Cellule staminali embrionali

La scoperta delle cellule staminali embrionali - non c'era nessun incidente, ed è apparso sulla ricerca terreno preparato nel campo della ricerca biologia dello sviluppo. Il termine "cellula staminale" fu introdotto in medicina fin dal 1908 al congresso della società ematologica a Berlino da Alexander Maksimov in connessione con cellule ematopoietiche. Molto prima che l'isolamento e la preparazione di linee stabili di cellule staminali embrionali pluripotenti nello sviluppo iniziale del processo di ricerca utilizzato staminali terato- (cellule embrione-carcinoma con cui ha studiato i meccanismi sconosciuti di embriogenesi, compresa la sequenza dell'espressione dei geni precoci e prodotti proteici del loro lavoro.

Ma la totipotenza del genoma umano è irreparabilmente perduta nel processo evolutivo? No, e l'embriogenesi è una prova. Se è così, allora quando, in linea di principio, si realizzerà la seconda via dello sviluppo evolutivo? Probabilmente, quando una persona lascia il Cosmo, dove le condizioni ambientali saranno relativamente costanti per un periodo piuttosto lungo. Perdita ossea (demineralizzazione ossea in uno stato senza peso) rimodellamento molto lentamente trattabili e rigenerazione può essere considerato come il primo passo di processo di adattamento umano come specie dell'esistenza nello spazio. Tuttavia, il pagamento per il secondo percorso di sviluppo evolutivo sarà diverso: la sterilità sarà il prezzo da pagare a tutte le cellule della totipotenza e della plasticità assoluta. Quindi moltiplicarsi in questo mondo di "camaleonti evolutivi" non avrà meiosi, otpochkovaniem. Ma vivremo a lungo. L'immortalità della telomerasi è l'immortalità dell'ameba. In un organismo multicellulare, le cellule staminali sono il substrato della longevità quantitativa e qualitativa.

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Fonti di cellule staminali embrionali

Fonti Oggi di cellule staminali embrionali per i test di laboratorio sono Linea murino teratocarcinoma (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) e teratocarcinoma umano (NTERA-2, TERA-2 , H-9 clone), così come Hess Trauneona. Tuttavia, la presenza dettagliato passaporto cellulare indicando fenotipo immunitario, risultati dell'analisi cromosoma di profili di espressione di mRNA esposti recettori e proteine segnalazione intracellulare non compensare svantaggi significativi teratokartsinomnyh linee ESC - rapida perdita di totipotenza e impossibilità di applicazione negli studi clinici, e differenziazione misto in cultura è molto difficile isolare linea puramente specializzata da una popolazione eterogenea di cellule. Pertanto, di solito una sorgente linee ESC prodotti per scopi clinici, serve come la massa cellulare interna della blastocisti, embrioni singoli blastomeri di fase 8 cellule di sviluppo, cellule morula fasi successive, e cellule germinali primarie.

Va notato che le cellule di teratocarcinoma, sebbene abbiano la proprietà di pluripotenza, hanno un potenziale pluripotente significativamente più basso rispetto all'ESC. La loro integrazione con le cellule embrionali raramente porta alla formazione di chimere, nelle quali, inoltre, non si formano mai gameti con un genotipo di cellule di teratocarcinoma. Si ritiene che ciò sia dovuto alla frequente comparsa di anomalie cromosomiche nella coltivazione delle cellule di teratocarcina: una perdita del cromosoma Y, una varietà di trisomia, delezioni o traslocazioni.

I tentativi di distinguere la linea umana dell'ESC sono stati intrapresi molte volte, ma questo compito non può essere risolto poiché le normali blastocisti umane sono difficili da accedere agli oggetti. Inoltre, negli esseri umani, la frequenza delle anomalie cromosomiche è maggiore rispetto all'embriogenesi degli animali. La maggioranza predominante dei primi embrioni umani ottenuti dopo la fecondazione in vitro mostra il mosaicismo cromosomico caotico e spesso ci sono aberrazioni numeriche e strutturali. Anche più tardi, allo stadio di blastocisti, solo il 20-25% degli embrioni umani è costituito da cellule con un cariotipo normale. Era quasi impossibile usare tali embrioni per creare un ESC, dal momento che gli zigoti venivano solitamente coltivati agli stadi di due o quattro blastomeri e poi trapiantati nell'utero. Solo relativamente di recente è stata sviluppata una tecnica affidabile per la coltivazione di ovuli umani fecondati allo stadio di blastocisti. L'introduzione di questa tecnica nella pratica della fecondazione in vitro non solo ha aumentato la frequenza degli esiti positivi dell'impianto, ma ha anche reso le blastocisti normali un oggetto più accessibile.

Un'altra fonte di cellule staminali pluripotenti è cellule sessuali primarie, che, in contrasto con le popolazioni progenitrici più avanzati germenativnogo epitelio, non sono sulla superficie della beta-integrina, ma esprimono elevata attività shelochnoy fosfatasi. Va notato che nell'esperimento della popolazione di cellule staminali che si formano dalle cellule germinali primordiali sono studiati con i 80-zioni del secolo scorso. Allo stesso tempo, è stato progettato e cellule germinali primordiali selezione usate da topo embrionale gonadi germe. I primi risultati infruttuosi di coltura di cellule germinali primordiali in vitro suggerisce l'inutilità di questi sforzi, come le cellule, anche se è sopravvissuto, ma non proliferano e morì entro il primo giorno. Successivamente si è constatato che le cellule germinali murine primarie proliferano in vitro in presenza di un solo nel mezzo di coltura di fattori di crescita specifici polipeptidi solubili e legati alla membrana. Numerosi studi hanno indicato che sia necessaria la presenza nel terreno di coltura non solo LIF, ma membrannosvyazannyh e fattore acciaio solubile (SIF) per la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule germinali primordiali. Questi peptidi sono prodotte da embrioni di cellule somatiche omozigoti per la mutazione d'Acciaio, e uno di loro è un ligando del CKIT proto-oncogene.

Le cellule germinali primarie di mammiferi e umani sono di origine extragonadale e sono la fonte dello sviluppo clonale della linea cellulare sessuale. Avvio di cellule germinali primordiali di linea, così come tutti i tessuti dell'embrione e mesoderma extraembrionale dà epiblast (ectoderma primario) embrioni precoci con mosaico organizzazione strutturale. La rimozione microchirurgica di varie parti dell'embrione precoce ha stabilito una zona di localizzazione nell'epiblasto di un clone di precursori commessi di cellule germinali primarie. Con l'aiuto della rodamina destrano, che è stata usata come marcatore cellulare, è stato stabilito che i precursori delle cellule sessuali primarie si trovano nella regione prossimale dell'epiblasto, accanto all'ectoderma extra-embrionale. La linea cellulare sessuale primaria emerge da un clone di 45 cellule, la cui allocazione si verifica all'inizio della gastrulazione. Quindi avviene la segregazione del clone e durante la gastrulazione, le cellule del sesso primario entrano nel mesoderma extraembrionale e si trovano nella base della gemma allantoide, dietro la banda primaria. Da lì le cellule germinali primarie migrano verso l'estremità ventrale dell'endoderma endocervix e poi si muovono attivamente attraverso il mesentere, popolando i rulli genitali alla fine della migrazione. Nel processo di migrazione, così come nei primi 2-3 giorni di localizzazione nel rudimento delle gonadi, le cellule sessuali primarie proliferano attivamente e subiscono otto cicli replicativi. Se all'inizio della migrazione ci sono circa 50 cellule germinali primarie, nelle cisti riproduttive di embrioni di topo di uno sviluppo di 12 giorni, il numero di cellule primarie del sesso supera 25.000.

La somiglianza funzionale dei CES e cellule germinali primordiali dimostra piena integrazione di quest'ultima nella massa cellulare interna sostituzione blastocisti e successivo sviluppo integrale dell'embrione, tessuto che consiste soltanto di discendenti cellule germinali primordiali. Secondo altre caratteristiche murine cellule germinali primarie PGC erano identiche, che mostra la capacità di differenziarsi in diverse direzioni, per formare corpi embrionali in vitro, una forma in vivo teratomi quando iniettato per via sottocutanea in topi immunodeficienti somiglianti teratomi spontanei topi testicolo linea 129 / ter.

È accertato che, quando aggiunto a medio LIF, e membrannosvyazannogo solubile SIF isolato le cellule germinali primarie di 8 giorni embrioni murini sopravvivere e proliferare in coltura per 4 giorni, ma poi muoiono. Inoltre, il periodo in cui la coltura della morte osservata cellule germinali primordiali coincide con la fase di sviluppo di embrioni di topo (12,5-13,5 giorni), quando gonadici cellule germinali femminili gemme primarie entrano meiosi, mitosi e nelle cellule germinali primordiali maschi sono bloccati divisione. Tuttavia, se si aggiunge per l'ambiente fattori non solo la crescita LIF e della SIF, ma anche di FGF2, le cellule germinali primarie continuano proliferirovat, e sottoculture si formano colonie di cellule in grado di riprodurre anche dopo essere stato rimosso dall'ambiente di fattori di crescita (SIF e FGF). Tali cellule possono essere coltivate su un substrato lungo fibroblasti embrionali senza l'aggiunta di un fattore di crescita solubile LIF. Queste linee cellulari stabili derivati da cellule germinali primordiali, ed è stato chiesto di chiamare cellule germinali embrionali. Questo termine non può essere considerata di successo come quando coltivate EG-cellule non possono essere ottenute cellule germinali embrionali, in grado di effettuare le successive fasi di oogenesi o spermatogenesi. Ciò è dovuto al fatto che le linee EG-cellulari, anche se derivati da cellule germinali primordiali, ma nella cultura di acquisire le proprietà delle cellule staminali pluripotenti embrionali perdono la loro capacità di impegnare la linea germenativnye. In altre parole, le cellule germinali primarie durante la coltivazione perdono le loro proprietà gameti trasformate in precursori e cellule pluripotenti ESC-like.

Si noti che quando vengono somministrati topi EG immunodeficienti, non si verificano teratomi. Si presume che la perdita della capacità delle cellule EG umane di iniziare teratomi sia dovuta al fatto che queste linee non sono state create direttamente da cellule germinali primarie coltivate ma sono state ottenute da cellule isolate da corpi embrioidi. Pertanto, è possibile che siano discendenti di cellule pluripotenti, ma già impegnate.

Va notato che ci sono differenze fondamentali tra le cellule EG e le cellule germinali primarie. Questi ultimi non consentono di ottenere embrioni chimerici di topo, il che indica la mancanza di capacità delle cellule germinali primarie di integrarsi nella massa cellulare interna o nel trofectoderma. Le caratteristiche della popolazione delle cellule sessuali primarie sono più simili alle linee impegnate di cellule somatiche di embrioni successivi, la cui introduzione nella blastocisti non porta anche alla formazione di embrioni chimerici.

