staminali embrionali (ESC), il che ne indica la potenza totale.

È noto che allo stadio di blastocisti si formano due popolazioni cellulari con diversa appartenenza. Una di queste forma lo strato esterno della blastocisti: il trofectoderma, i cui derivati sono le cellule del trofoblasto e altre componenti embrionali della placenta. La seconda popolazione di cellule è raggruppata in una massa densa a contatto con la superficie interna del trofectoderma. I derivati della popolazione di cellule della massa cellulare interna sono tutti i tessuti e i rudimenti degli organi dell'embrione. Allo stadio di blastocisti tardiva, l'endoderma extraembrionale si forma dalla massa cellulare interna e si forma l'epiblasto (ectoderma primario). In questo caso, le cellule dell'epiblasto mantengono la pluripotenza, mentre la capacità di differenziare le cellule dell'endoderma extraembrionale è limitata.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Ottenere cellule staminali embrionali umane

Fino a poco tempo fa, si credeva che fosse impossibile ottenere cellule staminali embrionali (ESC) dal trofoblasto. Tuttavia, una linea di cellule staminali diploidi del trofectoderma, isolata da una blastocisti, prolifera e si trasforma in cellule staminali in un terreno di coltura contenente FGF2 ed eparina anziché LIF. Se FGF2 viene rimosso dal terreno di coltura, le cellule del trofectoderma smettono di moltiplicarsi, inizia l'endoreduplicazione cromosomica e gli elementi cellulari del trofectoderma si trasformano gradualmente in cellule giganti del trofoblasto. Probabilmente, LIF non stimola la proliferazione delle cellule del trofectoderma perché FGF2 innesca un diverso meccanismo di trans-segnalazione, poiché FGF2, legandosi al recettore plasmatico (FGFR2), attiva le MAP chinasi nel citoplasma: ERK1 ed ERK2. Di conseguenza, quando una via di segnalazione (LIF - gpl30 - chinasi JAK - STAT3) viene attivata nelle cellule della blastocisti, le cellule della massa cellulare interna vengono trasformate in cellule staminali pluripotenti (ESC), e quando viene attivato il secondo meccanismo di trasduzione del segnale transmembrana (FGF2 - FGFR2 - chinasi MAP ERK1/ERK2), nella blastocisti si formano cellule staminali del trofectoderma. La scelta della via di segnalazione, a sua volta, dipende dall'attività del gene oct4. Questo gene, che appartiene al dominio POU, è localizzato nel locus t dell'autosoma 17 ed è espresso durante l'oogenesi, durante il periodo di segmentazione, così come nelle cellule della massa cellulare interna della blastocisti e nelle cellule germinali primarie. Il ruolo funzionale del gene oct4 è quello di codificare un fattore di trascrizione necessario per l'emersione delle cellule pluripotenti, il loro differenziamento e dedifferenziamento.

L'espressione del gene oct4 nelle cellule staminali embrionali (ESC) varia a seconda dell'interazione di questo fattore di trascrizione con i cofattori. La regolazione mirata dell'espressione di oct4 nelle blastocisti ha mostrato che, quando la sua attività è ridotta, metà delle cellule forma trofectoderma, mentre quando l'espressione indotta di oct4 aumenta, si formano prevalentemente cellule staminali embrionali (ESC).

Nell'esperimento, le cellule staminali embrionali (ESC) non possono essere trasferite in una linea durante la coltivazione di blastomeri totipotenti nella fase di segmentazione, così come nella fase di gastrulazione e nelle fasi successive dello sviluppo embrionale. Le cellule staminali embrionali (ESC) di topo vengono solitamente isolate tra il 3,5 e il 4,5° giorno di gravidanza, che corrisponde al sesto (blastocisti monostrato) e al settimo stadio (blastocisti bistrato - cilindro ovocitario precoce) dell'embriogenesi normale. Ovviamente, solo nel periodo preimpianto gli embrioni di topo contengono popolazioni cellulari in grado di trasformarsi in ESC. Di conseguenza, l'isolamento di linee di ESC è possibile solo in determinate fasi dell'embriogenesi. Lo zigote e i blastomeri che si formano durante la segmentazione sono totipotenti, dal punto di vista della possibilità di sviluppare un embrione vitale con membrane embrionali e placenta. La perdita di potenza totale delle cellule germinali inizia allo stadio tardivo della morula, quando l'ulteriore impiego dei blastomeri dipende dalla loro posizione. I blastomeri della morula precoce mantengono la totipotenza, poiché le manipolazioni sperimentali con modifiche nella loro localizzazione, come l'inversione della loro posizione, non impediscono lo sviluppo di un embrione completo.

È stato dimostrato che l'efficienza dell'isolamento delle cellule staminali embrionali (ESC) in una linea cellulare è influenzata dalle condizioni delle blastocisti al momento del loro espianto. L'utilizzo di blastocisti dopo aver simulato una diapausa di sette giorni nell'apparato riproduttivo di topi ovariectomizzati al 3° e mezzo giorno di gravidanza e trattati con progesterone facilita un isolamento più efficace delle linee cellulari staminali embrionali. Si presume che in tali condizioni il numero di blastomeri che formano la massa cellulare interna aumenti. È anche possibile che il ciclo cellulare si allunghi e che la maggior parte dei blastomeri entri in fase G0.

Inoltre, la creazione di linee di cellule staminali embrionali pluripotenti stabili dipende dal genotipo degli embrioni: le cellule staminali embrionali pluripotenti (ESC) sono isolate abbastanza facilmente dalle blastocisti della linea di topi 129, sono molto più difficili da ottenere utilizzando topi CS7BL/6, ed è praticamente impossibile isolare una linea di ESC dalle blastocisti di topi CBA/Ca. Ovviamente, gli embrioni precoci presentano alcune caratteristiche genetiche che influenzano lo sviluppo di una linea di ESC pluripotenti. Tuttavia, coltivando epiblasti isolati, così come mediante selezione selettiva delle cellule in via di differenziamento, le linee di ESC sono state comunque isolate da embrioni precoci di topi CBA/Ca.

Una tecnica standard comprovata per l'ottenimento di linee ESC da blastocisti è descritta nei manuali di laboratorio relativi alla tecnica degli esperimenti con embrioni precoci. Linee ESC sperimentali possono essere ottenute anche coltivando epiblasto isolato (ectoderma primario) di embrioni di topo di 4,5 giorni di età utilizzando una tecnica microchirurgica piuttosto complessa e condizioni di coltura modificate. L'intensità di lavoro di questa procedura è giustificata, poiché la frequenza di formazione di linee ESC in questo caso si è rivelata significativamente maggiore rispetto a lavori con la massa cellulare interna della blastocisti.

Per isolare le linee ESC, ogni clone viene trasferito in un pozzetto, si coltiva un aggregato di 40-60 cellule e poi si disperde nuovamente. Ripetizioni multiple di questa procedura ci permettono di ottenere una linea ESC immortalizzata con il massimo tasso di proliferazione di cellule normocariotipiche attaccate alla plastica, che mantengono la totipotenza e un'elevata attività telomerasica dopo 50-100 passaggi. Nel processo di mantenimento delle linee ESC, il pericolo maggiore è la contaminazione del terreno o del siero con endotossine batteriche: anche tracce di endotossina nel terreno di coltura causano la morte in massa delle cellule germinali immature. Con un attento monitoraggio della crescita lineare e una dispersione tempestiva, le ESC in coltura sono in grado di dividersi simmetricamente, in cui entrambe le cellule figlie rimangono pluripotenti e capaci di compiere un numero illimitato di cicli cellulari, mantenendo un cariotipo diploide e una potenza totale.

La selezione di una popolazione pura di cellule staminali embrionali umane (ESC) può essere effettuata dopo la trasfezione del loro genoma con molecole di DNA ricombinante contenenti il gene che codifica per la sintesi della proteina fluorescente verde (GFP). L'espressione di GFP aumenta quando le ESC vengono coltivate in condizioni che ne supportano la proliferazione, mentre con l'inizio del differenziamento il livello di espressione di questo gene diminuisce, il che consente la selezione di linee cellulari pure pluripotenti stabili su un terreno selettivo. Quando si coltivano cellule staminali embrionali isolate mediante selezione con GFP, la frequenza di formazione di colonie aumenta notevolmente, poiché il potente effetto antiproliferativo delle cellule differenziate viene annullato nelle condizioni delle colture di selezione.

La traduzione delle cellule staminali embrionali umane in una linea cellulare viene effettuata utilizzando il metodo del loro isolamento da embrioni preimpianto (allo stadio di 80-120 cellule), che rimangono dopo la procedura di fecondazione in vitro. A tale scopo, gli embrioni "in eccesso" ottenuti artificialmente vengono dispersi meccanicamente nel terreno di coltura Delbecco-Eagle. Dopo aver marcato le cellule con anticorpi monoclonali selettivi con un marcatore fluorescente, le cellule embrioblastiche vengono isolate. L'embrioblasto viene disperso in singole cellule utilizzando una miscela di dispasi-collagenasi. Le cellule dissociate vengono coltivate in un terreno di coltura speciale (80% terreno di coltura Delbecco + 20% siero fetale di vitello in presenza di 500 μg/ml di IL-6, LIF e SCF) su un monostrato di fibroblasti embrionali dei primi 3 passaggi. In questo caso, la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule staminali e progenitrici vengono mantenute grazie all'effetto di IL-6, LIF e SCF. In tale terreno, le cellule staminali embrionali (ESC) crescono come cloni in sospensione di cellule a palla non ancorate, che devono essere dissociate mediante ripetute pipettate. Nuovi cloni compaiono nella coltura sospesa tra il 5° e il 7° giorno. La massima velocità di crescita delle ESC si ottiene mediante ripetute dissociazioni dei cloni allo stadio di 10-15 cellule. Successivamente, ogni clone viene trasferito in un pozzetto e coltivato fino a un aggregato di 40-50 cellule. La procedura viene ripetuta più volte in passaggi, aumentando il volume della coltura fino a una densità di 5-10 milioni di cellule per piastra da 6 cm. Utilizzando tali passaggi, Thomson ha isolato 10 cloni immortali di ESC umane, che dopo 100 passaggi hanno mantenuto un'elevata attività telomerasica, la capacità di proliferare vigorosamente, caratteristiche fenotipiche minime e una potenza totale con la capacità di differenziarsi in una qualsiasi delle 350 linee cellulari specializzate derivate da ecto-, meso- ed endoderma. Il differenziamento delle cellule staminali embrionali umane (ESC) è iniziato (dopo il cambio del terreno di coltura, l'aggiunta di siero e l'eliminazione del LIF) con l'adesione cellulare al substrato, a indicare lo sviluppo del citoscheletro e l'espressione dei recettori di adesione. È importante sottolineare che, nonostante la proliferazione illimitata, le cellule staminali embrionali umane hanno mantenuto un cariotipo normale.

Il secondo metodo per isolare le linee di cellule staminali embrionali umane (ESC) si basa sull'utilizzo di cellule germinali primarie. Studi sperimentali hanno dimostrato che le linee di cellule E possono essere ottenute dalle pieghe genitali di embrioni di topo di 12,5 giorni di età. Tuttavia, in questi casi la frequenza di formazione di linee cellulari progenitrici è risultata significativamente inferiore rispetto agli esperimenti condotti su embrioni di età gestazionale precedente. Allo stesso tempo, le cellule germinali primarie provenienti dalle gonadi di embrioni di topo di 13,5 giorni di età gestazionale non sono affatto in grado di trasformarsi in linee.