Tecniche di modificazione coltura delle corpi embrionali ottenute con EG-aggregazione di cellule consentiti dalla selezione su terreni selettivi per ricevere un'altra popolazione di cellule pluripotenti, chiamate "cellule derivate da corpi embrionali (cellule derivate corpo embrioide - EBD-celle). DEB-capacità delle cellule di proliferare in coltura per un lungo tempo reso possibile creare linee cellulari stabili cellule impegnate. Cloni di cellule sono stati ottenuti esprimono mRNA e una vasta gamma di proteine marker di cellule specializzate. Questo approccio come risultato dimostrato che le cellule pluripotenti umane sesso primaria, e si differenziano in vitro in vari tipi di cellule: i neuroni, glia, endotelio vascolare, cellule ematopoietiche, cellule muscolari, e endodermico.

Fonti alternative di cellule staminali embrionali

La fonte alternativa di linee umane ESC può essere cellule ibride. Impianto nell'utero della struttura di mucche pseudogravide geterogenomnoy ottenuto durante l'unione tramite elettroporazione fetusa cellule somatiche umane con le mucche uova, che erano stati precedentemente rimossi dal pronucleo, permette di ricevere la massa cellulare interna di pre-impianto di embrione stadi di sviluppo artificiali. Per questo, la blastocisti dell'uovo della mucca con il nucleo trapiantato della cellula umana si ottiene al primo stadio.

Nel secondo stadio, l'embrioblasto viene estratto dalla blastocisti e da esso - l'ESC secondo il metodo Thomson. È interessante notare che i migliori risultati sull'isolamento delle linee ESC utilizzando questo metodo sono stati ottenuti utilizzando nuclei di cellule follicolari o cellule germinali primarie che persistono nel corpo umano in uno stato di ibernazione. Ciò è dovuto al fatto che un uovo di mucca trapiantato cellule umane neukorochennye nucleo dovrebbe avere alta attività e telomero telomeazy che evita l'invecchiamento prematuro cloni ESC derivati da uovo ibrido (Repin, 2001). È noto che le proteine EGF più importanti del marcatore intracellulare sono Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, che appartengono ai cosiddetti silenziatori della cromatina. I silenziatori forniscono un imballaggio particolarmente compatto di eterocromatina, che impedisce la formazione di anse di eucromatina. Il pacchetto di cromatina mediato da queste proteine è correlato alla totipotenza del genoma dell'ESC. Ad oggi, è stato stabilito che gli ovuli maturi di bovini e umani sono l'unico tipo di cellule specializzate contenenti alte concentrazioni di proteine silenziate nel citoplasma. Su questa base, è stato sviluppato un metodo per la produzione di ESC ibridi trasferendo nuclei di cellule somatiche in ovuli non nucleari di mucche. Studi preliminari in vitro hanno dimostrato che il citoplasma delle cellule uovo delle mucche ripristina la totipotenza del genoma del nucleo di cellule somatiche umane in 12-24 ore di coltivazione.

Di particolare interesse sono i dati sulle caratteristiche dello sviluppo preimpianto di embrioni umani, che indicano una successiva sostituzione di cellule totipotenti da parte di una popolazione di cellule pluripotenti rispetto ai topi. Lo studio delle trasformazioni cellulari ha mostrato che le cellule della massa cellulare interna della blastocisti umana, oltre alle ESC, generano anche cellule di trofoblasti, che indicano la loro potenza totale.

È noto che nello stadio della blastocisti ci sono due popolazioni cellulari diversamente impegnate. Uno di questi è lo strato esterno della blastocisti, trofectoderma, derivato dalle cellule del trofoblasto e da altri componenti della placenta embrionale. La seconda popolazione di cellule è raggruppata in una massa densa, che contatta la superficie interna del trofectoderma. La popolazione cellulare della massa cellulare interna deriva da tutti i tessuti e germi degli organi dell'embrione. Nella fase della blastocisti tardiva, si forma un endoderma extra-embrionale dalla massa cellulare interna e si forma un epiblast (l'ectoderma primario). Allo stesso tempo, le cellule epiblastiche mantengono la pluripotenza, mentre la capacità di differenziare le cellule dell'endoderma extra-germinale è limitata.

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Ottenimento di cellule staminali embrionali umane

Fino a poco tempo fa, si riteneva che fosse impossibile ottenere un ESC dal trofoblasto. Tuttavia cellule diploidi staminali linea trophectoderm isolate dalla blastocisti in un mezzo che contiene, invece di LIF e FGF2 eparina, prolifera e si trasforma in cellule staminali. Se si rimuove dal mezzo di FGF2, le cellule smettono di trophectoderm allevamento, cominciano endoreduplicazione dei cromosomi e elementi cellulari trofektodermalnye a poco a poco trasformata in cellule del trofoblasto giganti. Probabilmente, LIF non stimola la proliferazione delle cellule trophectoderm dovuto al fatto che FGF2 innesca un meccanismo transsignalizatsii come FGF2, legame al recettore citoplasmatico (FGFR2), attivare MAP chinasi nel citoplasma - ERK1 e ERK2. Di conseguenza, quando incorporati nelle cellule della blastocisti di una via di segnalazione (LIF - gpl30 - JAK-Kinase - STAT3) cellule massa cellulare interna vengono trasformati in hESC pluripotenti, attivando il secondo meccanismo di segnalazione transmembrana (FGF2 - FGFR2 - MAP chinasi ERK1 / ERK2) Nella blastocisti si formano le cellule staminali del trofectoderma. La scelta del percorso di segnalazione, a sua volta, dipende dall'attività del gene oct4. Questo gene appartenente dominio POE, localizzato nel locus t 17 autosomi e viene espresso durante ovogenesi, in frantumazione periodo così come nelle cellule della massa cellulare interna della blastocisti, e nelle cellule germinali primordiali. Il ruolo funzionale del gene oct4 sta nella codifica del fattore di trascrizione necessario per l'emergere di cellule pluripotenti, la loro differenziazione e dedifferenziazione.

L'espressione del gene oct4 nell'ESC varia a seconda dell'interazione di questo fattore di trascrizione con i cofattori. Una regolazione direzionale dell'espressione dell'ottt4 nelle blastocisti ha mostrato che quando la sua attività diminuisce, metà delle cellule formano un trophectoderm, mentre con un aumento dell'espressione indotta di ott 4, si verifica prevalentemente ESC.

Nell'esperimento, ESC non può essere convertito in una linea quando coltiva i blastomeri totipotenti nella fase di frantumazione, così come nella fase di gastrulazione e nelle fasi successive dello sviluppo embrionale. Mouse CES solito assegnare a 3,5-4,5 giorni di gestazione, che corrisponde al sesto (singolo strato di blastocisti) e fasi settima (due strati della blastocisti - un cilindro primi uovo) embriogenesi normale. Ovviamente, solo nel periodo preimpianto gli embrioni di topi contengono popolazioni cellulari che possono essere trasformate in ESC. Di conseguenza, l'isolamento delle linee ESC è possibile solo in alcune fasi dell'embriogenesi. Totitipotente, dal punto di vista della possibilità di sviluppare un embrione vitale con membrane embrionali e placenta, sono lo zigote e i blastomeri che si presentano durante la frantumazione. La perdita della potenza totale delle cellule germinali inizia allo stadio tardivo della morula, quando ulteriori comminuzioni di blastomeri dipendono dalla loro posizione. I primi blaetomeri della Morula conservano la totipotenza, poiché le manipolazioni sperimentali con cambiamenti nella loro posizione, ad esempio l'inversione della loro posizione, non impediscono lo sviluppo di un embrione completo.

È stato riscontrato che l'efficienza del rilascio di ESC nella linea è influenzata dallo stato delle blastocisti al momento della loro espianto. L'utilizzo di blastocisti dopo una simulazione di sette giorni di diapausa nel tratto genitale di topi, ovariectomizzato a 3,5 giorni di gestazione e trattati con progesterone, contribuisce ad una separazione più efficace di linee di cellule staminali embrionali. Si presume che in tali condizioni il numero di blastomeri che formano la massa cellulare interna aumenta. È anche possibile che il ciclo cellulare si estenda e la maggior parte dei blastomeri entri nella fase G0.

Inoltre, la creazione di linee di hESC pluripotenti stabili dipende embrioni genotipo: abbastanza facilmente distinguibili da CSE Murine blastocisti linea 129, è molto più difficile da ottenere utilizzando topi CS7BL / 6 e praticamente impossibile isolare la linea da hESCs blastocisti topi CBA / Ca. Ovviamente, i primi embrioni possiedono alcune caratteristiche genetiche che influenzano lo sviluppo della linea ESC pluripotente. Tuttavia, nella coltivazione di epiblasti isolati, e anche con la selezione selettiva di cellule differenziate, le linee ESC da embrioni precoci di topi CBA / Ca erano ancora isolate.

Una tecnica standard collaudata per l'ottenimento di linee ESK da blastocisti viene fornita in manuali di laboratorio sulla tecnica di sperimentazione con embrioni precoci. Le linee ESK sperimentali possono anche essere ottenute coltivando un epiblast isolato (ectoderma primario) di embrioni di topo di 4,5 giorni con una tecnica microchirurgica piuttosto complessa e condizioni di coltivazione modificate. La complessità di questa procedura è giustificata, poiché la frequenza di formazione delle linee ESC era molto più alta rispetto a quella con la massa cellulare interna della blastocisti.

Per isolare le linee ESC, ogni clone viene trasferito in un micro-pozzetto, un aggregato di 40-60 cellule viene cresciuto, viene nuovamente disperso. Più ripetizioni di questa procedura permette di ottenere linea ESK immortalate con celle di massima normokariotipnyh tasso di proliferazione allegate alla plastica, che attraverso passaggi 50-100 mantengono totipotenza e elevata attività telomerasica. Nel processo di supporto delle linee ESC, l'inquinamento dell'ambiente o il siero con endotossine batteriche è il più pericoloso - anche le concentrazioni di tracce di endotossina nel terreno di coltura causano la morte massiccia di cellule germinali immature. Con un attento controllo della crescita lineare e la dispersione tempestivo dei CES in coltura sono in grado di fissione simmetrico, in cui entrambe le cellule figlie rimangono pluripotenti e in grado di eseguire un numero illimitato di cicli cellulari, mantenendo un cariotipo diploide e la potenza totale.

La selezione di una popolazione pulita di ESC umane può essere eseguita dopo la trasfezione nel loro genoma di molecole di DNA ricombinante contenenti un gene che codifica per la sintesi di una proteina fluorescente verde (GFP). L'espressione di GFP aumenta con la crescita dell'ESC in condizioni che supportano la loro proliferazione, mentre con l'inizio della differenziazione, il livello di espressione di questo gene è ridotto, che consente la selezione di linee cellulari pluripotenti pure stabili su un terreno selettivo. Quando coltivata con la selezione GFP di ESC, la frequenza delle colonie aumenta notevolmente, poiché nelle condizioni delle colture selezionate viene eliminato il potente effetto antiproliferativo delle cellule differenziate.