Le prime linee stabili di cellule EG umane pluripotenti sono state ottenute da gonociti primari isolati dalle gonadi di embrioni di 5-9 settimane di età. Le cellule isolate sono state coltivate su un substrato di fibroblasti embrionali di topo inattivati in terreno DMEM con siero fetale supplementato con mercaptoetanolo, forskolina e fattori di crescita umani ricombinanti (FGF e LIF). Dopo 7-12 giorni, sono comparse in coltura colonie multicellulari, corrispondenti a cellule EG umane per caratteristiche morfologiche e marcatori molecolari. Dopo l'aggregazione, queste cellule hanno formato corpi embrioidi, con ulteriore sviluppo dei quali sono comparse cellule specializzate caratteristiche dei derivati di tutti e tre i foglietti germinativi. Nel corso di 10-20 passaggi, le linee cellulari EG hanno mantenuto un cariotipo normale e non hanno perso la pluripotenza.

È stato inoltre dimostrato che l'azione combinata di LIF, fattori Steel legati alla membrana e solubili, e TGF-β altera il programma di sviluppo delle cellule germinali primordiali. Invece di cessare le divisioni mitotiche e iniziare a differenziarsi verso l'oogenesi o la spermatogenesi, le cellule germinali primordiali continuano a proliferare. Dopo diversi cicli mitotici aggiuntivi, diventano simili alle cellule dell'epiblasto e, perdendo le proprietà di precursori delle cellule germinali, si trasformano in cellule staminali embrionali pluripotenti (EG).

Così, nel 1998, linee immortalizzate di cellule germinali primordiali sono state isolate per la prima volta dal rudimento genitale di tessuto autoptico fetale umano. Nell'embriogenesi umana, le cellule germinali primordiali compaiono nel sacco vitellino nella terza settimana di sviluppo e, tra la quarta e la quinta settimana, migrano verso la zona del tubercolo genitale, dove formano popolazioni dormienti di gonociti primari. In stato inattivo, le cellule germinali primordiali vengono conservate nell'embrione fino alla nascita. Linee di cellule germinali primordiali vengono isolate dal tubercolo genitale fetale di embrioni di 5-9 settimane, il cui tessuto estratto viene trattato ex tempore con una miscela di collagenasi di tipo IV-V, ialuronidasi e DNasi per aumentare la resa quantitativa e qualitativa delle cellule. Le cellule germinali primordiali nel tessuto del tubercolo genitale fetale sono circondate da cellule di Sertoli stromali (mesenchimali). Lo scopo funzionale delle cellule di Sertoli è quello di produrre fattori antiapoptotici (ligando di Fas), mitogeni e immunosoppressori che proteggono le cellule germinali dagli attacchi immunitari dell'organismo. Inoltre, il microambiente stromale del tubercolo genitale svolge un ruolo importante nella maturazione dei gameti. Le cellule germinali primarie isolate vengono impiantate in coltura su uno strato stromale di supporto costituito da fibroblasti fetali dei primi tre passaggi. La combinazione più efficace di mitogeni è un complesso costituito da LIF, FGF e forskolina (uno stimolatore della formazione di cAMP). La proliferazione delle cellule germinali primarie in vitro richiede l'aggiunta di siero fetale, in presenza del quale la riproduzione dei gonociti primari in coltura è accompagnata dalla formazione di cloni di cellule sferiche non legate al substrato.

Presso il National Institutes of Health, negli Stati Uniti, sulla base di una sintesi dei dati esistenti sui metodi di isolamento delle linee di cellule staminali embrionali umane (ESC) dalle blastocisti, si è giunti alla conclusione preliminare che l'isolamento di successo delle ESC è più probabile quando si coltivano blastocisti con una massa cellulare interna ben formata (Cellule staminali: progressi scientifici e direzioni future della ricerca. Nat. Institute of Health USA). Da questo punto di vista, la fonte ottimale di ESC per la creazione di linee sono le blastocisti umane al quinto giorno di sviluppo, dalle quali il trofectoderma deve essere accuratamente rimosso durante l'isolamento della massa cellulare interna. La massa cellulare interna isolata, composta da 30-35 cellule in questa fase, deve essere coltivata su un substrato di fibroblasti embrionali di topo, condizione fondamentale per la formazione di colonie di ESC in coltura.

Analisi delle caratteristiche fenotipiche delle cellule staminali embrionali

Di particolare interesse è l'analisi comparativa interspecie delle caratteristiche fenotipiche delle cellule staminali embrionali (ESC). È stato scoperto che le colonie di ESC umane sono densi ammassi di cellule appiattite, di tipo epiteliale, mentre i corpi embrionali di topo sono costituiti da un conglomerato lasso di cellule arrotondate. Nelle ESC umane, l'indice del rapporto nucleo-plasma è inferiore rispetto alle ESC di topo. Le cellule staminali embrionali di scimmia formano colonie di cellule più piatte con bordi irregolari. Le singole cellule sono facilmente visibili nei cloni precoci di ESC di primati. Le ESC proliferanti di tutte le specie animali studiate non esprimono molecole MHC di classe I e II. Allo stesso tempo, le ESC umane mostrano una reazione positiva agli anticorpi TERA 1-60 e GCTM-2, il che indica la presenza di proteoglicani cheratina/condroitin solfato sulla loro superficie, caratteristici delle cellule staminali embrionali-terato-carcinoma. L'espressione del gene oct4 nelle cellule staminali embrionali (ESC) di tutte le specie animali suggerisce che, nonostante le differenze fenotipiche, lo stesso insieme di geni responsabili del mantenimento della pluripotenza sia apparentemente attivato nelle cellule staminali embrionali umane e murine (Perù, 2001). Inoltre, le linee di ESC isolate da embrioni di ratto, maiale, coniglio, primate e bovini presentano caratteristiche morfologiche simili, un insieme simile di marcatori molecolari di identificazione e un meccanismo molecolare pressoché identico per l'implementazione dei programmi di embriogenesi, il che ci consente di affrontare il problema dello xenotrapianto con una nuova prospettiva.

A differenza della normale embriogenesi in vivo, la proliferazione delle cellule staminali embrionali (ESC) in vitro non è accompagnata dalla formazione di foglietti embrionali e avviene in un contesto di blocco degli Hoxgeni omeotici, ovvero senza organogenesi. Poiché i geni di segmentazione non sono attivi, è impossibile riprodurre periodi dell'embriogenesi come la deposizione dei somiti, la segmentazione dell'embrione, la formazione del sacco vitellino, dell'allantoide e di altri organi e tessuti provvisori in coltura di ESC. Le ESC in coltura sembrano essersi congelate all'inizio del processo di formazione di 350 linee di restrizione di cellule specializzate. Pertanto, un clone di cellule progenitrici figlie e un'ESC localizzata centralmente rappresentano solo un modello di embrione, durante il cui sviluppo si formano simultaneamente diverse linee di cellule specializzate in diverse regioni tissutali, che tuttavia originano da precursori comuni. Nonostante il livello minimo di recettori sulla superficie delle cellule staminali embrionali (ESC), queste mantengono la capacità di svolgere processi morfogenetici primitivi, imitando le strutture volumetriche di un embrione precoce: una sospensione di ESC in coltura si aggrega e forma strutture simili a blastocisti o persino a embrioni più tardivi (cilindri ovocitari). Tali aggregati in sospensione sono rispettivamente chiamati corpi embrionali semplici e complessi.

Nella differenziazione mista, i geni precoci dell'ectoderma (oct3, fgf-5, nodale), dell'endoderma (gata-4), del mesoderma (brachyury), del mesoderma cardiogeno (pkh-2.5), del tubo neurale (msx3) e dell'ematopoiesi (elkf) vengono espressi simultaneamente in cellule diverse di un corpo embrionale. Utilizzando varie combinazioni di fattori di crescita e citochine per un'azione mirata sulla formazione delle cellule del foglietto germinale in vitro, è stato possibile in diversi casi ottenere corpi embrionali in cui i geni dell'ectoderma o del mesoderma erano espressi preferenzialmente, il che apre la strada alla modellizzazione della gastrulazione e delle fasi iniziali dell'organogenesi.

La crescita clonale delle cellule staminali embrionali (ESC) è la prova di una divisione cellulare asimmetrica, in cui solo una cellula embrionale embrionale (ESC) al centro del clone mantiene un potenziale proliferativo illimitato, mentre la seconda cellula figlia genera una generazione di cellule progenitrici già in fase di differenziazione. Pertanto, il tasso di proliferazione del clone alla periferia del corpo embrionale è maggiore rispetto al centro. Le cellule marginali del clone in crescita subiscono una differenziazione spontanea disordinata, migrano o muoiono per apoptosi. Questi eventi determinano il destino del clone: se il tasso di proliferazione supera il tasso di migrazione e di morte cellulare per apoptosi, il clone continua ad aumentare di dimensioni, la stabilizzazione si verifica quando il tasso di apoptosi e il tasso di formazione di nuove cellule sono uguali e la regressione si verifica quando il rapporto tra questi processi è inverso. Le cellule progenitrici si dividono simmetricamente, ovvero entrambe le cellule figlie si differenziano successivamente in linee cellulari specializzate mature. Il rapporto tra cellule staminali embrionali (ESC) e cellule progenitrici varia, ma il numero di ESC è sempre solo una frazione percentuale della popolazione di cellule progenitrici. Pertanto, solo un attento pipettamento e una tempestiva disaggregazione dei cloni possono aumentare il numero di cellule staminali embrionali (ESC) in coltura. La disaggregazione dei cloni allo stadio di 10-12 cellule si è rivelata la più efficace per ottenere la massima resa di ESC. La direzione e il grado di differenziazione delle cellule nel corpo embrionale dipendono dalla loro posizione. Le cellule esterne del corpo embrionale non esprimono il gene oct4 e subiscono la differenziazione in cellule dell'endoderma primario, da cui si formano successivamente cellule simil-epiteliali dell'endoderma extraembrionale parietale e viscerale. Le cellule interne del corpo embrionale esprimono il gene oct4 e mantengono la pluripotenza per 48 ore di coltura. Tuttavia, la coltura viene quindi ristrutturata morfologicamente in un monostrato epiteliale e inizia l'espressione dei geni che controllano lo sviluppo dell'ectoderma primario. Successivamente, inizia il processo di citodifferenziazione disordinata totale con la comparsa di vari tipi cellulari derivati da tutti e tre i foglietti germinativi. Nel processo di differenziazione spontanea delle cellule del corpo embrionale, i primi ad apparire sono aggregati con marcatori endodermici sotto forma di frammenti (cisti) del sacco vitellino. Successivamente, in queste strutture compaiono angioblasti e cellule endoteliali dei capillari in crescita. Nelle fasi finali della differenziazione spontanea, dalle cellule interne del corpo embrionale si sviluppano diverse cellule terminalmente differenziate, tra cui neuroni, elementi gliali, cardiomiociti, macrofagi ed eritrociti. In una certa misura (tenendo conto dell'inversione spaziale della formazione degli strati di tessuto germinale), utilizzando i corpi embrionali, è possibile studiare i processi morfogenetici in vitro e analizzare i meccanismi molecolari dei periodi iniziali della citodifferenziazione embrionale.nonché per stabilire il ruolo di geni specifici nell'attuazione di questi processi.

Pertanto, all'interno del clone sono presenti cellule in cui sono stati scoperti diversi programmi di sviluppo genetico: cellule staminali embrionali (ESC), progenitori precoci e popolazioni di progenitori in via di differenziazione. La coltivazione di ESC con il metodo della goccia sospesa o della coltura di massa senza strato di alimentazione e senza aggiunta di LIF al terreno di coltura porta inevitabilmente alla formazione di corpi embrionali. La morfologia delle cellule degli strati esterno e interno dei corpi embrionali è diversa. Lo strato esterno è costituito da cellule grandi e ramificate. La loro superficie rivolta verso l'ambiente è ricoperta da numerosi microvilli. Lo strato esterno di cellule è separato dallo strato interno da una membrana basale simile alla membrana di Reichert, mentre le cellule dello strato interno dei corpi embrionali sono epitelio colonnare. Morfologicamente, lo strato interno, sebbene contenga molte cellule in divisione, assomiglia più da vicino alle colonie indifferenziate di ESC.

Caratteristiche delle cellule staminali embrionali umane

L'assenza di interazioni di segnalazione parenchimato-mesenchimale, in concomitanza con il blocco genico dell'omeosi, porta a una crescita disordinata delle cellule staminali embrionali (ESC) in coltura, poiché ciò interrompe la formazione e lo sviluppo dell'infrastruttura degli organi provvisori. La crescita disorganizzata e la differenziazione spontanea disordinata delle ESC in coltura sono dovute all'assenza di marcatura mesenchimale della struttura stromale dei futuri organi: in vitro, è possibile formare milioni di epatociti, ma è impossibile ottenere un singolo lobulo epatico che includa elementi strutturali e funzionali come seni, spazi di Disse e cellule di Kupffer.

Si ritiene che la pluripotenza delle cellule staminali embrionali (ESC) si realizzi esclusivamente nell'embriogenesi con la formazione di tessuti e organi dell'embrione, mentre la placenta e il cordone ombelicale sono derivati del trofoblasto. Le ESC racchiuse nella membrana trofectodermica generano sequenzialmente cloni di cellule provvisorie che implementano il programma di sviluppo attraverso l'mRNA combinatorio della matrice topografica volumetrica di Nokhteyov, che predetermina la disposizione spaziale, la forma e le dimensioni, il numero di cellule degli organi provvisori e definitivi, nonché l'assemblaggio del parenchima in unità strutturali e funzionali. Allo stesso tempo, le ESC rimangono l'unico tipo di cellule in cui il meccanismo molecolare per l'implementazione delle loro potenze è completamente scollegato dal programma di sviluppo genetico, e le ESC stesse sono private della capacità di interagire con altre cellule a causa del blocco sia delle percezioni recettoriali che dei sistemi di transsegnalazione. Tuttavia, un'adeguata attivazione delle cellule staminali embrionali (ESC) porta a uno sviluppo graduale del programma embriogenetico, che si conclude con la nascita di un organismo completamente formato, composto da miliardi di cellule, pronto per la vita extrauterina. In questo percorso a breve termine, ma incredibilmente lungo, nello spazio cellulare, si verificano inevitabilmente errori sia nei meccanismi molecolari che assicurano l'attività vitale delle cellule, sia nei programmi che ne controllano la proliferazione, la differenziazione e la specializzazione. Pertanto, nella moderna farmacogenomica, le malattie della struttura molecolare e quelle della programmazione cellulare vengono considerate separatamente. Inoltre, l'azione della maggior parte dei nuovi farmaci è mirata a correggere i programmi di differenziazione, proliferazione e organogenesi, nonché alla rigenerazione di organi e tessuti. In un organismo adulto, le ESC consentono di controllare il comportamento delle cellule staminali/progenitrici trapiantate nel cervello, nel fegato, nella milza, nel midollo osseo e in altri organi umani per ripristinare il parenchima danneggiato degli organi del ricevente, differenziando e specializzando le cellule del donatore sulla matrice mesenchimale conservata. In sostanza, il programma di totipotenza inizia a realizzarsi a livello dei genomi di ovocita, zigote e blastomero; tuttavia, queste cellule non sono ancora state clonate e trapiantate nelle quantità necessarie per le esigenze della medicina sperimentale e pratica. Pertanto, le cellule staminali embrionali (ESC) rimangono una fonte unica di informazioni genetiche, contenenti codici per una mappa tridimensionale dell'embrione e codici per la restrizione lineare di linee cellulari specializzate durante la gastrulazione.

Il potenziale rigenerativo praticamente illimitato delle cellule staminali embrionali (ESC) è dovuto al fatto che il loro genoma, a differenza dell'apparato genetico delle cellule somatiche differenziate, mantiene la pluripotenza. Una delle manifestazioni dello stato dormiente dell'informazione genetica racchiusa nelle ESC è il cosiddetto fenotipo minimo: sulla superficie delle ESC è espresso un numero limitato di recettori e, di conseguenza, vengono impiegati pochissimi programmi di trans-segnalazione per l'interazione dell'apparato nucleare della cellula con il suo microambiente. A fronte dell'ibernazione dei geni responsabili della restrizione delle linee cellulari specializzate e del differenziamento cellulare, solo circa 30 geni su 500 vengono attivati, i cui prodotti assicurano la connessione della cellula con il microambiente circostante. Utilizzando il metodo di analisi seriale dell'espressione genica, è stato dimostrato che, nonostante il lavoro comune delle principali caselle funzionali del genoma che regolano l'energetica e il metabolismo nelle cellule somatiche e nelle ESC, queste ultime presentano un livello molto basso di mRNA di recettori, proteine G, messaggeri secondari, trascrittasi, cofattori di espressione e repressione, ovvero l'intero sistema di trasmissione transmembrana del segnale regolatorio alla cellula. Ciò è dovuto all'assenza o a un'espressione molto bassa di geni di transsegnalazione. Durante il periodo di differenziazione indotta nel genoma delle ESC, 18 geni funzionanti smettono di funzionare in sincronia, mentre si attivano 61 geni di transsegnalazione che controllano la sintesi dei recettori di adesione cellulare, dei componenti della matrice extracellulare, delle trascrittasi di restrizione e degli elementi messaggeri del sistema di trasmissione del segnale all'apparato nucleare dai recettori della membrana plasmatica cellulare. Contemporaneamente viene bloccata l'espressione dei geni responsabili della sintesi delle proteine silenziatrici e dei co-inibitori dell'espressione genica che assicurano la totipotenza del genoma delle ESC.

Sono stati individuati marcatori genetici per le cellule di tutti e tre i foglietti embrionali. L'identificazione delle cellule ectodermiche avviene tramite l'espressione dei geni nodali, oct3 e fgf-5, delle cellule mesodermiche tramite l'espressione del gene brachiuria, delle cellule zetaglobiniche e dell'endoderma tramite l'espressione del gene gata-4. Nell'embriogenesi normale, durante il periodo di gastrulazione, si osserva la migrazione attiva di popolazioni immature di cellule staminali e progenitrici, che marcano localmente le zone di sviluppo delle ossa facciali del cranio, di alcune parti dell'encefalo, del sistema nervoso periferico, del sistema di conduzione cardiaco e del timo, i cui tessuti sono formati da cloni di cellule migranti. La marcatura delle cellule mediante i geni precoci dei foglietti embrionali facilita l'analisi topografica dei processi di migrazione delle cellule precursori nell'embrione in via di sviluppo. È stato stabilito, in particolare, che negli aggregati di cellule di embriocarcinoma P19, l'espressione del primo gene mesodermico brachyury inizia durante il periodo di ridotta espressione dei geni dell'attivatore tissutale del plasminogeno, dell'α-fetoproteina, della cheratina 8 e della cheratina 19, che sono marcatori delle prime popolazioni mesodermiche migranti. Di conseguenza, la formazione di tessuti di origine mesodermica inizia solo dopo il completamento del processo di migrazione puntiforme e dispersione delle cellule progenitrici mesodermiche.

Nonostante le caratteristiche fenotipiche estremamente limitate e l'assenza della maggior parte delle unità di segnalazione trans, le cellule staminali embrionali (ESC) esprimono ancora alcune molecole recettoriali che possono essere utilizzate per la loro identificazione. È interessante notare che gli antigeni marcatori delle ESC nell'uomo e nei primati si sono rivelati comuni. Il più delle volte, per la marcatura delle ESC vengono utilizzati anticorpi marcati contro gli antigeni di membrana SSEA-3, SSEA-4 (antigeni lipidici unici che rappresentano un complesso di glicolipidi GL7 con acido sialico), così come le glicoproteine ad alto polimero TRA-1-81, TRA-1-60. Inoltre, le ESC esprimono l'antigene embrionale specifico SSEA-1 e la fosfatasi alcalina endogena, nonché il fattore di trascrizione specifico Oct4. Quest'ultimo è necessario per mantenere i meccanismi di proliferazione delle ESC: il fattore di trascrizione specifico Oct4 attiva l'espressione del gene del fattore di crescita dei fibroblasti 4 e stabilizza l'espressione del gruppo di geni responsabili della replicazione illimitata del DNA nelle cellule immature. Le proteine marcatrici intracellulari più importanti sono Oct3, Oct4, Tcf e Groucho, che sono correlate alle proteine silenziatrici della cromatina.

Quasi immediatamente dopo il successo di molti anni di tentativi di coltivare cellule staminali embrionali (ESC) al di fuori dell'organismo e l'ottenimento delle prime colture di cellule staminali isolate da blastocisti di topo e di colture di cellule germinali primarie, è iniziata una fase di ricerca sul potenziale pluripotente delle ESC, con la loro introduzione in embrioni nelle prime fasi dello sviluppo. È stato dimostrato che, allo stadio di morula e blastocisti, le ESC sono in grado di formare embrioni chimerici in cui la discendenza delle ESC del donatore è presente in tutti i tessuti somatici e persino nei gameti. Pertanto, nella biologia dello sviluppo, l'utilizzo delle ESC ha creato un "ponte" tra studi sperimentali in vivo e in vitro, ampliando significativamente le possibilità di studio dei processi di deposizione di tessuti e organi primari, del loro differenziamento e dell'organogenesi embrionale.

È chiaramente stabilito che in vivo, durante l'embriogenesi, le cellule staminali embrionali (ESC) sono integrate nella massa cellulare dell'embrione precoce e i loro derivati si trovano in tutti gli organi e tessuti. Le ESC colonizzano una linea di cellule germinali nell'embrione chimerico, i cui discendenti formano ovuli e spermatozoi completi. Le cellule staminali embrionali sono clonogeniche: una singola ESC è in grado di creare una colonia geneticamente identica di cellule con marcatori molecolari, tra cui l'espressione del gene oct4 e della fosfatasi alcalina, un'elevata attività telomerasica e l'espressione di alcuni antigeni embrionali.