Definizione di cellule staminali embrionali umane in linea mediante il metodo di isolamento embrioni preimpianto (fase 80-120 cellule), che rimangono dopo la procedura vitro fecondazione in. Per questo, gli embrioni "in eccesso" ottenuti artificialmente sono dispersi meccanicamente nell'ambiente di Delbecco-Needle. Dopo aver marcato le cellule con anticorpi monoclonali selettivi con un'etichetta fluorescente, le cellule dell'embrioblasto sono isolate. L'embryoblast viene disperso in singole cellule usando una miscela di disaspasi-collagenasi. Cellule dissociate sono state coltivate in un mezzo speciale (80% medio Delbekko + 20% siero fetale di vitello in presenza di 500 ug / ml di IL-6, LIF e SCF) sul monostrato di fibroblasti embrionali feeder 3 primi passaggi. In questo caso, la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule staminali e progenitrici è supportata dall'esposizione a IL-6, LIF e SCF. In questo ambiente, le hESC sospensione crescono cloni osharennyh cellule senza legami a essere dissociate delicatamente pipettando multipla. Nuovi cloni appaiono nella cultura sospesa il 5 ° -7 ° giorno. Il tasso massimo di crescita dell'ESC è raggiunto dalla ripetuta dissociazione dei cloni nello stadio di 10-15 cellule. Quindi, ciascun clone viene trasferito su un microcell e cresciuto in un aggregato di 40-50 celle. La procedura viene ripetuta molte volte nei passaggi, aumentando il volume di coltura a una densità di 5-10 milioni di cellule per tazza da 6 centimetri. Utilizzando tale Thomson passaging essere stato isolato 10 cloni CES umani immortali che attraverso passaggi 100 mantengono elevata attività telomerasica, la capacità di intensa proliferazione e caratteristiche fenotipiche potenza totale minimo, con differenziazione in una qualsiasi delle 350 linee di cellule specializzate che derivano ecto-, meso - e endoderma. Differenziazione di ESC umana avviato (al cambio del mezzo, aggiunta ed eliminazione di LIF siero) con l'adesione delle cellule al substrato, che indica lo sviluppo del citoscheletro e l'espressione di recettori di adesione. È importante che con una proliferazione illimitata di ESC umane, sia stato preservato un normale cariotipo.

Il secondo metodo per isolare le linee umane dell'ESC è basato sull'uso di cellule primarie del sesso. Studi sperimentali hanno dimostrato che le linee di cellule Eu possono essere ottenute dalle placche genitali di embrioni di topi di 12,5 giorni. Tuttavia, in questi casi, la frequenza di formazione delle linee di cellule progenitrici era significativamente inferiore rispetto agli esperimenti con embrioni precedenti. Allo stesso tempo, le cellule del sesso primario da gonadi di embrioni di topo di età gestazionale di 13,5 giorni non sono generalmente in grado di trasformarsi in linee.

Le prime linee stabili di cellule EG umane pluripotenti sono state ottenute da gonociti primari isolati dalle gemme genitali di embrioni di 5-9 settimane di vita. Cellule isolate sono state coltivate su un substrato di topo inattivato fibroblasti embrionali in terreno DMEM con siero fetale, al quale è stato aggiunto mercaptoetanolo, forskolin, così come fattori di crescita ricombinanti umani (FGF e LIF). Dopo 7-12 giorni, colonie multicellulari sono apparse in coltura, secondo caratteristiche morfologiche e marcatori molecolari corrispondenti alle cellule EG umane. Dopo l'aggregazione, queste cellule formarono corpi embrioidi, con l'ulteriore sviluppo di cui apparvero cellule specializzate, caratteristiche per i derivati di tutte e tre le foglie embrionali. In tutti i 10-20 passaggi le linee cellulari EG hanno mantenuto il cariotipo normale e non hanno perso la pluripotenza.

Viene anche dimostrato che l'effetto combinato di LIF, fattori legati all'acqua e legati alla membrana, nonché TGF-b, modifica il programma per lo sviluppo di cellule germinali primarie. Invece di fermare le divisioni mitotiche e iniziare a differenziare verso l'oogenesi o la spermatogenesi, le cellule sessuali primarie continuano a proliferare. Dopo diversi cicli mitotici aggiuntivi diventano simili alle cellule epiblastiche e, perdendo le proprietà dei precursori delle cellule germinali, vengono trasformate in cellule embrionali embrionali OM pluripotenti.

Così, nel 1998, le linee immortalizzate di cellule sessuali primarie furono prima isolate dal rudimento sessuale del tessuto autoptico fetale umano. L'embriogenesi delle cellule germinali primarie umane appaiono nel sacco vitellino nella terza settimana di sviluppo, e sulle settimane 4-5th, queste cellule migrano nella zona di tubercolo sessuale, dove formano una popolazione di gonociti dormantnye primari. Nello stato inattivo, le cellule germinali primarie rimangono sul nascere fino alla nascita. Linee cellulari germinali primarie sono stati estratti dalle fetali tubercolo genitale 5-9 settimane di età embrioni recuperati tessuto ex tempore che viene trattato con una miscela di collagenasi di tipo IV-V, ialuronidasi e DNasi per la resa in aumento cellule quantitativo e qualitativo. Le cellule germinali primarie nei tessuti del tubercolo genitale fetale sono circondate da cellule stromali (mesenchimali) di Sertoli. Lo scopo funzionale delle cellule di Sertoli è la produzione di fattori anti-apoptotici (Fas-ligando), mitogeni e immunosoppressori che proteggono le cellule staminali sessuali dall'attacco immunitario del corpo. Inoltre, il microambiente stromale del tubercolo genitale gioca un ruolo importante nella maturazione dei gameti. Le cellule germinali primarie isolate sono piantate nella coltura sopra lo strato stromale dell'alimentatore costituito dai fibroblasti fetali dei primi tre passaggi. La combinazione più efficace di mitogeni è un complesso costituito da LIF, FGF e forskolina (uno stimolante per la formazione di cAMP). Proliferazione cellule germinali primordiali in vitro richiedono l'aggiunta di siero fetale, in presenza di un primario gonociti riproduzione nei cloni coltura accompagnata dalla formazione di cellule globulari, non aderenti al substrato.

Il National Institutes of Health, sulla base di riassumere le informazioni esistenti sui metodi di assegnazione di linee ESC umani dalla blastocisti è stata fatta una conclusione preliminare che l'assegnazione di successo del CES è più probabile quando blastocisti coltivate con ben formato massa cellulare interna (cellule staminali: il progresso scientifico e le direzioni future della ricerca Nat. Inst, di Health USA). Da questo punto di vista, la migliore fonte di consigli economici e sociali per creare linee sono blastocisti umana 5 ° giorno di sviluppo, di cui l'assegnazione della massa cellulare interna dovrebbe essere rimuovere con cautela trophectoderm. La massa cellulare interna isolata, composta da 30-35 cellule in questa fase, deve essere coltivata sul substrato dei fibroblasti murini embrionali, che è la condizione decisiva per la formazione di colonie ESC in coltura.

L'analisi delle caratteristiche fenotipiche delle cellule staminali embrionali

Di particolare interesse è l'analisi comparativa interspecifica delle caratteristiche fenotipiche dell'ESC. Si è constatato che umani ESC colonie - un densi ammassi di epiteliali cellule appiattite, mentre i topi polpaccio embrioide consistono in conglomerato sciolto di cellule arrotondate. Nell'ESC umano, l'indice del rapporto nucleo-plasma è inferiore a quello del mouse ESK. Le cellule staminali embrionali di scimmie formano colonie di cellule piatte con bordi irregolari. Nei primi cloni dei primati dell'ESC, le singole cellule sono facilmente visibili. L'ESC proliferante di tutte le specie animali studiate non esprime molecole MHC della prima e della seconda classe. Allo stesso tempo, CES umani danno una risposta positiva agli anticorpi TERA 1-60 e GCTM-2, che indica la presenza sulla loro superficie cheratina / condroitina solfato proteoglicani, caratteristico embrionale (teratomi) cellule staminali -kartsinomnyh. Espressione in hESC tutti i tipi di gene Oct4 animali suggerisce che, nonostante le differenze fenotipiche in CES umane e di topo, a quanto pare attivato dalla stessa serie di geni responsabili per il mantenimento della pluripotenza (Perù, 2001). Inoltre, le linee ESC derivate da topi embrionali, suini, conigli, primati, e bestiame, hanno caratteristiche morfologiche simili, una serie simile di identificazione molecolare di marcatori e un meccanismo molecolare quasi identico per l'esecuzione del programma embriogenesi che permette di prendere un nuovo sguardo il problema xenotrapianti .

Diversamente embriogenesi normale in vivo, la proliferazione in vitro delle hESC non è accompagnata dalla formazione di strati germinativi e procede al blocco omeotico Nohgenov sfondo, cioè senza organogenesi. Poiché i geni di segmentazione non funzionano in coltura hESC impossibile riprodurre tali periodi embriogenesi come scheda somite segmentazione del nucleo, la formazione di sacco vitellino, allantoide provvisori e di altri organi e tessuti. Gli ESC di coltura sono stati congelati all'inizio della formazione di 350 linee di restrizione di cellule specializzate. Così, cellule progenitrici clone controllate e PGC localizzati centralmente sono solo embrione modello durante lo sviluppo in cui vengono formate regioni differenti di tessuto in uno stadio sono diverse dalle cellule specializzate derivate, tuttavia, da precursori comuni. Sebbene il livello minimo di recettori presenti sulla superficie delle hESC, mantengono la capacità di eseguire processi morfogenetici primitive simulando il grosso della struttura di embrione: hESCs fanghi di cultura e aggregati forma una struttura simile blastocisti o anche più tardi embrioni (cilindri uovo). Tali aggregati di sospensione sono stati opportunamente denominati corpi embrioidi semplici e complessi.

Quando miscelato differenziano in varie cellule del corpo embrioide simultaneamente espressi dai geni precoce ectoderma (Oct3, FGF-5, nodale), endoderma (gata-4), mesoderma (brachyury), mesoderma cardiogeno (PKH-2,5), tubo neurale (msx3 ) ed emopoiesi (elkf). Utilizzando varie combinazioni di citochine e fattori di crescita per il targeting la formazione di cellule strato germinale in vitro in alcuni casi si è possibile avere corpi embrionali, che sono stati preferibilmente espressi geni ectoderma o mesoderma, che apre la strada alla modellazione di gastrulazione e la fase organogenesi precoce.