Per studiare i meccanismi dell'embriogenesi utilizzando le cellule staminali embrionali (ESC), è stato sviluppato un metodo di chimerizzazione della morula, creando un costrutto biologico al cui esterno è presente uno strato di blastomeri tetraploidi del ricevente, al cui interno vengono introdotte le cellule staminali embrionali (ESC) del donatore. In questo modo, il trofoblasto si forma dai discendenti dei blastomeri tetraploidi del ricevente, garantendo l'impianto e la placentazione, e le cellule staminali embrionali (ESC) del donatore agiscono come una massa cellulare interna da cui si formano il corpo di un embrione vitale e una linea di cellule germinali progenitrici primarie. Il valore delle ESC per la ricerca non risiede solo nel fatto che la pluripotenza viene preservata durante le manipolazioni in vitro del loro genoma, ma anche nel fatto che viene preservata la capacità delle ESC di partecipare alla formazione delle cellule germinali primarie di un embrione chimerico. È stato dimostrato che i discendenti di una sola ESC geneticamente modificata popolano tutti i rudimenti primari e i tessuti in via di sviluppo di un embrione chimerico ottenuto per aggregazione o co-coltivazione di questa cellula con un embrione di 8 cellule. Quando le cellule staminali embrionali (ESC) trasfettate con il gene della proteina fluorescente verde (GFP) venivano trapiantate nella morula di topi, discendenti fluorescenti di questa cellula sono stati trovati in tutti i tessuti studiati dell'embrione in via di sviluppo (Shimada, 1999). Il trapianto di cellule staminali embrionali (ESC) nella morula consente la creazione di topi vitali il cui organismo è costituito esclusivamente dai discendenti delle cellule staminali embrionali (ESC) del donatore, aprendo così nuove prospettive per la clonazione terapeutica. Questo approccio metodologico è ora utilizzato con successo per studiare problemi di biologia dello sviluppo, in particolare per analizzare i meccanismi di inattivazione genetica del cromosoma X o di instabilità epigenetica delle ESC. Il trapianto di ESC in un embrione precoce è utilizzato anche nelle biotecnologie agricole, così come negli esperimenti di terapia genica.

Il trapianto di cellule staminali embrionali (ESC) geneticamente modificate viene utilizzato per testare cellule bersaglio di geni mutanti. Le cellule staminali embrionali (ESC) coltivate in vitro vengono utilizzate in biotecnologia per creare topi knockout. A tale scopo, il gene da studiare viene rimosso dalle ESC mediante ricombinazione omologa (knockout) e le cellule prive di tale gene vengono isolate su terreni selettivi. Le ESC knockout vengono quindi introdotte nella blastocisti o aggregate con blastomeri di morula. Gli embrioni chimerici precoci ottenuti in questo modo vengono trapiantati in femmine riceventi e, tra i topi neonati, vengono selezionati individui con gameti nullizigoti per un dato gene. Questa tecnologia è stata utilizzata per creare numerose linee di topi knockout, ampiamente utilizzate in biologia e medicina sperimentale. Tali modelli biologici vengono utilizzati per studiare il significato di determinati geni nello sviluppo embrionale, nonché il loro ruolo nei meccanismi di malattie e condizioni patologiche umane. Inoltre, le linee animali knockout vengono utilizzate nei test preclinici di nuovi metodi di terapia genica. Ad esempio, trasfettando l'allele normale di un gene mutante nel genoma delle cellule staminali embrionali (ESC), è possibile correggere efficacemente una mutazione che colpisce il sistema ematopoietico. L'introduzione di geni estranei nelle cellule staminali embrionali (ESC) consente la rapida creazione di linee di animali da laboratorio transgenici omozigoti. Tuttavia, è opportuno sottolineare che la tecnica di delezione genica mirata per ricombinazione è stata finora sviluppata in modo affidabile solo per le cellule staminali embrionali (ESC) murine. Utilizzando cellule staminali embrionali (ESC) murine a doppio knockout, è stato stabilito il ruolo funzionale della regione del cluster genico sul cromosoma 7 (una copia della regione genomica sul cromosoma umano 19) e della regione prossimale del cromosoma 11 (una copia del cromosoma umano 5g). La delezione di questi geni nelle cellule staminali embrionali (ESC) murine ha permesso di valutare la funzione dei loro analoghi nell'uomo.

Le possibilità di studiare la funzione dei geni dell'embriogenesi umana si sono ampliate, la cui trasfezione nel genoma delle cellule staminali embrionali (ESC) di animali da laboratorio ha permesso, in particolare, di chiarire il ruolo del gene cripto nella formazione e nello sviluppo del mesoderma cardiogeno, il gene pax-6, nell'embriogenesi oculare. Sono in fase di compilazione le prime mappe di espressione genica nelle cellule staminali embrionali (ESC) immature proliferanti di teratocarcinoma e blastocisti di topo, ed è stata confermata la repressione soppressiva dei geni di transsegnalazione nelle ESC. Una combinazione di 60-80 ESC mutanti e 20-30 cellule di embrioni di topo normali preimpianto porta allo sviluppo di embrioni chimerici in cui i primordi degli organi sono costituiti da cellule donatrici e riceventi, il che rende possibile chiarire il ruolo di geni sconosciuti nella gastrulazione e nell'organogenesi. La mappa funzionale dei geni degli embrioni di topo in via di sviluppo è stata integrata da informazioni sul ruolo del gene sf-1 nella formazione della ghiandola surrenale e delle gonadi, del gene wt-1 nella formazione del rene, dei geni della famiglia myoD nella formazione del muscolo scheletrico e dei geni della famiglia gata-1-4 nella maturazione di restrizione dei rudimenti dell'eritropoiesi e della linfopoiesi.

L'inibizione mirata degli alleli materni e paterni di geni nelle cellule staminali embrionali (ESC) mediante ricombinasi vettoriali ha permesso di chiarire le funzioni di vari geni nel periodo precoce dell'embriogenesi, mentre la tecnologia di trasferimento mirato di geni umani sconosciuti nelle cellule staminali embrionali (ESC) murine contribuisce alla scoperta di nuovi geni mutanti responsabili dello sviluppo di gravi patologie ereditarie. Utilizzando il metodo del knockout, è stata determinata l'importanza obbligatoria di alcuni geni per la formazione dei tessuti embrionali: gata-4 per il miocardio, gata-1 per la linea eritroide del tessuto emopoietico, myoD per i muscoli scheletrici, brachyury per il mesoderma, le trascrittasi di restrizione hnf3 e hnf4 per le cellule staminali epatiche, rag-2 per la formazione di cloni di linfociti T e B (Repin, 2001). La doppia delezione genica nelle cellule staminali embrionali (ESC) ha aperto la strada allo studio del ruolo funzionale dei geni del foglietto germinale, della segmentazione e dell'omeosi, e il trapianto di ESC ha reso possibile l'ottenimento di embrioni ibridi interspecie vitali. Utilizzando una tecnica migliorata per il trapianto di un singolo ESC donato in un embrione di 8 cellule, è stata dimostrata la chimerizzazione a livello cellulare di molti organi dell'embrione ricevente. È importante notare che germogli cellulari di tessuto umano sono stati trovati negli organi di topi riceventi dopo l'introduzione di cellule staminali ematopoietiche umane nella blastocisti. È stato accertato che le ESC pluripotenti circolano nel sangue degli embrioni di topo durante il periodo di formazione degli organi. È possibile che la loro funzione biologica risieda nell'organizzazione embrionale del futuro sistema immunitario. Con l'aiuto delle cellule staminali embrionali (ESC), sono stati riprodotti in laboratorio modelli adeguati di patologia genetica umana: il doppio knockout del gene della distrofina modella la distrofia muscolare di Duchenne nei topi e l'inibizione del gene atm (controllo della sintesi della chinasi del segnale della cromatina) - atassia-telangectasia. In questa malattia ereditaria fatale nei bambini, la degenerazione delle cellule di Purkinje nel cervelletto si sviluppa a causa di difetti nella riparazione del DNA, accompagnata da involuzione del timo dovuta alla morte delle cellule proliferanti. Il quadro clinico, la fisiopatologia e la patomorfologia dell'atassia-telangectasia, riprodotti introducendo informazioni genetiche patologiche nelle ESC, nei topi chimera corrispondono a quelli umani. Oltre all'atassia-telangectasia, utilizzando cellule staminali embrionali (ESC) e topi knockout, sono stati sviluppati modelli sperimentali di alcune malattie umane ereditarie omozigoti associate a patologie del metabolismo dei carboidrati e dei lipidi, al catabolismo degli amminoacidi e all'escrezione di rame e bilirubina, il che ha ampliato significativamente le capacità della medicina sperimentale nella fase di sperimentazione preclinica di nuovi metodi per il trattamento delle corrispondenti malattie umane.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Utilizzo di citoibridi di cellule staminali

Le cellule ibride ottenute dalla fusione di cellule staminali embrionali (ESC) con cellule somatiche rappresentano un modello adeguato e promettente per lo studio della pluripotenza delle cellule staminali e la riprogrammazione dei cromosomi delle cellule differenziate. I citoibridi ottenuti dalla fusione di cellule staminali embrionali (ESC) con cellule differenziate di un animale adulto permettono di studiare le relazioni tra genomi di diverse "età": una situazione unica si verifica quando cromosomi omologhi provenienti da cellule a diversi stadi di differenziazione e diversi gradi di maturità si trovano nello stesso nucleo, dove possono facilmente scambiarsi segnali regolatori transattivi. È difficile prevedere come i sistemi epigenetici cisregolatori dei cromosomi omologhi, formati durante lo sviluppo individuale, reagiranno all'influenza dei segnali transattivi provenienti dai genomi embrionali correlati. Inoltre, nelle cellule ibride avviene la segregazione dei cromosomi parentali, il che consente di studiare l'interazione dei genomi a livello dei singoli cromosomi, cioè di identificare potenzialmente la partecipazione di specifici cromosomi al mantenimento della pluripotenza o, viceversa, all'uscita dalla differenziazione.

I citoibridi ottenuti dalla fusione di cellule di teratocarcinoma pluripotenti e cellule somatiche differenziate sono stati utilizzati come primo modello sperimentale per studiare l'interazione di genomi con diverse "storie di sviluppo". In alcuni casi, tali cellule ibride hanno mantenuto proprietà pluripotenti a un livello piuttosto elevato. In particolare, le cellule ibride teratocarcinoma-soma in vivo hanno indotto lo sviluppo di veri teratomi contenenti derivati di tutti e tre i foglietti germinativi, e in vitro, in colture in sospensione, hanno formato corpi embrioidi. Anche nei citoibridi interspecifici di questo tipo, la presenza di antigeni embrionali è stata osservata nei casi in cui i partner somatici nella fusione con cellule di teratocarcinoma erano linfociti o timociti. È interessante notare che i citoibridi creati dalla fusione di cellule di teratocarcinoma con fibroblasti corrispondevano a fibroblasti nel fenotipo.

Il dato più importante accertato è che nelle cellule ibride di teratocarcinoma somatico sono comparsi segni di riprogrammazione del genoma cellulare differenziato, caratterizzata dalla riattivazione di singoli geni o del cromosoma X inattivo del partner somatico. Pertanto, i risultati degli studi sui citoibridi di tipo cellulare teratocarcinoma-somatico indicano che la pluripotenza è spesso preservata nelle cellule ibride e che sono presenti segni di riprogrammazione del genoma del partner somatico.

In esperimenti sull'ottenimento di cellule ibride embrionali intraspecifiche mediante fusione di cellule staminali embrionali (ESC) di topo con splenociti adulti, sono state studiate le caratteristiche di tali citoibridi, è stata analizzata la segregazione dei cromosomi parentali ed è stata valutata la pluripotenza del genoma ibrido. Le cellule ibride intraspecifiche ottenute dalla fusione di cellule di teratocarcinoma con cellule somatiche sono solitamente caratterizzate da un basso livello di segregazione cromosomica con un cariotipo tetraploide o quasi tetraploide. Una composizione cromosomica simile è stata osservata nei citoibridi durante la fusione di cellule germinali primarie con linfociti. Allo stesso tempo, le cellule ibride interspecifiche ottenute dalla fusione di cellule di teratocarcinoma di topo con linfociti di visone hanno mostrato un'intensa segregazione dei cromosomi del partner somatico.

Una fase qualitativamente nuova nello studio della segregazione dei cromosomi parentali negli ibridi intraspecifici è iniziata dopo lo sviluppo di un metodo per l'analisi dei microsatelliti mediante la reazione a catena della polimerasi, grazie al quale sono state trovate diverse centinaia di marcatori per ogni cromosoma di topo, consentendo una discriminazione affidabile di qualsiasi coppia di cromosomi omologhi nelle cellule ibride.

Fondendo cellule staminali embrionali (ESC) (cellule HM-1 carenti di attività ipoxantina fosforibosiltransferasi, 2n = 40, XY, isolate da blastocisti di topi 129/01a) con splenociti di topi DD/c congenici, è stato possibile ottenere un set di cloni ibridi morfologicamente simili alle ESC. Tutti i cloni sono stati isolati su un terreno selettivo in cui possono crescere solo cellule con ipoxantina fosforibosiltransferasi attiva. L'analisi elettroforetica ha mostrato che tutti i cloni presentavano una variante allelica dell'ipoxantina fosforibosiltransferasi caratteristica dei topi DD/c. L'analisi citogenetica ha mostrato che tre dei quattro cloni ibridi presentavano un corredo cromosomico quasi diploide. Un clone quasi tetraploide conteneva due popolazioni di cellule ibride, una delle quali era tetraploide e la seconda, più piccola, era diploide.

L'analisi microsatellitare, che consente la discriminazione di qualsiasi coppia di cromosomi omologhi dei topi 129/01a e DD/c, in cloni ibridi con un corredo quasi diploide ha mostrato che in due cloni si è verificata una chiara eliminazione preferenziale degli autosomi del partner somatico. La maggior parte degli autosomi nei cloni HESS2 e HESS3 presentava marcatori della linea 129/01a, ovvero il partner pluripotente. L'eccezione erano i cromosomi 1 e I: nei cloni HESS2 e HESS3, insieme ai marcatori delle cellule HM-1, erano presenti in piccole quantità marcatori del partner somatico. Tali risultati potrebbero riflettere una segregazione incompleta dei cromosomi 1 e I del partner somatico e sono coerenti con i dati citogenetici secondo cui la trisomia per questi cromosomi è osservata nel 30-40% delle cellule dei cloni HESS2 e HESS3. Il clone HESS4 differiva significativamente nella sua composizione cromosomica: molti autosomi in questo clone provenivano dal genoma delle cellule staminali embrionali (ESC) (cromosomi 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 e 17), ma i cromosomi 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 e 19 erano rappresentati da omologhi di entrambi i genitori. Il rapporto quantitativo dei microsatelliti che marcavano questi cromosomi omologhi era di circa 1:1. Ciò ha permesso agli autori di supporre che un omologo provenisse dal genoma delle cellule staminali embrionali (ESC) e l'altro da cellule differenziate. In alcuni sottocloni del clone HESS4, erano presenti solo marcatori dei cromosomi 18 e 19 del partner somatico. I risultati ottenuti indicano che nelle cellule del clone HESS4, oltre alla segregazione dei cromosomi del partner somatico, si è verificata l'eliminazione di uno o di entrambi gli omologhi dei cromosomi del genoma pluripotente sopra elencati, cioè si è verificata una segregazione bilaterale dei cromosomi di entrambi i genitori, un fenomeno del tutto insolito, poiché la segregazione dei cromosomi di uno solo dei genitori è caratteristica dei citoibridi.

Inoltre, dopo il 20° passaggio, tutti i cloni di cellule ibride contenevano solo marcatori del cromosoma X del partner somatico, ovvero il cromosoma X delle cellule staminali embrionali (ESC) era stato sostituito dal cromosoma X del partner somatico nei cloni. Questo importante fatto è confermato dai dati di ibridazione in situ ottenuti utilizzando una sonda marcata con FITC specifica per il cromosoma X murino: un segnale positivo è stato rilevato solo su un cromosoma. È importante notare che nelle fasi iniziali della coltivazione (prima del 15° passaggio), secondo i dati citogenetici, molte cellule contenevano due cromosomi X. Pertanto, l'uso di terreni selettivi consente di manipolare la composizione cromosomica delle cellule ibride e di selezionare selettivamente i cloni che trasportano singoli cromosomi del partner somatico sullo sfondo del genoma delle cellule staminali embrionali (ESC).

Poiché una caratteristica unica del genoma citoibrido è la localizzazione dei genomi parentali in un unico nucleo, sorge spontanea la domanda sulla preservazione delle proprietà pluripotenti del genoma embrionale negli ibridi di cellule staminali embrionali (ESC) e cellule somatiche in condizioni di stretto contatto con il genoma di una cellula differenziata. Morfologicamente, i citoibridi di cellule staminali embrionali (ESC) e cellule somatiche erano simili alla linea ESC parentale. La valutazione della pluripotenza ha mostrato che tutti i cloni con un corredo cromosomico quasi diploide erano in grado di formare corpi embrionali in colture in sospensione, in cui erano presenti derivati di tre foglietti germinali.

La maggior parte delle cellule ibride conteneva l'antigene ECMA-7, un marcatore caratteristico degli embrioni di topo in fase precoce, e presentava anche un'elevata attività della fosfatasi alcalina. I dati più convincenti sulle elevate proprietà pluripotenti delle cellule ibride sono stati ottenuti in esperimenti volti a ottenere una serie di chimere iniettate con cellule ibride del clone HESS2. L'analisi dei marcatori biochimici ha mostrato che i discendenti delle cellule ibride del donatore erano presenti nella maggior parte dei tessuti delle chimere. Pertanto, le cellule ibride ottenute dalla fusione di cellule staminali embrionali (ESC) e cellule somatiche differenziate mantengono un elevato livello di pluripotenza, inclusa la capacità di formare chimere una volta iniettate nella cavità della blastocisti.

I cloni HESS2 e HESS4 differivano significativamente nella composizione dei cromosomi parentali, ma presentavano proprietà pluripotenti simili. Si potrebbe supporre che la pluripotenza nel genoma ibrido si manifesti come un tratto dominante, ma è possibile che non tutti i cromosomi del genoma embrionale siano coinvolti nel processo di mantenimento della pluripotenza. Se questa ipotesi è corretta, allora ci si può aspettare che l'eliminazione di alcuni cromosomi del partner pluripotente dal genoma delle cellule ibride non sia accompagnata da una modifica del loro stato di pluripotenza. In questo caso, l'analisi della segregazione dei cromosomi parentali nelle cellule ibride embrionali ci consentirebbe di avvicinarci all'identificazione dei cromosomi responsabili del controllo della pluripotenza delle cellule embrionali.

O. Serov et al. (2001) non hanno trovato alcuna prole tra i 50 figli ottenuti incrociando chimere con topi normali con genotipo 129/01a e portatori del cromosoma X dei topi DD. Gli autori ritengono che ciò sia dovuto a una diminuzione della pluripotenza nelle cellule ibride sotto l'influenza del genoma somatico. Una spiegazione alternativa potrebbe essere l'effetto negativo della trisomia su alcuni autosomi e lo squilibrio dei cromosomi sessuali (XXY sono stati osservati nelle cellule fino al 15° passaggio) nelle cellule ibride durante la meiosi. È noto che le cellule XXY non sono in grado di andare incontro a meiosi e formare gameti. La trisomia può anche causare una diminuzione dell'attività proliferativa delle cellule ibride, per cui il vantaggio selettivo nello sviluppo delle chimere potrebbe appartenere alle cellule dell'embrione ricevente. Ne consegue che per una valutazione adeguata del potenziale pluripotente delle cellule ibride è necessario ottenere cloni ibridi con un normale corredo di cromosomi diploide.

Negli esperimenti di O. Serov e coautori (2001), è stata dimostrata per la prima volta la possibilità di riprogrammare il cromosoma X di una cellula somatica nel genoma di cellule ibride. Questa conclusione degli autori deriva dall'analisi dell'espressione del gene hprt (un marcatore del cromosoma X) nelle chimere: la presenza della variante allelica di hprt dei topi DD/c è stata rilevata in tutti i tessuti chimerici analizzati. È opportuno sottolineare che dopo l'introduzione delle cellule ibride nella cavità della blastocisti, i citoibridi cadono in condizioni non selettive e la conservazione del cromosoma X nel genoma delle cellule ibride significa che è diventato il suo componente obbligato e il genoma non lo discrimina dal cromosoma Y del partner pluripotente.

Riassumendo i risultati dell'analisi dell'interazione tra genomi somatici e pluripotenti nelle cellule embrionali ibride, gli autori concludono che in alcuni citoibridi la pluripotenza si manifesta come un tratto dominante. Il genoma ibrido è in grado di riprogrammare singoli cromosomi di cellule differenziate, il che, tuttavia, non esclude la possibilità di un effetto inverso del genoma somatico sulla pluripotenza del genoma embrionale. Quando si coltivano cellule ibride, l'induzione del differenziamento si verifica significativamente più spesso rispetto alla linea parentale originale di cellule staminali embrionali staminali (ESC) HM-1. Un effetto simile si osserva durante la formazione di colonie primarie: molte colonie primarie di cellule embrionali ibride si differenziano nelle fasi precoci della formazione con grandi perdite di cloni durante la loro selezione e riproduzione.

Pertanto, i citoibridi creati dalla fusione di cellule staminali embrionali (ESC) con cellule somatiche, nonostante lo stretto contatto con il genoma delle cellule differenziate, mantengono la pluripotenza come proprietà esclusiva del genoma embrionale. Inoltre, in tali cellule ibride è possibile la riprogrammazione di singoli cromosomi provenienti da cellule differenziate. Non è ancora chiaro in che misura le proprietà pluripotenti del genoma embrionale vengano mantenute nelle cellule ibride, in particolare la loro capacità di partecipare alla formazione della linea germinale nelle chimere. Ciò richiede l'ottenimento di cellule ibride embrionali con un cariotipo normale. In ogni caso, le cellule ibride embrionali pluripotenti possono diventare un vero e proprio modello genetico per l'identificazione dei cromosomi coinvolti nel mantenimento o nel controllo della pluripotenza, poiché la segregazione bilaterale dei cromosomi parentali offre potenzialmente tale opportunità.