Crescita clonale delle hESC è evidenza di divisione cellulare asimmetrica in cui solo uno dei CES nel centro clone mantiene non limitativo capacità di riproduzione, mentre l'altra cellula figlia dà luogo alla generazione di cellule progenitrici, differenziazione è già in arrivo. Pertanto, il tasso di moltiplicazione del clone alla periferia del corpo embrioide è maggiore rispetto al centro. Le cellule marginali del clone in crescita subiscono una differenziazione spontanea disordinata, migrano o muoiono con i meccanismi dell'apoptosi. Questi eventi determinano il destino del clone se il tasso di proliferazione supera la velocità di migrazione e apoptosi, clone dimensioni continuano ad aumentare, stabilizzazione si verifica con uguale apoptosi e la velocità di formazione della nuova velocità cellule, regressione - la retromarcia di questi processi. Le cellule progenitrici si dividono simmetricamente, cioè entrambe le cellule figlie vengono ulteriormente differenziate in linee cellulari specializzate mature. Il rapporto tra cellule ESC / progenitrici varia, ma sempre la quantità di ESC è solo una frazione della percentuale della popolazione di cellule progenitrici. Pertanto, solo un attento pipettamento e una disaggregazione tempestiva dei cloni può aumentare il numero di CES in coltura. Per ottenere la massima resa di ESC, la più efficace è stata la disaggregazione dei cloni nello stadio di 10-12 cellule. La direzione e il grado di differenziazione delle cellule nel corpo embryoid dipende dalla loro posizione. Le cellule esterne del corpo embrionali non esprimono il gene Oct4 e subiscono la differenziazione in cellule endoderma primarie da cui successivamente formate cellule epitelioidi e parietale extraembryonic endoderma viscerale. Le cellule interne dell'embrioneide esprimono il gene oct4 e mantengono la pluripotenza per 48 ore di coltura. Ma poi la riorganizzazione morfologica verifica nella coltura monostrato epiteliale inizia e l'espressione di geni che controllano lo sviluppo dell'ectoderma primario. Quindi inizia il processo di citodifferenziamento totale disordinato con la comparsa di vari tipi di cellule che sono i derivati di tutti e tre i fogli germinali. Nel processo di differenziazione spontanea delle cellule embrionali primo insorgere aggregati marcatori endoderma sotto forma di frammenti (cisti) sacco vitellino. Inoltre, angioblasti e cellule endoteliali di capillari in crescita compaiono in queste strutture. Nelle fasi finali della differenziazione spontanea delle cellule interne del corpo embrioide sviluppa varie cellule terminalmente differenziate, inclusi neuroni, elementi gliali, cardiomiociti, macrofagi e eritrociti. In certa approssimazione (considerando l'inversione spaziale di fogli che formano il tessuto embrionale) attraverso i corpi embrionali in vitro possono esplorare processi morfogenetici e analizzare i meccanismi molecolari di embrionale citodifferenziazione periodo iniziale, e stabilire il ruolo di specifici geni nella realizzazione di questi processi.

Pertanto, all'interno del clone sono cellule in cui vengono scoperti diversi programmi di sviluppo genetico: ESC, primi progenitori e popolazioni progenitrici differenzianti. La coltivazione dell'ESC con metodi di caduta cadente o coltura di massa senza uno strato di alimentazione e senza l'aggiunta di LIF nel mezzo porta inevitabilmente alla formazione di corpi embrioidi. La morfologia delle cellule degli strati esterni ed interni dei corpi embrioidi è diversa. Lo strato esterno è costituito da grandi celle di processo. La loro superficie, rivolta verso l'ambiente, è ricoperta da numerosi microvilli. Lo strato esterno delle cellule è separato dalla membrana basale interna che assomiglia alla membrana di Reichert, mentre le cellule dello strato interno dei corpi embrioidi sono un epitelio cilindrico. Morfologicamente, lo strato interno, pur contenendo molte cellule divisorie, ricorda più le colonie ESC indifferenziate.

Caratteristiche delle cellule staminali embrionali umane

Assenza di interazioni parenchimali-mesenchimali al segnale di fondo bloccando i geni homeosis provoca la crescita disordinata delle PGC nella cultura, dal momento che questa scheda è rotto e le infrastrutture di formazione degli organi provvisori. Crescita disorganizzata e disordinata differenziazione spontanea delle hESC in coltura a causa della mancanza di marcatura quadro stromale di futuri organismi mesenchimali: in vitro è possibile la formazione di milioni di epatociti, ma non è possibile ottenere tutti i segmenti del fegato, inclusi gli elementi strutturali e funzionali tali, come i seni, lo spazio delle cellule Disse e Kupffer.

Si ritiene che la pluripotenza dei CES realizzata esclusivamente in embriogenesi per formare tessuti e organi dell'embrione, mentre il cordone ombelicale e placenta sono derivati trofoblasto. Racchiuso in un guscio trofektodermalnuyu ESK costantemente generare cloni cellulari provvisorio realizzando programma di sviluppo da mRNA combinatorie massa matrice topografica Nohteyaov che predeterminare la disposizione spaziale, la forma, le dimensioni, il numero di cellule di organi provvisori e definitivi e assemblaggio parenchima in unità strutturale e funzionale. Allo stesso tempo il Comitato sono l'unico tipo di cellula in cui il meccanismo molecolare della realizzazione delle loro potenzialità completamente dissociato dal programma genetico di sviluppo e ESCo stessi privata della possibilità di interazione con altre cellule a causa del blocco sia percezioni recettori e sistemi transsignalizatsii. Tuttavia, adeguate CES attivazione produce graduale distribuzione embriogenesi programma finale nascita è completamente formato e pronto alla vita extrauterina di un organismo composto da miliardi di cellule. In questo breve tempo, ma debito inimmaginabili nello spazio cellulare percorso inevitabile verificarsi di errori nei meccanismi molecolari che forniscono funzioni vitali delle cellule e nei programmi che controllano la proliferazione, differenziazione e specializzazione. Pertanto, in farmacogenomica moderni considerati separatamente malattia dispositivi molecolari, e la programmazione cellule malattia. E l'azione della maggior parte dei nuovi farmaci allo scopo di correggere il nome del programma di differenziazione, proliferazione e organogenesi, nonché la rigenerazione di organi e tessuti. Nell'organismo adulto tramite CSE diventa possibile controllare il comportamento delle cellule staminali / progenitrici trapiantate nel cervello, fegato, milza, midollo osseo e altri organi del umano per riparare un danneggiato organi parenchimali destinatario dovuti alle cellule del donatore mesenchimali differenziazione e specializzazione matrice conservati. In sostanza, il programma totipotenza sta lanciando un altro oocita genoma di livello, zigoti e blastomeri, ma queste cellule non è ancora possibile clonare e diversi passaggi nelle quantità necessarie per le esigenze della medicina esperienziale e pratico. Pertanto, il Comitato è una fonte di informazioni genetiche, contenente la mappa tridimensionale lineare restrizione dell'embrione e codici di linee cellulari specializzate durante gastrulazione.

Virtualmente illimitate possibilità della rigenerativa ESC causa del fatto che il loro genoma, in contrasto con l'apparato genetico delle cellule somatiche differenziate, sostiene pluripotenza. Una manifestazione di stato dormiente radicata in CSE informazione genetica è il cosiddetto fenotipo minimo - sulla superficie del CES di esprimere un numero limitato di recettori, e quindi distribuito pochi programmi per interagire apparato nucleare transsignalizatsii della cella con il suo microambiente. Sullo sfondo di geni responsabili di ibernazione per la restrizione di linee di cellule specializzate e la differenziazione delle cellule, attivate solo circa il 30 dei 500 geni i cui prodotti fornire cellule di comunicazione con il microambiente circostante. Utilizzando il metodo di analisi seriale dell'espressione genica dimostrato che la generalità delle principali scatole genoma funzionali regolano metabolismo energetico e nelle cellule somatiche e CES ultimo determinato estremamente bassa quantità di mRNA di recettori, proteine G, secondi messaggeri, trascrittasi, cofattori espressione e repressione , cioè, l'intero sistema di trasferimento transmembrana del segnale regolatorio nella cella. Ciò è dovuto alla mancanza o all'espressione molto bassa dei geni transsanalizzanti. Durante la differenziazione indotta nel genoma di ESC 18 è arrestato il funzionamento sincrono funziona geni per sfondo attivazione transsignalizatsii 61 gene che controlla la sintesi di recettori di adesione cellulare, componenti della matrice extracellulare, restrizione trascrittasi elementi messendzhernyh e sistema di trasmissione di segnali per un'unità nucleare con i recettori di membrana delle cellule plasmatiche. Contemporaneamente bloccato espressione dei geni responsabili della sintesi di proteine silenziatori, nonché espressione genica koingibitorov fornendo hESCs totipotency genoma.

Sono stati trovati marcatori genetici per le cellule di tutti e tre i volantini embrionali. Identificazione strato di cellule ectodermica effettuata sull'espressione di geni nodale, Oct3 e FGF-5, cellule mesodermiche - gene brachyury, zeta-globina, endodermica - a gata-4 genica. In embriogenesi normale, durante gastrulation osservata una migrazione attiva delle popolazioni immaturi di cellule staminali e progenitrici, localmente definire zone delle ossa facciali del cranio, alcune parti del cervello, sistema nervoso periferico, sistema di conduzione cardiaca e tessuto del timo che sono formate da cloni spostati cellule. Etichettatura cella geni precoci strati germinali rende più facile per l'analisi topografica della migrazione di cellule progenitrici nello sviluppo dell'embrione. Si è trovato in particolare che le cellule in aggregati embryocarcinoma P19 espressione del primo brachyury gene mesoderma inizia durante la riduzione dell'espressione genica di attivatore tissutale del plasminogeno, a-fetoproteina, cheratina 8, e cheratina 19, che sono marcatori di inizio mesoderma popolazioni migratori. Di conseguenza, la formazione di tessuti di origine mesodermica inizia solo dopo il processo di cellule progenitrici mesodermal migrazione e punto sedimentazione.

Con le caratteristiche fenotipiche estremamente limitate e l'assenza della maggior parte dei blocchi transsignalizatsii ESC tuttavia esprimono alcune molecole di recettore che possono essere utilizzati per identificarli. È interessante notare che i marcatori antigeni delle ESC negli umani e nei primati erano comuni. Più spesso utilizzato per hESCs etichettatura etichettati anticorpi diretti contro antigeni membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (antigeni lipidici uniche rappresentano complesso GL7 glycolipid con acido sialico), così come glicoproteine ad alto polimero TRA-1-81, TRA-1-60. Inoltre, hESCs esprimono antigene specifico embrionale SSEA-1 e fosfatasi alcalina endogena, così come un fattore di trascrizione specifico Oct4. Quest'ultimo è necessario per mantenere hESCs meccanismi di proliferazione - specifico fattore di trascrizione genica Oct4 attiva l'espressione del fattore di crescita dei fibroblasti 4 espressione genica e stabilizza boxe responsabile non limitativo raddoppiamento del DNA nelle cellule immature. I più importanti proteine marker intracellulari sono Oct3, Oct4, TcF e Groucho, legati alle proteine della cromatina-silenziatori.

Quasi immediatamente dopo CES coltivate tentativi a lungo termine è riuscita e l'organismo è stato preparato da colture di cellule staminali isolate da blastocisti di topo, e coltura di cellule germinali primarie, iniziato studi sulla capacità ESC pluripotenziali fase quando somministrata nei primi stadi di sviluppo embrionale. È stato dimostrato che nella morula e blastocisti PGC sono in grado di formare embrioni chimerici in cui i donatori PGC discendenti rilevati in tutti i tessuti somatici e anche in gameti. Così, in Developmental Biology utilizzando ESC scripting "ponte" tra gli studi sperimentali in vivo e in vitro, che ha aumentato significativamente la possibilità di studiare processi Preferiti tessuti primari e organi, la differenziazione e l'organogenesi embrionale.