Non meno interessante è lo studio del fenomeno che O. Serov et al. (2001) definiscono "memoria cromosomica". Nel genoma ibrido, i cromosomi omologhi si presentano in due configurazioni alternative: gli omologhi del partner somatico hanno già subito un differenziamento, mentre negli omologhi del partner pluripotente questo processo è appena iniziato. Di conseguenza, la conservazione di elevate proprietà pluripotenti da parte delle cellule ibride indica che la configurazione "pluripotente" degli omologhi delle ESC è sufficientemente stabile nel genoma ibrido, nonostante l'influenza dei fattori di transazione provenienti dal partner somatico. I segni di riprogrammazione dei cromosomi omologhi del genoma differenziato durante lo sviluppo delle chimere, sopra descritti, non escludono la possibilità che nelle prime fasi di formazione e coltivazione dei citoibridi in vitro, essi mantengano il loro status acquisito durante il differenziamento in vivo. Secondo dati recentemente ottenuti, quando le cellule ibride embrionali vengono trasferite in un ambiente non selettivo, mostrano un'eliminazione intensiva dei cromosomi del solo partner somatico, ovvero il genoma delle cellule ibride discrimina facilmente gli omologhi dopo 10-15 passaggi di coltura in vitro. Pertanto, le cellule ibride embrionali rappresentano un promettente modello sperimentale per lo studio non solo di una proprietà fondamentale del genoma embrionale come la pluripotenza, ma anche della sua alternativa: la differenziazione embrionale.

Efficacia terapeutica del trapianto di cellule staminali embrionali

Prima di analizzare l'efficacia terapeutica del trapianto di cellule staminali embrionali (ESC) e dei loro derivati, riassumiamo quanto sopra esposto. Le capacità delle ESC in termini di piena implementazione dell'embriogenesi in vitro sono insufficienti, poiché i difetti di sviluppo in questo caso sono dovuti all'assenza di cellule staminali mesenchimali, che si formano nell'organismo in modo autonomo e indipendente dalle ESC. Il potenziale genetico delle ESC è inferiore a quello dello zigote, pertanto le ESC non vengono utilizzate direttamente per la clonazione di embrioni. Il potenziale biologico unico delle ESC, in quanto uniche cellule in cui i programmi di sviluppo sono pienamente implementati in un'implementazione coerente, viene utilizzato negli studi sulla funzione genica. Con l'aiuto delle ESC, vengono decodificate le prime combinazioni di segnali che attivano l'espressione dei geni precoci e tardivi che codificano per lo sviluppo dei tre foglietti germinali. La preservazione della pluripotenza del genoma delle ESC in vitro le rende uno strumento unico per la rigenerazione riparativa, in grado di reintegrare automaticamente le perdite cellulari in caso di danno a organi e tessuti. In uno scenario ipotetico ideale, si può supporre che "... quando si trapiantano cellule staminali embrionali (ESC) da donatori, programmi compatti vengono trasferiti nel corpo del ricevente, i quali, in condizioni favorevoli, si realizzano nella costruzione di nuovo tessuto'7, in grado di "... essere efficacemente integrati nel corpo del ricevente sia a livello morfologico che funzionale".

Naturalmente, in seguito allo sviluppo di metodi per la monodifferenziazione delle cellule staminali embrionali (ESC), è iniziato lo studio in vivo dell'attività funzionale delle cellule ottenute in vitro da un clone specializzato. Un clone di ESC proliferante genera popolazioni di cellule progenitrici migranti realmente in grado di integrarsi attivamente nelle aree di danno tissutale del ricevente, un'applicazione utilizzata nella medicina plastica rigenerativa. È stato dimostrato che il trapianto di neuroni DOPA nella substantia nigra riduce le manifestazioni cliniche nell'emiparkinsonismo sperimentale. I trapianti regionali di cellule staminali neurali del donatore riducono l'entità dei disturbi motori causati da traumi o contusioni del midollo spinale e del cervello. Sono stati ottenuti anche i primi risultati positivi del trapianto di cellule staminali nelle malattie demielinizzanti. Sembrerebbe che il potenziale plastico rigenerativo delle ESC apra possibilità illimitate per l'uso del trapianto cellulare nella medicina pratica. Tuttavia, quando trapiantate in zone ectopiche, le ESC si trasformano inevitabilmente in tumori. I teratomi si formano quando le ESC vengono iniettate per via sottocutanea in topi immunodeficienti. Quando le sospensioni di cellule staminali embrionali (ESC) vengono trapiantate sotto la capsula del testicolo in topi singenici, si formano anche teratomi, costituiti da tessuti diversi, le cui cellule derivano da tutti e tre i foglietti germinali. In tali teratomi, i processi di organogenesi ridotta sono estremamente rari.

Numerosi studi forniscono informazioni sui risultati positivi del trapianto di derivati precoci di ESC in animali con patologia sperimentale. Il neurotrapianto cellulare con derivati di ESC è in fase di ulteriore sviluppo in esperimenti e nei primi studi clinici per correggere disturbi funzionali in lesioni cerebrali e spinali e per trattare siringomielia e sclerosi multipla (Repin, 2001). Con l'avvento della tecnica di neurogenesi in vitro da ESC, invece di utilizzare tessuto cerebrale embrionale, si stanno sviluppando metodi per il trapianto di derivati di neurosfere ottenuti da colture di tessuto nervoso embrionale. Tali sospensioni di trapianto sono significativamente più omogenee e contengono precursori di neuroni e neuroglia.

Con l'aggiunta regolare di acido retinoico alla dose di 10 μg/ml al terreno di coltura per 6 settimane, si forma oltre l'80% dei neuroni postmitotici nella linea di carcinoma embrionale (terato) umano NTERA-2. La completa omogeneità della popolazione neuronale si ottiene mediante il flow sorting dei neuroni maturi marcati con marcatori immunofenotipici, che consente di eliminare i resti di teratocarcinoma e le cellule immature. Dopo il trapianto in diverse regioni cerebrali di animali da esperimento, tali neuroni non solo sopravvivono, ma si integrano anche nelle reti neurali regionali. Negli animali con modelli sperimentali di difetti locali del sistema nervoso centrale, il neurotrapianto riduce le manifestazioni cliniche di patologie umane come le conseguenze di traumi cranici, ictus, malattie demielinizzanti, difetti ereditari nello sviluppo del cervelletto e malattie da deposito di lipidi e polisaccaridi.

Per ottimizzare i processi di rigenerazione nelle malattie degenerative del sistema nervoso centrale, si stanno sviluppando tecnologie per ottenere oligodendrociti mielinici dalle cellule staminali embrionali (ESC). La prima fase prevede tradizionalmente la proliferazione delle ESC con la riproduzione del numero di cellule necessarie per il trapianto. Nella seconda fase, viene effettuata la differenziazione mirata delle cellule in una popolazione di precursori degli oligodendrociti mielinici, controllata da antigeni marcatori selettivi.

Si aprono nuove prospettive per l'utilizzo dei derivati delle cellule staminali embrionali (ESC) nello sviluppo di metodi per la correzione delle immunodeficienze causate da difetti genetici nella maturazione del timo. In studi su topi knockout (rag 1) con un difetto genetico indotto – un'alterazione del meccanismo di ricombinazione dei loci V(D)J dei geni TCR, che porta alla perdita della funzione dei linfociti T – il trapianto di derivati precoci delle ESC nel timo degli animali ripristina la maturazione di popolazioni normali di cloni immunitari responsabili dell'immunità cellulare. Sono in corso studi clinici sul trapianto di cellule staminali embrionali (ESC) preformate in vitro per il trattamento di anemie ereditarie fatali nei bambini.

Le obiezioni alla rapida introduzione del trapianto di cellule staminali in clinica si basano sul numero limitato di linee stabili di cellule staminali embrionali umane e sulla necessità della loro standardizzazione. Per aumentare la purezza delle linee ESC standardizzate, così come delle cellule staminali umane adulte, si propone di utilizzare un metodo di selezione delle linee basato sull'analisi genetica molecolare di brevi ripetizioni tandem di DNA. È inoltre necessario testare le linee ESC per la presenza di piccoli riarrangiamenti cromosomici e mutazioni genetiche, la cui probabilità di verificarsi in condizioni di coltura cellulare è piuttosto elevata. Viene avanzata una tesi sull'obbligatorietà della verifica delle proprietà di tutti i tipi di ESC e cellule staminali pluripotenti regionali, poiché la loro riproduzione in vitro può portare all'emergere di nuove caratteristiche non inerenti alle cellule staminali embrionali o ai tessuti definitivi. In particolare, si presume che la coltivazione a lungo termine in terreni di coltura con citochine avvicini le linee ESC alle cellule tumorali, poiché subiscono cambiamenti simili nelle vie di regolazione del ciclo cellulare con l'acquisizione della capacità di effettuare un numero illimitato di divisioni cellulari. Alcuni autori, basandosi sul potenziale di sviluppo tumorale, considerano il trapianto di derivati di cellule staminali embrionali precoci nell'uomo un'operazione avventata. A loro avviso, è molto più sicuro utilizzare discendenti dedicati di cellule staminali embrionali (ESC), ovvero linee di progenitori cellulari differenziati. Tuttavia, al momento, non è ancora stata sviluppata una tecnica affidabile per ottenere linee cellulari umane stabili che differenzino nella direzione desiderata.

Pertanto, in letteratura compaiono sempre più dati sull'effetto terapeutico positivo del trapianto di derivati di cellule staminali embrionali umane. Tuttavia, molti di questi studi sono oggetto di revisione e critica. Alcuni ricercatori ritengono che i risultati dei primi studi clinici siano di natura preliminare e indichino solo che le cellule staminali sono in grado di esercitare un effetto favorevole sul decorso clinico di una particolare malattia. Pertanto, è necessario ottenere dati sui risultati remoti del trapianto cellulare. Le fasi di sviluppo della neurotrapiantologia clinica vengono citate come argomento. Infatti, inizialmente, in letteratura prevalevano le pubblicazioni sull'elevata efficacia del trapianto di frammenti cerebrali embrionali nella malattia di Parkinson, ma poi hanno iniziato ad apparire rapporti che negavano l'efficacia terapeutica del tessuto nervoso embrionale o fetale trapiantato nel cervello dei pazienti.

I primi studi clinici sono stati condotti per valutare la sicurezza del trapianto di neuroblasti derivati da cellule staminali embrionali (ESC) di teratocarcinoma NTERA-2, le cui cellule immature sono state sottoposte a proliferazione in coltura fino all'accumulo di una massa cellulare di 100 milioni. Alcune delle cellule ottenute in questo modo sono state utilizzate per caratterizzare il fenotipo e determinare le impurità cellulari, nonché per testare la possibile contaminazione da virus e batteri. Il LIF e lo strato feeder di cellule stromali fetali sono stati rimossi dal terreno di coltura e sono state create le condizioni per la differenziazione mirata delle ESC in neuroblasti utilizzando una combinazione di citochine e fattori di crescita. Successivamente, i neuroblasti sono stati purificati dalle cellule immature di teratocarcinoma su un separatore cellulare a flusso. Dopo la purificazione secondaria e la caratterizzazione fenotipica delle cellule trapiantate, una sospensione di neuroblasti (10-12 milioni) è stata iniettata nel nucleo basale del cervello dei pazienti (al settimo mese dall'ictus emorragico) utilizzando una microcannula e una siringa speciali sotto controllo stereotassico e tomografico computerizzato. Lo screening post-trapianto a un anno delle conseguenze del trapianto di neuroni nella zona dell'ictus non ha rivelato effetti collaterali o indesiderati. Metà dei pazienti ha mostrato un miglioramento della funzione motoria nel periodo compreso tra 6 e 12 mesi dopo il trapianto. I cambiamenti clinici positivi sono stati accompagnati da un maggiore apporto di sangue alla zona dell'ictus dopo il trapianto cellulare: l'aumento medio dell'assorbimento di 2-desossiglucosio marcato con fluorescenza, secondo la tomografia a emissione di positroni, ha raggiunto il 18% e in alcuni pazienti il 35%.

Tuttavia, il National Institutes of Health statunitense ha condotto uno studio indipendente sull'efficacia clinica del neurotrapianto in pazienti affetti da parkinsonismo. Ai pazienti del primo gruppo sono state trapiantate sezioni di tessuto nervoso embrionale che producono dopamina, mentre il secondo gruppo di pazienti è stato sottoposto a un intervento chirurgico simulato. I risultati indicano un'efficacia clinica nulla di tale neurotrapianto, nonostante il fatto che i neuroni embrionali produttori di dopamina siano sopravvissuti nel cervello dei riceventi. Inoltre, 2 anni dopo il trapianto di tessuto nervoso embrionale, il 15% dei pazienti ha sviluppato discinesia persistente, assente nei pazienti del gruppo placebo (Cellule staminali: progressi scientifici e direzioni future della ricerca. Nat. Institute of Health. USA). Sono in corso osservazioni sull'ulteriore sviluppo della malattia in questi pazienti.

Alcuni autori collegano i dati contraddittori della letteratura sulla valutazione dell'efficacia clinica del neurotrapianto a diversi approcci nella selezione dei gruppi di pazienti, alla scelta inadeguata dei metodi per la valutazione oggettiva delle loro condizioni e, soprattutto, a diversi periodi di sviluppo del tessuto nervoso embrionale e a diverse aree del cervello da cui tale tessuto è stato ottenuto, a diverse dimensioni del trapianto e a caratteristiche metodologiche dell'intervento chirurgico.

È importante notare che i tentativi di trapianto diretto di cellule staminali embrionali pluripotenti nella regione striatale del cervello di ratti con emiparkinsonismo sperimentale sono stati accompagnati dalla proliferazione delle cellule staminali embrionali (ESC) e dalla loro differenziazione in neuroni dopaminergici. Si deve presumere che i neuroni neoformati siano stati effettivamente integrati nelle reti neurali, poiché dopo il trapianto di ESC è stata osservata la correzione delle anomalie comportamentali e dell'asimmetria motoria nel test dell'apomorfina. Allo stesso tempo, alcuni animali sono morti a causa della trasformazione delle ESC trapiantate in tumori cerebrali.

Gli esperti delle Accademie nazionali e mediche degli USA, specialisti del National Institute of Health degli USA ritengono che il potenziale clinico delle cellule staminali embrionali (ESC) meriti la massima attenzione, ma insistono sulla necessità di uno studio dettagliato delle loro proprietà, della probabilità di complicazioni e delle conseguenze a lungo termine negli esperimenti su modelli biologici adeguati di malattie umane (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press.; Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

Da questo punto di vista, è importante che un'analisi istologica comparativa di teratomi sperimentali ottenuti mediante trapianto di sospensione di cellule staminali embrionali (ESC) nel testicolo con teratomi formatisi a seguito del trapianto di un embrione precoce, anch'esso contenente ESC, abbia dimostrato che le ESC, indipendentemente dalla loro origine o dall'interazione con determinate cellule circostanti, esplicano il loro potenziale tumorigenico allo stesso modo. È stato dimostrato che tali teratomi hanno un'origine clonale, poiché tumori costituiti da derivati di tutti e tre i foglietti germinativi possono derivare da una singola ESC (Rega, 2001). È degno di nota il fatto che, quando le ESC clonate con cariotipo normale venivano trapiantate in topi immunodeficienti, si formavano anche teratomi costituiti da diversi tipi di cellule somatiche differenziate. Questi dati sperimentali costituiscono una prova inconfutabile dell'origine clonale dei teratomi. Dal punto di vista della biologia dello sviluppo, indicano che non più cellule progenitrici impegnate, ma una singola cellula staminale pluripotente agisce come fonte di derivati differenziati di tutti e tre i foglietti germinativi che costituiscono un teratoma. Tuttavia, nel percorso verso il trapianto cellulare pratico, i risultati di questi studi rappresentano, se non un ostacolo, un segnale di allarme di potenziale pericolo, poiché l'inoculazione di cellule staminali embrionali (ESC) o cellule germinali primordiali (CEG) in vari tessuti di topi adulti immunodeficienti causa inevitabilmente lo sviluppo di tumori a partire dalle cellule staminali trapiantate. La degenerazione neoplastica delle ESC trapiantate ectopicamente è accompagnata dalla comparsa di popolazioni satellite di cellule differenziate, dovute alla differenziazione parziale delle ESC e dei cloni progenitori in linee specializzate. È interessante notare che, quando le ESC vengono trapiantate nei muscoli scheletrici, i neuroni si formano più spesso accanto alle cellule di teratocarcinoma. Tuttavia, l'introduzione di ESC in un ovulo in divisione o in una blastocisti è accompagnata dalla completa integrazione delle cellule nell'embrione senza la formazione di elementi neoplastici. In questo caso, le ESC vengono integrate praticamente in tutti gli organi e i tessuti dell'embrione, incluso il primordio genitale. Tali animali allofene sono stati ottenuti per la prima volta introducendo cellule di teratocarcinoma 129 in embrioni precoci allo stadio di 8-100 cellule. Nei topi allofene, popolazioni di cellule eterogenee derivate da cellule staminali embrionali (ESC) del donatore vengono integrate nei tessuti del midollo osseo, dell'intestino, della pelle, del fegato e dei genitali, il che rende possibile la creazione di chimere cellulari interspecie nell'esperimento. Più breve è il periodo di sviluppo dell'embrione precocissimo, maggiore è la percentuale di chimerizzazione cellulare, con il più alto grado di chimerizzazione osservato nel sistema emopoietico, nella pelle, nel sistema nervoso, nel fegato e nell'intestino tenue dell'embrione allofene. In un organismo adulto, i tessuti protetti dal sistema immunitario del ricevente da barriere istoematiche sono suscettibili alla chimerizzazione:Il trapianto di cellule germinali primarie nel parenchima testicolare è accompagnato dall'incorporazione di cellule staminali del donatore nello strato germinale del ricevente. Tuttavia, quando si trapiantano cellule staminali embrionali (ESC) in una blastocisti, non si verifica la formazione di rudimenti chimerici degli organi sessuali con la generazione di cellule germinali primarie del donatore. La pluripotenza delle ESC, quando si creano condizioni speciali, può essere utilizzata anche per la clonazione: il trapianto di cellule staminali embrionali (ESC) di topo in un embrione di topo di 8-16 cellule, in cui le mitosi cellulari sono bloccate dalla citocalsina, promuove l'implementazione di una normale embriogenesi con lo sviluppo di un embrione da cellule staminali embrionali (ESC) del donatore.

Pertanto, un'alternativa al trapianto allogenico di cellule staminali embrionali (ESC) è la clonazione terapeutica basata sul trapianto di nuclei di cellule somatiche in un ovulo enucleato per creare una blastocisti, dalla cui massa cellulare interna vengono poi isolate linee di cellule staminali embrionali (ESC) geneticamente identiche al donatore del nucleo somatico. Tecnicamente, questa idea è piuttosto fattibile, poiché la possibilità di creare linee di ESC da blastocisti ottenute dopo il trapianto di nuclei somatici in ovulo enucleato è stata ripetutamente dimostrata in esperimenti su animali da laboratorio (Nagy, 1990; Munsie, 2000). In particolare, in topi omozigoti per la mutazione del gene rag2, fibroblasti ottenuti coltivando cellule del tessuto sottoepidermico sono stati utilizzati come donatori di nuclei, che sono stati trapiantati in ovociti enucleati. Dopo l'attivazione dell'ovocita, lo "zigote" è stato coltivato fino alla formazione della blastocisti, dalla cui massa cellulare interna sono state isolate le cellule staminali embrionali (ESC) e trasferite a una linea di cellule nullizigoti per il gene mutante (rag2~/~). La mutazione di un gene allelico è stata corretta in tali ESC mediante il metodo della ricombinazione omologa. Nella prima serie di esperimenti, i corpi embrionali sono stati ottenuti da ESC con un gene ricombinante ripristinato, le loro cellule sono state trasfettate con un retrovirus ricombinante (HoxB4i/GFP) e, dopo la riproduzione, sono state iniettate nella vena di topi rag2~/~. Nella seconda serie, i blastomeri tetraploidi sono stati aggregati con ESC geneticamente modificate e trapiantati in femmine riceventi. I topi immunocompetenti risultanti sono stati utilizzati come donatori di midollo osseo per il trapianto in topi mutanti rag2~/~. In entrambe le serie il risultato è stato positivo: dopo 3-4 settimane, in tutti i topi sono state riscontrate cellule mieloidi e linfoidi normali e mature, capaci di produrre immunoglobuline. Pertanto, il trapianto di nuclei di cellule somatiche in ovociti può essere utilizzato non solo per ottenere linee di cellule staminali embrionali (ESC), ma anche per la citogenoterapia, ovvero la correzione di anomalie ereditarie, utilizzando le ESC come vettore per il trasporto di informazioni genetiche correttive. Tuttavia, questa direzione del trapianto cellulare, oltre ai problemi bioetici, presenta i suoi limiti. Non è chiaro quanto sia sicuro il trapianto di cellule clonate terapeuticamente con un genotipo identico a quello di uno specifico paziente, poiché tali cellule possono introdurre mutazioni che predispongono ad altre malattie. Gli ovuli umani normali rimangono un oggetto di difficile accesso, mentre anche con il trapianto di nuclei somatici in ovuli animali enucleati, solo il 15-25% degli "zigoti" ottenuti raggiunge lo stadio di blastocisti. Non è ancora stato determinato quante blastocisti siano necessarie per ottenere una linea di cellule staminali embrionali clonate pluripotenti. Vale la pena sottolineare anche l'elevato livello di costi finanziari associati alla complessità della metodologia di clonazione terapeutica.

In conclusione, va notato che nelle cellule staminali embrionali (ESC), la pluripotenza del genoma con DNA ipometilato si combina con un'elevata attività telomerasica e una breve fase C^ del ciclo cellulare, che ne garantisce una riproduzione intensiva e potenzialmente infinita, durante la quale le ESC mantengono un corredo cromosomico diploide e un corredo fenotipico "giovanile". La crescita clonale delle ESC in coltura non interferisce con il loro differenziamento in alcuna linea cellulare specializzata dell'organismo quando la proliferazione viene bloccata e vengono aggiunti opportuni segnali regolatori. Il differenziamento di restrizione delle ESC in linee cellulari somatiche in vitro si realizza senza la partecipazione del mesenchima, bypassando i Nochteys, al di fuori dell'organogenesi e senza formazione embrionale. L'introduzione ectopica di ESC in vivo porta inevitabilmente alla formazione di teratocarcinomi. Il trapianto di ESC in una blastocisti o in un embrione precoce è accompagnato dalla loro integrazione con i tessuti embrionali e dalla chimerizzazione stabile dei suoi organi.