È chiaramente dimostrato che in vivo nel processo di embriogenesi, le ESC sono integrate nella prima massa delle cellule germinali, ei loro derivati sono presenti in tutti gli organi e tessuti. I CES colonizzano nell'embrione chimerico una linea di cellule sessuali, i cui discendenti formano ovuli e spermatozoi a pieno titolo. Le cellule staminali embrionali sono clonogenica - singoli PGC possono creare geneticamente identici ad una colonia di cellule con marcatori molecolari, che comprendono l'espressione genica oct4 e fosfatasi alcalina, un'elevata attività della telomerasi, nonché l'espressione di specifici antigeni embrionali.

Per studiare i meccanismi di embriogenesi con la tecnica di hESC chimerization morula creando una struttura biologica, che si trova all'esterno strato blastomeri tetraploide ricevente e donatore PGC vengono somministrati in. Così, trofoblasto formata da discendenti blastomeres tetraploide destinatario che consente impianto e placentazione e PGC donatori agiscono come la massa cellulare interna, che è formata da una linea germinale vitale dei corpo e progenitrici gameti primari. Valore studio ESC risiede non solo dal fatto che, quando la manipolazione in vitro con loro genoma mantenuto pluripotenza, ma anche nel fatto che pur conservando la capacità di partecipare alla formazione di hESCs cellule primordiali germinali dell'embrione chimerico. Si è dimostrato che solo una progenie di PGC geneticamente modificati colonizzare tutti i germi primari e formando tessuto embrione chimerico ottenuto per aggregazione o co-coltura delle cellule con embrione 8 celle. Quando trapiantati in topi CSE morula transfettate con il gene proteina fluorescente verde, discendenti fluorescenti delle cellule sono stati trovati in tutti i tessuti esaminati dello sviluppo dell'embrione (Shimada, 1999). Il trapianto di ESC nella morula in grado di creare topi vitali, il cui corpo è costituito esclusivamente da discendenti donato il CES, che apre nuove opportunità per una varietà di opzioni di clonazione terapeutica. Ora un tale approccio metodologico è stato applicato con successo per studiare i problemi della biologia dello sviluppo, in particolare, è in grado di analizzare i meccanismi genetici di inattivazione del cromosoma X o instabilità epigenetica delle hESC. Il trapianto di ESC nell'embrione precoce viene utilizzato anche nelle biotecnologie in agricoltura e negli esperimenti di terapia genica.

I trapianti di ESC geneticamente modificati vengono utilizzati per testare le cellule bersaglio dei geni mutanti. Le CES in vitro sono utilizzate nelle biotecnologie per creare topi knockout. A tal fine, per ricombinazione omologa per essere rimosso dal CES studio gene (knockout) e mezzi selettivi secernono le cellule privi di questo gene. Poi knockout PGC iniettato in una blastocisti o portarli con blastomeres aggregazione morula. I così ottenuti embrioni chimerici sono trapiantati in una femmina destinatario e topi neonati scelti tra gli individui con gameti, nullizigotnymi di questo gene. Secondo questa tecnologia ha creato molte linee di topi knockout, che sono ampiamente usati in biologia sperimentale e medicina sperimentale. Questi modelli biologici studiato il valore di alcuni geni nello sviluppo embrionale, nonché il loro ruolo nei meccanismi di malattie e condizioni patologiche nell'uomo. Inoltre, le linee di animali knockout sono utilizzate nella fase di sperimentazione preclinica di nuovi metodi di terapia genica. Ad esempio, utilizzando la trasfezione genica in ESK normale allele del gene mutante gestire efficacemente corretto mutazione, colpisce il sistema emopoietico. L'introduzione di geni estranei nel CES permette di creare rapidamente le linee omozigoti animali da laboratorio transgenici. Tuttavia, va notato che la tecnica diretta ricombinazione genica delezione ha funzionato in modo affidabile come ancora solo relativamente topi ESC. Utilizzando CSE murine doppio knockout installato funzionale zona grappolo ruolo dei geni sul cromosoma 7 (regione genomica di copie del cromosoma 19 minuti umano), e la porzione prossimale del cromosoma 11 (copiare cromosoma umano 5d) - cancellazione di questi geni I topi ESK hanno permesso di valutare la funzione dei loro analoghi nell'uomo.

Gli studi funzionali capacità di geni embrionali umane, trasfezione in gene che animali da laboratorio hanno permesso hESCs in particolare cripto chiarire il ruolo del gene nella scheda e formando il gene cardiogeno mesoderma, Pax-6 - nell'occhio embriogenesi. Costituisce la prima espressione di geni in immaturo carta proliferanti ESC teratocarcinoma e topi blastocisti confermato schiacciante repressione nei geni transsignalizatsii ESK. La combinazione dei CES mutanti 60-80 e 20-30 cellule normali embrioni di topo pre-impianto porta allo sviluppo di embrioni chimerici in cui segnalibri corpi sono costituiti da cellule del donatore e del ricevente, che ci permette di determinare il ruolo dei geni sconosciuti gastrulazione e organogenesi. Mappa funzionale del gene sviluppo di embrioni di topo particolari ingranditi del ruolo del gene scheda SF-1 nella ghiandola surrenale e primordi genitale, WT-1 gene - nei reni geni della famiglia scheda MyoD - nella scheda della scheletrico famiglia genica muscolare gata-1-4 - nella maturazione di restrizione rudimenti di eritro- e linfopoiesi.

Diretto off di alleli materni e paterni di geni in hESC utilizzando vettore ricombinasi servito a chiarire le funzioni dei vari geni durante l'embriogenesi precoce e tecnologia di targeting dei geni sconosciuti umani in CES di topo contribuire alla scoperta di nuovi geni mutanti responsabili dello sviluppo di malattie ereditarie gravi. Usando il metodo definito knockout significato obbligato di alcuni geni per la posa tessuti embrionali: gata-4 - per infarto, gata-1 - a eritroide emopoietico tessuti, myoD - muscolo scheletrico, brachyury - per restrizione mesoderma trascrittasi hnf3 e HNF4 - per Le cellule staminali del fegato, rag-2 - segnalibri per cloni di linfociti T e B (Repin, 2001). Doppia eliminazione dei geni in hESC ha aperto l'accesso allo studio del ruolo funzionale dei geni degli strati germinale, segmentazione e homeosis e trapianto ESC data la possibilità di ottenere valide embrioni ibridi interspecifici. Con i metodi migliorati di trapianto di PGC donatori in un singolo embrione 8 celle dimostrato che chimerization a livello cellulare di molti organi dell'embrione destinatario. Si noti che i germogli di cellule si trovano nel tessuto organi topi riceventi umani dopo la somministrazione di cellule staminali ematopoietiche umane in una blastocisti. Si è constatato che in embrioni di topo durante la formazione dei corpi sangue hESC pluripotenti circolanti. È possibile che la loro funzione biologica sia nell'organizzazione embrionale del futuro sistema immunitario. Con ESC in vitro riprodotto modelli adeguati di malattia genetica umana: doppia modelli knockout distrofina gene nei topi di distrofia muscolare di Duchenne, atm gene shutdown (controllo del segnale sintesi chinasi cromatina) - atassia-teleangektaziyu. In questo caso, una malattia ereditaria mortale nei bambini a causa di difetti di riparazione del DNA sviluppa degenerazione delle cellule di Purkinje nel cervelletto, che è accompagnato da un'involuzione del timo causa della morte delle cellule proliferanti. Clinica, fisiopatologia e patomorfologija tazii atassia-teleangek- riprodotti tramite l'introduzione nella CES anomalo informazioni genetiche da chimere topi corrispondono a quelli negli esseri umani. Inoltre l'atassia-teleangektazii utilizzando PGC e topi knockout sviluppato modello sperimentale, alcuni ereditarie malattie umane omozigoti associate a disturbi del metabolismo dei carboidrati e dei lipidi, il catabolismo degli amminoacidi, la rimozione del rame e della bilirubina, che ha aumentato significativamente la possibilità di medicina sperimentale per le prove precliniche di nuovi metodi per il trattamento di malattie rilevanti persona.

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L'uso del cito-ibrido a cellule staminali

Le cellule ibride ottenuti fondendo cellule somatiche da hESCs, sono modello adeguato e promettente per studiare pluripotency cellule staminali e riprogrammazione dei cromosomi di cellule differenziate. Tsitogibridy ottenuto dalla fusione di ESC con cellule differenziate animali adulti, l'occasione per studiare la relazione tra i genomi di differenti "età": si sviluppa una situazione unica in cui i cromosomi omologhi derivati da cellule di vari stadi di differenziazione, e vari gradi di maturità, sono nello stesso nucleo, dove possono facilmente transdeystvuyuschimi condividere segnali regolatori. E 'difficile prevedere come reagiranno tsisregulyatornye sistema epigenetico dei cromosomi omologhi esistente durante yn sviluppo dividuo, in risposta ai segnali impatto transdeystvuyuschih da genomi correlate embrionali. Inoltre, nelle cellule ibride avviene segregazione del cromosoma parentale che consente di studiare l'interazione dei genomi a livello del cromosoma separato, cioè, potenzialmente identificare la parte di cromosomi specifici nel mantenimento della pluripotenza, o al contrario, un'uscita in differenziazione.

Come primo modello sperimentale per studiare l'interazione di genomi di "storia di sviluppo" differente utilizzato tsitogibridy ottenuto fondendo teratokartsinomnyh pluripotenti e cellule somatiche differenziate. In alcuni casi, tali cellule ibride hanno mantenuto proprietà pluripotenti ad un livello sufficientemente elevato. In particolare, le cellule ibride teratocarcinoma-somatiche in vivo hanno indotto lo sviluppo di teratomi veri contenenti i derivati di tutti e tre i fogli germinali e sono stati formati corpi embrioidi in vitro nelle colture in sospensione. Anche in questo tipo di interspecie tsitogibridov notano la presenza di antigeni fetali qualora socio somatica nella fusione con cellule teratocarcinoma erano linfociti o timociti. È interessante notare che i cito-ibridi creati dalla fusione delle cellule di teratocarcinoma con fibroblasti corrispondevano ai fibroblasti secondo il fenotipo.

La più importante è che un dato di fatto che in teratokartsinomno cellule somatiche ibride segni apparsi genoma riprogrammazione di cellule differenziate, caratterizzate da una riattivazione dei singoli geni o inattivo X-cromosoma socio somatico. Pertanto, i risultati di studi su citoibridi come cellule somatiche teratocarcinomatiche indicano che le cellule ibride spesso mantengono la pluripotenza e vi sono segni di riprogrammazione del genoma del partner somatico.

Negli esperimenti per ottenere cellule ibride intraspecifici embrionali fondendo splenociti con l'animale CES topo adulto studiato caratteristiche quali tsitogibridov, analisi segregazione di cromosomi parentali e valutati genoma pluripotenza ibrido. Per le cellule ibride interspecifica prodotte dalle cellule teratocarcinoma fusione con cellule somatiche, generalmente caratterizzato da bassa segregazione di cromosomi con cariotipo tetraploid o quasi tetraploide. Una composizione cromosomica simile è stata osservata nel citocromo dalla fusione di cellule primarie del sesso con linfociti. Allo stesso tempo, cellule ibride interspecifiche ottenute come risultato della fusione di cellule di teratocarcinoma di topo con linfociti di visone, hanno marcato la segregazione cromosomica intensiva del partner somatico.

Un qualitativamente nuova tappa nello studio della segregazione dei cromosomi parentali in ibridi interspecifici è venuto dopo lo sviluppo del metodo di analisi dei microsatelliti utilizzando la reazione a catena della polimerasi, per cui ogni topo cromosoma trovato a poche centinaia di marcatori, che permette di discriminare in modo affidabile tra una qualsiasi coppia di cromosomi omologhi nelle cellule ibride.

Fondendo ESK (usando HM-1 cellule carenti di attività gipoksantinfosforiboziltransferazy, 2n = 40, XY, isolato dal ceppo di blastocisti topo 129 / 01a) con splenociti di topi linea congenic DD / c non è riuscito a ricevere l'insieme di cloni ibridi aveva morfologicamente somiglianza hESC. Tutti i cloni sono stati isolati su terreno selettivo, in cui la crescita è possibile solo con il gipoksantinfosforiboziltransferazoy cella attiva. Analisi elettroforetica ha rivelato la presenza di tutti i cloni variante allelica gipoksantinfosforiboziltransferazy caratteristica topi DD / c. Usando l'analisi citogenetica, si è constatato che quattro avevano tre cloni ibridi okolodiploidny insieme di cromosomi. Un quasi-tetraploide clone conteneva due popolazioni di cellule ibride, uno dei quali era tetraploide, e la seconda, più piccola - diploide.

Analisi di microsatellite consentendo di discriminare qualsiasi coppia di cromosomi omologhi topo 129 / 01a e DD / c, nei cloni ibridi con set okolodiploidnym mostrato che i cloni sono verificati in due distinti eliminazione preferenziale autosomi socio somatica. La maggior parte dei cloni autosomiche HESS2 e HESS3 avevano marcatori linea 129 / 01a, cioè, socio pluripotenti. L'eccezione era il cromosoma 1 e I: cloni HESS2 e HESS3, insieme con i marcatori di HM-1 le cellule, un piccolo numero di marcatori presenti socio somatica. Questi risultati possono riflettere segregazione incompleto di cromosomi 1 ee socio somatica e sono coerenti con i dati citogenetici che trisomia dei cromosomi che si verifica nel 30-40% HESS2 e cloni cellulari HESS3. HESS4 clone significativamente diversa composizione cromosomica: molti autosomi Questo clone originato dal genoma ESK (cromosomi 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 e 17), ma cromosomi 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 e 19 erano rappresentati da omologhi di entrambi i genitori. Il rapporto quantitativo dei microsatelliti che etichettano questi cromosomi omologhi corrispondeva approssimativamente a 1: 1. Questo ha permesso agli autori a suggerire che un omologo è derivato dal genoma del CES e l'altro - da cellule differenziate. In alcuni subclones di clone HESS4 osservata solo gettone di presenza di cromosomi 18 e 19 partner di somatica. I risultati indicano che le cellule clone HESS4, oltre alla segregazione dei cromosomi socio somatica, ci fu l'eliminazione di uno o di entrambi gli omologhi del pluripotenti genoma sopra cromosoma, vale a dire, c'era una segregazione due lati dei cromosomi di entrambi i genitori - il fenomeno è abbastanza insolito, perché tsitogibridov la segregazione caratteristica dei cromosomi solo uno dei genitori.

Inoltre, dopo il 20 ° passaggio, tutti i cloni di cellule ibride contengono solo i marcatori del cromosoma X del partner somatica, cioè, nei cloni è stato sostituito cromosoma X ESC sul cromosoma X del partner somatica. Ciò è confermato dai dati di ibridazione in situ usando una sonda marcata con FITC specifica per il cromosoma X del mouse: un segnale positivo è stato rilevato solo su un cromosoma. Va notato che nelle prime fasi di coltivazione (fino al 15 ° passaggio), in base ai dati citogenetici, in molte cellule c'erano due cromosomi X. Di conseguenza, l'uso di media selettivi consente di manipolare la composizione cromosomica delle cellule ibride e di selezionare selettivamente cloni che trasportano singoli cromosomi del partner somatico sullo sfondo del genoma dell'ESC.

Come caratteristica unica del tsitogibridov genoma è la localizzazione dei genomi parentali in un singolo nucleo, naturalmente, solleva il problema del mantenimento delle proprietà di genoma embrionale ibridi di cellule ESC-somatiche pluripotenti nelle condizioni di stretto contatto con il genoma di cellule differenziate. Morfologicamente il cito-ibrido dell'ESC e le cellule somatiche assomigliavano alla linea genitoriale dell'ESC. La valutazione della pluripotenza mostrò che tutti i cloni con un gruppo di cromosomi quasi diploidi erano in grado di formare corpi embrioidi in colture di sospensione in cui erano presenti derivati di tre fogli germinali.

La maggior parte delle cellule ibride conteneva l'antigene ECMA-7, un marcatore caratteristico dei primi embrioni di topo e aveva anche un'alta attività di fosfatasi alcalina. I dati più convincenti sulle proprietà pluripotenti elevate delle cellule ibride sono stati ottenuti in esperimenti per ottenere una serie di chimere iniettabili che coinvolgono cellule ibride del clone HESS2. Un'analisi dei marcatori biochimici ha mostrato che i discendenti di cellule ibride donatrici sono stati trovati nella maggior parte dei tessuti chimerici. Pertanto, le cellule ibride ottenute mediante fusione di ESC e cellule somatiche differenziate mantengono la pluripotenza ad un livello elevato, inclusa la capacità di formare chimere quando inserite nella cavità blastocica.

Cloni HESS2 e HESS4 differivano in modo significativo in composizione dei cromosomi dei genitori, ma ha avuto simili proprietà pluripotenti. Si potrebbe supporre che plyuripotentnostv 'nel genoma ibrido si manifesta come un segno dominante, ma è possibile che non tutti i cromosomi del genoma embrionali sono coinvolti nel mantenimento della pluripotenza. Se questa ipotesi è vera, si può prevedere che l'eliminazione di alcuni cromosomi socio pluripotenti dal genoma delle cellule ibride non è accompagnata da un cambiamento nel loro stato di pluripotenti. In questo caso, l'analisi della segregazione del cromosoma parentale in cellule embrionali ibride permetterebbe di avvicinarsi per identificare cromosomi responsabili per il controllo della pluripotenza delle cellule embrionali.

O. Serov e co-autori (2001) non hanno trovato tra 50 discendenti ottenuti incrociando chimere con topi normali, come sarebbe il genotipo dei topi 129 / 01a e portando il cromosoma X dei topi DD. Gli autori ne vedono la ragione nella riduzione della pluripotenza nelle cellule ibride sotto l'influenza del genoma somatico. Una spiegazione alternativa potrebbe essere l'effetto negativo della trisomia su alcuni autosomi e squilibri nei cromosomi sessuali (XXY sono stati osservati nelle cellule fino al 15 ° passaggio) nelle cellule ibride quando hanno superato la meiosi. È noto che le cellule di XXY non possono passare attraverso la meiosi e formare gameti. La trisomia è anche in grado di causare una diminuzione dell'attività proliferativa delle cellule ibride, in conseguenza della quale il vantaggio selettivo nello sviluppo di chimere può appartenere alle cellule dell'embrione ricevente. Ne consegue che per valutare adeguatamente il potenziale pluripotente delle cellule ibride, è necessario ottenere cloni ibridi con un normale set diploide di cromosomi.

Negli esperimenti Serova O. Et al (2001) prima dimostrato la possibilità di riprogrammare il cromosoma X nel genoma di una cellula cellule somatiche ibridi. Questa conclusione consegue gli autori analizzano l'espressione del gene HPRT chimere (marcatore cromosoma X): la presenza di varianti alleliche HPRT DD / c topi è stata rilevata in tutti i tessuti analizzati chimerico. Va sottolineato che, dopo l'introduzione di cellule ibride nella cavità blastocisti tsitogibridy rientrano in condizioni non selettivi e la conservazione del cromosoma X nel genoma delle cellule ibride significa che è diventato un componente obbligato del suo genoma e non discriminare dal compagno cromosoma pluripotenti Y.

Riassumendo i risultati dell'analisi dell'interazione di genomi somatici e pluripotenti in cellule embrionali ibride, gli autori concludono che in alcuni citofibridi la pluripotenza si manifesta come un tratto dominante. Un genoma ibrido è in grado di riprogrammare i singoli cromosomi delle cellule differenziate, che, tuttavia, non esclude la possibilità dell'effetto opposto del genoma somatico sulla pluripotenza del genoma embrionale. Nella coltivazione di cellule ibride, l'induzione di differenziazione avviene molto più spesso rispetto alla linea genitore originale dell'ESC NM-1. Un effetto simile si osserva anche nella formazione delle colonie primarie: molte colonie primarie di cellule ibride embrionali si differenziano in stadi precoci di formazione con grandi perdite di cloni durante la loro selezione e moltiplicazione.

Così, le citofiridi create dalla fusione di ESC con cellule somatiche, nonostante lo stretto contatto con il genoma delle cellule differenziate, preservano la pluripotenza come una proprietà unica del genoma embrionale. Inoltre, in tali cellule ibride, è possibile riprogrammare i singoli cromosomi originati dalle cellule diffuse. Non è chiaro fino a che punto le proprietà pluripotenti del genoma embrionale nelle cellule ibride persistano, in particolare, la loro capacità di partecipare alla formazione del percorso embrionale nelle chimere. Per questo, è necessario ottenere cellule ibride embrionali con un normale cariotipo. In ogni caso, le cellule ibride embrionali pluripotenti possono essere un vero modello per l'identificazione genetica dei cromosomi coinvolti nel mantenimento della pluripotenza suo controllo la segregazione di cromosomi parentali bilaterale potenzialmente fornisce una tale opportunità.

Non meno attraente è lo studio del fenomeno, che O. Serov e co-autori (2001) definiscono come "memoria cromosomica". Nel genoma ibrido cromosomi omologhi sono due configurazioni alternative: omologhi somatica socio differenziazione volta subito, mentre omologhi socio pluripotenti, questo processo è solo all'inizio. Pertanto, mantenendo elevate proprietà pluripotenti di cellule ibride indica che "pluripotenti" omologhi configurazione ESC piuttosto stabili nei genomi ibridi, nonostante l'impatto dei fattori transdeystvuyuschih provenienti dal partner somatico. Le caratteristiche sopra descritte di riprogrammazione differenziata cromosomi omologhi genoma durante lo sviluppo delle chimere non escludono la possibilità che le prime fasi di formazione in vitro e coltura tsitogibridov mantengono il loro stato acquisito durante la differenziazione in vivo. Secondo dati recenti, durante il trasferimento di cellule ibride embrionali in terreno non selettivo in cui v'è un solo cromosomi eliminazione socio somatica intensiva, cioè, il genoma di cellule ibride discrimina facilmente omologhi dopo coltura in vitro per 10-15 passaggi. Pertanto, le cellule embrionali embrionali rappresentano un modello sperimentale promettente per lo studio non solo di una proprietà fondamentale del genoma embrionale come pluripotenza, ma anche delle sue alternative - differenziazione embrionale.