Le tecnologie di rigenerazione plastica basate sul trapianto cellulare rappresentano il punto di incontro degli interessi di rappresentanti della biologia cellulare, della biologia dello sviluppo, della genetica sperimentale, dell'immunologia, della neurologia, della cardiologia, dell'ematologia e di molte altre branche della medicina sperimentale e pratica. I risultati più importanti degli studi sperimentali dimostrano la possibilità di riprogrammare le cellule staminali modificandone miratamente le proprietà, aprendo nuove prospettive per il controllo dei processi di citodifferenziazione mediante fattori di crescita, per la rigenerazione miocardica, il ripristino delle lesioni del sistema nervoso centrale e la normalizzazione della funzionalità dell'apparato insulare del pancreas. Tuttavia, per l'introduzione diffusa del trapianto di derivati delle cellule staminali embrionali (ESC) nella medicina pratica, è necessario studiare più approfonditamente le proprietà delle cellule staminali umane e proseguire la sperimentazione con le ESC su modelli sperimentali di malattia.

Questioni bioetiche e il problema del rigetto di un trapianto di cellule allogeniche potrebbero essere risolti dalla scoperta della plasticità del genoma delle cellule staminali regionali di un organismo adulto. Tuttavia, le informazioni iniziali secondo cui, trapiantando nel fegato cellule autologhe emopoietiche isolate e accuratamente caratterizzate, da cui si derivano nuovi epatociti che si integrano nei lobuli epatici, sono ora oggetto di revisione e critica. Ciononostante, sono stati pubblicati dati secondo cui il trapianto di cellule staminali neurali nel timo provoca la formazione di nuovi germogli di linfociti T e B del donatore, e il trapianto di cellule staminali neurali cerebrali nel midollo osseo porta alla formazione di germogli emopoietici con mielo- ed eritropoiesi del donatore a lungo termine. Di conseguenza, cellule staminali pluripotenti in grado di riprogrammare il genoma al potenziale delle cellule staminali endoteliali (ESC) possono persistere negli organi di un organismo adulto.

La fonte per ottenere le cellule staminali embrionali (ESC) a fini medici rimane l'embrione umano, che predetermina l'inevitabilità di una nuova intersezione di questioni morali, etiche, legali e religiose al momento dell'origine della vita umana. La scoperta delle ESC ha dato un forte impulso alla ripresa di difficili discussioni sul confine tra cellule viventi e materia, tra essere e personalità. Allo stesso tempo, non esistono norme, regole e leggi universali riguardanti l'uso delle ESC in medicina, nonostante i ripetuti tentativi di crearle e adottarle. Ogni stato, nell'ambito della propria legislazione, risolve questo problema in modo indipendente. Da parte loro, i medici di tutto il mondo continuano a cercare di portare la medicina plastica rigenerativa al di fuori di tali discussioni, principalmente attraverso l'uso di riserve di cellule staminali adulte anziché di cellule staminali embrionali.

Un po' di storia sull'isolamento delle cellule staminali embrionali

Cellule di terato(embrio)carcinoma sono state isolate da teratomi testicolari spontanei di topi 129/ter-Sv, da teratomi ovarici spontanei di topi Lt/Sv e da teratomi derivati da cellule o tessuti embrionali trapiantati ectopicamente. Tra le linee cellulari stabili di terato(embrio)carcinoma murino ottenute in questo modo, alcune erano pluripotenti, altre si differenziavano solo in uno specifico tipo cellulare e alcune erano completamente incapaci di citodifferenziazione.

Un tempo l'attenzione era rivolta a studi i cui risultati indicavano la possibilità di riportare le cellule del terato-(embrio)-carcinoma a un fenotipo normale dopo la loro introduzione nei tessuti di un embrione in via di sviluppo, nonché al lavoro sulla creazione in vitro di cellule del terato-(embrio)-carcinoma geneticamente modificate, con l'aiuto delle quali venivano ottenuti topi mutanti per la modellazione biologica della patologia ereditaria umana.

La coltura in sospensione condizionata è stata utilizzata per isolare linee cellulari di terato-(embrio)-carcinoma. In coltura, le cellule di terato-(embrio)-carcinoma, come le cellule staminali embrionali (ESC), crescono fino a formare corpi embrioidi e richiedono una dissociazione obbligatoria per il trasferimento di linea, mantenendo la pluripotenza su uno strato di fibroblasti embrionali o durante la coltura in sospensione in un mezzo condizionato. Le cellule delle linee di terato-(embrio)-carcinoma pluripotenti sono grandi, sferiche, caratterizzate da un'elevata attività della fosfatasi alcalina, formano aggregati e sono capaci di differenziazione multidirezionale. Una volta introdotte in una blastocisti, si aggregano con la morula, il che porta alla formazione di embrioni chimerici, nella composizione di vari organi e tessuti di cui si trovano derivati di cellule di terato-(embrio)-carcinoma. Tuttavia, la stragrande maggioranza di questi embrioni chimerici muore in utero e negli organi delle chimere neonate sopravvissute, le cellule estranee vengono raramente rilevate e a bassa densità. Allo stesso tempo, l'incidenza dei tumori (fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, altri tipi di tumori maligni e adenoma pancreatico) aumenta rapidamente e la degenerazione tumorale si verifica spesso durante il periodo di sviluppo intrauterino degli embrioni chimerici.

La maggior parte delle cellule di terato-(embrio)carcinoma nel microambiente delle cellule embrionali normali acquisisce quasi naturalmente caratteristiche neoplastiche maligne. Si ritiene che la malignità irreversibile sia dovuta all'attivazione di proto-oncogeni nel processo di riarrangiamenti strutturali. Un'eccezione sono le cellule della linea di embriocarcinoma SST3, ottenute da teratomi testicolari di topo (linea 129/Sv-ter), che mostrano un'elevata capacità di integrarsi nei tessuti e negli organi dell'embrione senza successiva formazione tumorale nei topi chimerici. I derivati delle linee cellulari di terato-(embrio)carcinoma nei topi chimerici non partecipano praticamente alla formazione di gonociti primari. Apparentemente, ciò è dovuto all'elevata frequenza di aberrazioni cromosomiche caratteristiche della maggior parte delle linee di terato-(embrio)carcinoma, nelle cui cellule si osservano sia aneuploidie che anomalie cromosomiche.

In laboratorio sono state ottenute diverse linee stabili di cellule di terato-(embrio)-carcinoma umano caratterizzate da pluripotenza, elevata attività proliferativa e capacità di differenziarsi durante la crescita in coltura. In particolare, la linea di cellule di terato-(embrio)-carcinoma umano NTERA-2 è stata utilizzata per studiare i meccanismi di citodifferenziazione neuronale. Dopo il trapianto di cellule di questa linea nella regione subventricolare del proencefalo di ratti neonati, ne sono state osservate la migrazione e la neurogenesi. Sono stati persino effettuati tentativi di trapianto di neuroni ottenuti da colture cellulari della linea di terato-(embrio)-carcinoma NTERA-2 in pazienti con ictus, il che, secondo gli autori, ha portato a un miglioramento del decorso clinico della malattia. Allo stesso tempo, non si sono verificati casi di malignità delle cellule trapiantate della linea di terato-(embrio)-carcinoma NTERA-2 in pazienti con ictus.

Le prime linee di cellule staminali embrionali pluripotenti indifferenziate di topo furono ottenute nei primi anni '80 da Evans e Martin, che le isolarono dalla massa cellulare interna della blastocisti, l'embrioblasto. Le linee ESC isolate mantennero a lungo la pluripotenza e la capacità di differenziarsi in vari tipi cellulari sotto l'influenza di fattori in uno speciale terreno di coltura.

Il termine "cellula staminale embrionale pluripotente" appartiene a Leroy Stevens, il quale, studiando l'effetto del catrame di tabacco sull'incidenza dello sviluppo tumorale, attirò l'attenzione sulla comparsa spontanea di teratocarcinoma testicolare nei topi lineari (129/v) del gruppo di controllo. Le cellule dei teratocarcinomi testicolari erano caratterizzate da un elevato tasso di proliferazione e, in presenza di fluido proveniente dalla cavità addominale, si differenziavano spontaneamente con la formazione di neuroni, cheratinociti, condrociti, cardiomiociti, nonché frammenti di peli e ossa, ma senza alcun segno di citoarchitettura ordinata del tessuto corrispondente. Una volta poste in coltura, le cellule di teratocarcinoma crescevano come cloni pluripotenti staccati dal substrato e formavano corpi embrionali, dopodiché cessavano di dividersi e subivano una differenziazione spontanea disordinata in neuroni, cellule gliali, cellule muscolari e cardiomiociti. Stevens ha scoperto che il teratocarcinoma 129/v di topo contiene meno dell'1% di cellule capaci di differenziarsi in una varietà di linee somatiche specializzate e che la differenziazione stessa dipende dai fattori che le influenzano (la composizione del liquido peritoneale, i prodotti delle cellule mature o i tessuti aggiunti alla coltura). L'ipotesi di Leroy Stevenson sulla presenza di cellule progenitrici embrionali della linea germinale tra le cellule di teratocarcinoma è stata confermata: una sospensione di cellule embrioblastiche provenienti da embrioni preimpianto nei tessuti di topi adulti ha formato teratocarcinomi e linee cellulari pure isolate da esse dopo somministrazione intraperitoneale ad animali riceventi si sono differenziate in neuroni, cardiomiociti e altre cellule somatiche derivate da tutti e tre i foglietti germinativi. In esperimenti in vivo, il trapianto di cellule staminali embrionali (ESC) (ottenute dall'embrioblasto, ma non dal trofoblasto) in embrioni di topo di un'altra linea agli stadi di blastomero 8-32 ha portato alla nascita di animali chimerici (senza sviluppo di tumori), nei cui organi sono stati trovati germogli di tessuto donatore. Il chimerismo è stato osservato anche nella linea cellulare germinale.

Le cellule germinali progenitrici primarie isolate dal rudimento genitale di un embrione di topo corrispondevano per morfologia, fenotipo immunologico e caratteristiche funzionali alle cellule staminali embrionali (ESC) ottenute da Stevenson da teratocarcinoma ed embrioblasto. Nelle chimere nate dopo l'introduzione delle ESC in una blastocisti, la morfogenesi allofenica degli organi era caratterizzata da un'alternanza a mosaico di unità strutturali e funzionali del donatore e del ricevente a livello di fegato, polmoni e reni. In alcuni casi, è stata osservata la formazione di cripte intestinali o lobuli epatici costituiti sia da cellule del ricevente che da cellule del donatore. Tuttavia, la morfogenesi si è sempre realizzata secondo il programma genetico della specie a cui apparteneva il ricevente e il chimerismo era limitato esclusivamente al livello cellulare.

Fu poi stabilito che la proliferazione delle cellule staminali embrionali (ESC) senza citodifferenziazione su uno strato di cellule derivate dal mesenchima (fibroblasti fetali) avviene con la presenza obbligatoria di LIF in terreni nutritivi selettivi, che garantiscono selettivamente la sopravvivenza solo delle cellule staminali e progenitrici, mentre la stragrande maggioranza degli elementi cellulari specializzati muore. Utilizzando tali metodi, nel 1998 James Thomson isolò cinque linee immortalizzate di cellule staminali embrionali dalla massa cellulare interna di una blastocisti umana. Nello stesso anno, John Gerhart sviluppò un metodo per isolare linee di ESC immortali dal tubercolo genitale di embrioni umani di quattro-cinque settimane di vita. Grazie alle loro proprietà uniche, appena due anni dopo, le cellule staminali embrionali e le cellule staminali dei tessuti definitivi iniziarono a essere utilizzate nella pratica della medicina rigenerativa e della terapia genica.