Efficacia terapeutica del trapianto di cellule staminali embrionali

Prima di analizzare l'efficacia terapeutica del trapianto di ESC e dei loro derivati, riassumiamo il materiale di cui sopra. Caratteristiche ESC in termini di piena attuazione di embriogenesi in vitro sono insufficienti a causa di difetti in questo caso grazie alla assenza di cellule staminali mesenchimali che si verificano nel corpo autonomo e indipendente da hESC. La potenza genetica dell'ESC è inferiore al potenziale genetico dello zigote, quindi non è direttamente utilizzato per la clonazione di embrioni. L'eccezionale potenziale biologico dell'ESC come le uniche cellule in cui i programmi di sviluppo sono distribuiti in piena implementazione sequenziale trova applicazione negli studi sulla funzione dei geni. Con l'aiuto dell'ESC, vengono decifrate le prime combinazioni di segnali che attivano l'espressione di geni precoci e tardivi che codificano lo sviluppo di tre fogli embrionali. La conservazione della pluripotenza del genoma dell'ESC in vitro li rende uno strumento unico per la rigenerazione riparativa, in grado di reintegrare automaticamente le perdite cellulari nel danneggiamento di organi e tessuti. In un ideale ipotetico forma di realizzazione può assumere che "... Nel trapianto di PGC donatori nell'organismo ricevente trasferiti programmi compatto confezionati che in condizioni favorevoli sono realizzati nella costruzione del nuovo tkani'7 capace" ... Effettivamente integrati nel corpo del ricevente come morfologica, sia funzionale che funzionale. "

Naturalmente, in seguito allo sviluppo dei metodi di monodifferenziazione dell'ESC, è iniziato lo studio in vivo dell'attività funzionale delle cellule ottenute in vitro da un singolo clone specializzato. Il clone ESO proliferante genera popolazioni di cellule progenitrici migratrici che sono realmente in grado di integrarsi attivamente nelle zone di danno tissutale del ricevente, che viene utilizzato nella medicina di plastica rigenerativa. È stato dimostrato che il trapianto di Dopa-neuroni in substantia nigra riduce le manifestazioni cliniche nell'emiparkinsonismo sperimentale. I trapianti regionali di cellule staminali neurali donatrici riducono il grado di disturbi motori causati da traumi o contusioni del midollo spinale e del cervello. Ricevuto e i primi risultati positivi del trapianto di cellule staminali in malattie demielinizzanti. Sembrerebbe che le potenze di plastica rigenerativa delle ESC aprano possibilità illimitate per l'utilizzo del trapianto cellulare nella medicina pratica. Tuttavia, quando si trapiantano in zone ectopiche, le ESC si trasformano inevitabilmente in tumori. Quando l'iniezione sottocutanea di ESC in topi immunodeficienti teratomi si formano. Quando la sospensione ESK viene trapiantata sotto la capsula del testicolo in topi singenici, si forma anche un teratoma, costituito da diversi tessuti, le cui cellule derivano da tutti e tre i foglietti embrionali. In tali teratomi, i processi di organogenesi ridotta sono estremamente rari.

Numerose opere forniscono informazioni sui risultati positivi del trapianto di derivati precoci di ESCO su animali con patologia esperienziale. Il neurotrapianto cellulare mediante derivati dell'ESC viene ulteriormente sviluppato nell'esperimento e nei primi studi clinici per correggere i disturbi funzionali nelle lesioni cerebrali e spinali, nel trattamento della siringomielia e della sclerosi multipla (Repin, 2001). Con l'avvento della tecnica della neuronogenesi da ESK in vitro, invece di utilizzare il tessuto cerebrale embrionale, sono in fase di sviluppo metodi di trapianto di derivati di neurosfere derivate da colture di tessuto nervoso embrionale. Tali sospensioni di trapianto sono molto più omogenee e contengono precursori neuronali e neuroglia impegnati.

In aggiunta al mezzo di coltura regolare con acido retinoico alla dose di 10 ug / ml per 6 settimane in linee embrionali (teratomi) NTERA-2 -kartsinomy umana formata oltre l'80% dei neuroni post-mitotici. La completa omogeneità della popolazione neuronale si ottiene il flusso di smistamento marcatori immunofenotipici etichettati di neuroni maturi che può sbarazzarsi dei resti teratokartsinomnyh e le cellule immature. Dopo il trapianto in varie regioni del cervello di animali da esperimento, tali neuroni non solo sopravvivono, ma sono anche integrati nelle reti neurali regionali. In animali con modelli sperimentali di difetti locali CNS neurotransplantation riduce manifestazioni cliniche della patologia umana come gli effetti del trauma craniocerebral, ictus, malattie demielinizzanti, difetti di sviluppo cerebellare ereditarie, malattie deposizione di lipidi e polisaccaridi.

Per ottimizzare i processi di rigenerazione nelle malattie degenerative del sistema nervoso centrale, sono in fase di sviluppo tecnologie per la preparazione di oligodendrociti produttori di mielina da ESK. Il primo stadio comporta tradizionalmente la proliferazione di ESCs con la moltiplicazione del numero di cellule necessarie per il trapianto. Nella seconda fase, viene effettuata la differenziazione diretta delle cellule in una popolazione di precursori oligodendrociti produttori di mielina, che è controllata da antigeni marcatori selettivi.

Alcune prospettive sono aperte per utilizzare derivati CES di sviluppare metodi per la correzione di immunodeficienza causata da difetti genetici nella maturazione del timo. In studi in knockout (rag 1) topi con difetto gene indotto - violazione meccanismo di ricombinazione V (D) J loci genici TCR, che portano a perdita di funzione di T-linfociti, trapianto prime derivate di PGC in timo animale recupera maturazione delle normali popolazioni di cloni immunitarie responsabili immunità cellulare. Gli studi clinici del trapianto di preformati in hESC in vitro per il trattamento di anemia ereditaria fatale nei bambini.

Le obiezioni alla rapida introduzione del trapianto di cellule staminali nella clinica sono giustificate da un numero limitato di linee stabili di cellule staminali embrionali umane e dalla necessità della loro standardizzazione. Per aumentare la purezza delle linee ESC standardizzate, così come delle cellule staminali adulte, è suggerito un metodo di selezione della linea basato sull'analisi genetica molecolare di brevi ripetizioni in tandem del DNA. È anche necessario testare le linee ESC per la presenza di piccoli riarrangiamenti cromosomici e mutazioni genetiche, la possibilità potenziale della loro presenza in condizioni di coltivazione cellulare è sufficientemente alta. Tesi estende obbligatorio testare le proprietà di tutti i tipi di PGC e cellule staminali pluripotenti regionali, poiché la loro propagazione in vitro può dare origine a nuove caratteristiche non inerenti cellule staminali embrionali verso definitiva o tessuti. In particolare, si presume che la coltivazione a lungo termine in media con citochine Hess più vicino alle cellule tumorali, poiché avvengono cambiamento percorsi simili che regolano il ciclo cellulare, con l'acquisizione della capacità di implementare un numero illimitato di divisioni cellulari. Alcuni autori, sulla base del potenziale per lo sviluppo di tumori, considerano il trapianto umano di derivati precoci delle cellule staminali embrionali come incoscienza. Secondo loro, è molto più sicuro usare i discendenti impegnati dell'ESC, cioè le linee degli antenati delle cellule differenziate. Tuttavia, non è stata ancora sviluppata una tecnica affidabile per ottenere linee cellulari umane stabili che si differenziano nella giusta direzione.

Pertanto, in letteratura ci sono sempre più dati sull'effetto terapeutico positivo del trapianto di derivati di cellule staminali embrionali umane. Tuttavia, molti di questi lavori sono soggetti a revisioni e critiche. Alcuni ricercatori ritengono che i risultati dei primi studi clinici siano di natura preliminare e suggeriscono solo che le cellule staminali possono avere un effetto benefico sul decorso clinico di una malattia. Pertanto, è necessario ottenere dati sui risultati a lungo termine del trapianto di cellule. Come argomento, vengono fornite le fasi di sviluppo della neurotransplantologia clinica. Infatti, nella letteratura, inizialmente dominato dalla pubblicazione della elevata efficienza dei trapianti di cervello frammenti di embrioni nella malattia di Parkinson, ma poi ha cominciato a comparire i rapporti che negano l'efficacia terapeutica del tessuto neurale embrionale o fetale trapiantate nel cervello di pazienti.

Condotti i primi esperimenti clinici che valutano la sicurezza del trapianto neuroblast - derivati di PGC NTERA-2 teratocarcinoma, cellule immature che proliferano in coltura sono stati sottoposti a stoccaggio 100 massa cellulare milionesimo. Parte delle cellule così ottenute è stata utilizzata per determinare le caratteristiche di fenotipo cellulare e impurezze, nonché per testare potenziale contaminazione da virus e batteri. Dal mezzo di coltura è stato rimosso e LIF strato alimentatore di cellule stromali e condizioni create fetali per differenziazione diretta di hESC in neuroblasti con una combinazione di citochine e fattori di crescita. Quindi, i neuroblasti sono stati purificati da cellule di teratocarcinoma immature su un sorter a gabbia di flusso. Dopo la seconda purificazione e caratterizzazione del fenotipo di cellule neuroblasti trapiantati (10-12 milioni) sospensione con una speciale siringa e microcannulas stereotassia e sotto il controllo di CT iniettato nel nucleo basale del cervello di pazienti (settimo mese dopo ictus emorragico). Lo screening di un anno post-trapianto delle conseguenze del trapianto neuronale nella zona dell'ictus non ha mostrato effetti collaterali ed effetti indesiderati. La metà dei pazienti ha avuto un miglioramento della funzionalità motoria nel periodo da 6 a 12 mesi dopo il trapianto. Cambiamenti clinici positivi sono state accompagnate da un aumento nella zona di ictus apporto di sangue dopo il trapianto di cellule: aumento dell'assorbimento medio del 2-deossiglucosio fluorescenza-etichettato, secondo la tomografia ad emissione di positroni raggiunto il 18%, e in alcuni pazienti - 35%.

Tuttavia, l'Istituto Nazionale della Salute degli Stati Uniti ha condotto uno studio indipendente sull'efficacia clinica dei neurotrapianti nei pazienti con Parkinsonismo. I pazienti del primo gruppo sono stati trapiantati con tessuto cerebrale embrionale producendo dopamina, mentre il secondo gruppo di pazienti ha subito una falsa operazione. I risultati indicano un'efficacia clinica zero di tale neurotrapianto, nonostante il fatto che i neuroni embrionali produttori di dopamina siano sopravvissuti nel cervello dei riceventi. Inoltre, dopo 2 anni dopo il trapianto del tessuto neurale del feto nel 15% dei pazienti ha sviluppato discinesia persistente, che è assente nei pazienti del gruppo placebo (cellule staminali: il progresso scientifico e direzioni di ricerca future Nat Inst, della Salute USA ...). Le osservazioni sull'ulteriore sviluppo della malattia in questi pazienti continuano.

Alcuni autori attribuiscono la letteratura contraddittorio sulla valutazione dei dati di efficacia Neurotransplantation clinici con un diverso approccio alla selezione di gruppi di pazienti, scelta inadeguata di metodi oggettivi per valutare la loro condizione e, soprattutto, differenti termini di sviluppo del tessuto nervoso fetale e in diverse parti del cervello da cui il tessuto è stato prodotto in diverse misure trapianto e caratteristiche metodiche della chirurgia.

Va notato che tenta di dirigere il trapianto di cellule staminali embrionali pluripotenti nella regione striatale del cervello di ratti con sperimentali gemiparkinsonizmom corpo accompagnato ESC proliferazione e loro differenziazione in neuroni dopaminergici. Si deve presumere che neuroni di nuova formazione siano stati effettivamente costruiti nelle reti neuronali, poiché dopo il trapianto di ESC è stata osservata la correzione delle anomalie comportamentali e dell'asimmetria motoria nel test dell'apomorfina. Allo stesso tempo, alcuni degli animali sono morti a causa della trasformazione dell'ESK trapiantato nel tumore cerebrale.

Gli esperti della National e Medical Academy degli Stati Uniti, gli specialisti del National Institutes of Health ritengono che il potenziale clinico di hESC merita una seria attenzione, tuttavia, insiste sulla necessità di uno studio dettagliato delle loro proprietà, la probabilità di complicanze ed effetti a lungo termine esperimenti con modelli biologici adeguati di malattie umane (cellule staminali e la la futura medicina rigenerativa National Academy Press, le cellule staminali e le future direzioni di ricerca., Nat. Inst, di Health USA).

Da questo punto di vista, è importante che l'analisi istologica comparativa di teratoma sperimentali ottenuti da trapianto in testicoli PGC slurry con teratomi che hanno sviluppato a causa di trapianto embrione precoce, che include anche presente ESC mostrato che ESK indipendentemente dalla loro origine o interazione con da quelle o altre cellule circostanti allo stesso modo realizzano le loro potenze tumorigeniche. Si dimostri che tali teratomi hanno un'origine clonale, come da un CES tumore può verificarsi, costituito dai derivati di tutti tre strati germinali (.Rega, 2001). È da notare che quando trapiantati in topi immunodeficienti PGC con cariotipo normale e teratomi formate consiste di una varietà di tipi di cellule somatiche differenziate clonati. Questi dati sperimentali sono la prova perfetta dell'origine clonale del teratom. Dal punto di vista della biologia dello sviluppo, suggeriscono che non è multiplo di cellule progenitrici impegnati e pluripotenti identità cellule staminali è la fonte di derivati differenziati di tutti e tre gli strati germinali, componenti teratoma. Tuttavia, nei pratici risultati di trapianto di cellule di questi studi sono, se non proibitivo, quindi un segnale di avvertimento di pericolo potenziale, dal momento che ESC inoculazione o cellule germinali primordiali in diversi tessuti di topi immunodeficienti adulti provoca inevitabilmente lo sviluppo di tumori delle cellule staminali trapiantate. Degenerazione neoplastica ectopicamente trapiantato ESC accompagnato dalla comparsa di popolazioni satellitari di cellule differenziate - parzialmente differenziare è certamente CES e cloni progenitrici linee dedicate. È interessante notare che quando si trapianta l'ESC nei muscoli scheletrici vicino alle cellule di teratocarcinoma, i neuroni si formano più spesso. Tuttavia, in PGC somministrazione di Mace uovo o blastocisti accompagnati da una piena integrazione nelle cellule germinali, senza la formazione di cellule neoplastiche. In questo caso, gli ESC sono incorporati praticamente in tutti gli organi e tessuti dell'embrione, incluso il rudimento sessuale. Tali animali allofenici sono stati inizialmente ottenuti introducendo le cellule di teratocarcinoma 129 in embrioni precoci negli stadi di 8-100 cellule. In allofennyh popolazioni topi geterogenomnyh PGC donatore di cellule di derivazione sono introdotti nel midollo osseo, intestino, pelle, fegato e genitali, che permette di creare nell'esperimento anche interspecie chimere di cella. Minore è il tempo di embrione precoce, maggiore è la percentuale di cellule chimerization, il più alto grado chimerization osservata nel sistema ematopoietico, pelle, sistema nervoso, fegato e intestino tenue allofennogo embrione. Nel organismo adulto tessuto chimerization suscettibili protetti dall'esposizione al sistema immunitario delle barriere destinatario gistogematicalkie: trapianto cellule germinali primordiali nel parenchima testicolo corredate di inserimento di cellule staminali del donatore nello strato ricevente tessuti germenativny. Tuttavia, ESC trapianto in una formazione blastocisti chimeriche genitali Primordia con cellule primordiali germinali donatrici generazione non si verifica. ESC pluripotenzialità quando crea condizioni specifiche e può essere utilizzato per il clonaggio: topi trapianto ESC 8-16 cellule di embrione di topo, cellule mitosi cui tsitokalazinom bloccato, contribuisce al embriogenesi normale con lo sviluppo delle PGC embrione donatore.

Di conseguenza, in alternativa è il trapianto allogenico di clonazione terapeutica ESC basato sul trapianto nucleare di cellule somatiche in un ovocita enucleato per creare una massa cellulare interna blastocisti da cui vengono poi assegnati linea di PGC donatrici geneticamente identici nucleo somatico. Tecnicamente, questa idea è realizzabile, poiché la possibilità di realizzazione di linee di hESC da blastocisti ottenuti dopo trapianto di nuclei somatici nella cellula uovo enucleata ripetutamente dimostrato in esperimenti su animali da laboratorio (Nagy, 1990; Munsie, 2000). In particolare nei topi omozigoti per la mutazione RAG2, fibroblasti ottenute coltivando cellule tissutali subepidermiche stati usati come nuclei donatori vengono trapiantate in oociti enucleati. Dopo l'attivazione, oociti "zigote" colta fino alla formazione di blastocisti, dalla massa cellulare interna è PGC isolati e li passa in una linea di cellule gene mutante nullizigotnyh (RAG2 ~ / ~). Con la ricombinazione omologa in tali ESCs, la mutazione di un gene allelico è stata corretta. Nella prima serie di esperimenti da hESC gene ricombinante recuperato corpi embrionali sono stati preparati, trasfettate cellule degli stessi con un retrovirus ricombinante (HoxB4i / GFP) e dopo propagazione in topi iniettati RAG2 vena ~ / ~. Nella seconda serie, i blastomeri tetraploidi sono stati aggregati con ESC geneticamente modificati e trapiantati nelle loro donne destinatarie. I topi immunocompetenti nati servivano come donatori di midollo osseo per il trapianto a topi mutanti rag2 ~ / ~. In entrambe le serie, il risultato è stato positivo: 3-4 settimane in tutti i topi di normali cellule mieloidi e linfoidi mature sono stati trovati in grado di produrre immunoglobuline. Così, trapianto in nuclei di oociti di cellule somatiche può essere utilizzato non solo per produrre linee di hESC, ma anche per tsitogenoterapii - Correzione di anomalie ereditarie utilizzando ESC come vettore per trasporto di correggere le informazioni genetiche. Ma in questa direzione del trapianto di cellule, oltre ai problemi bioetici, ci sono dei limiti. Non è chiaro come sicuro il trapianto sarebbe terapeuticamente cellule clonato con un genotipo identico al genotipo di un particolare paziente, poiché tali cellule possono introdurre mutazioni che creano una predisposizione a determinate malattie. Ovuli umani normali rimangono oggetto inaccessibile, mentre anche quando il trapianto nuclei somatici in ovocita enucleato animale solo 15-25% ingegnerizzato "zigote" sviluppare allo stadio di blastocisti. Non è determinato la quantità di blastocisti necessaria per ottenere una singola linea di CEC clonati pluripotenti. Va notato e l'alto livello dei costi finanziari associati alla complessità della metodologia di clonazione terapeutica.

In conclusione, nel genoma pluripotenza ESC hypomethylated DNA è combinato con elevata attività telomerasica e la fase C ^ breve ciclo cellulare, che garantisce moltiplicazione intensiva e potenzialmente infinita, durante il quale i PGC conservano cromosomi diploidi e "giovanile" insieme di caratteristiche fenotipiche. Crescita clonale di PGC in coltura non osta li differenziano in qualsiasi cellula specializzata dell'organismo ad una linea di arresto proliferazione e aggiungendo opportuni segnali regolatori. Restrizione differenziazione delle hESC in linea in cellule somatiche vitro si realizza senza la partecipazione del mesenchima, bypassando Nohteyaov, è organogenesi e senza la formazione dell'embrione. La somministrazione ectopica dell'ESC in vivo porta inevitabilmente alla formazione di teratocarcinomi. ESC trapianto in una blastocisti o embrione precoce accompagnati dal loro integrazione con i tessuti dell'embrione e dei suoi organi chimerization stabili.

Tecnologie rigenerativa e plastica a base di trapianto di cellule è il punto di intersezione degli interessi dei membri della biologia cellulare, biologia dello sviluppo, la genetica sperimentale, l'immunologia, neurologia, cardiologia, ematologia, e molti altri campi della medicina sperimentale e pratico. I più importanti risultati sperimentali dimostrano la possibilità di riprogrammare le cellule staminali con la direzione del cambiamento delle loro proprietà, che apre prospettive per il controllo di processi citodifferenziazione con fattori di crescita - per la rigenerazione miocardica, il ripristino delle lesioni del SNC e normalizzazione della funzione dell'apparato isolotto del pancreas. Tuttavia, le diffuse derivati trapianto introduzione ESC nella pratica medica è necessario esaminare le proprietà delle cellule staminali umane in modo più dettagliato e ulteriori esperimenti con PGC in modelli sperimentali di malattie.

Questioni bioetiche e il problema del rigetto del trapianto allogenico di cellule potrebbero risolvere la plasticità osservata del genoma delle cellule staminali adulte regionali. Tuttavia, l'informazione iniziale è che quando il trapianto del fegato cellule ematopoietiche autologhe isolate e completamente caratterizzati, di cui ci sono nuovi epatociti, che incorporano nei lobuli epatici, vengono ora esaminato e criticato. Tuttavia, i dati pubblicati che il trapianto di cellule staminali neuronali nel timo è la formazione di nuovi germogli di donatori T-e linfociti B, e il trapianto di cellule staminali neurali del cervello nel midollo osseo porta alla formazione di ematopoietica germe sostenuta mieloide donatore e eritropoiesi . Di conseguenza, in organi adulti possono essere conservate le cellule staminali pluripotenti capaci di genoma riprogrammazione di ESC alla capacità.

L'embrione umano rimane la fonte di ricevere l'ESC per scopi medici, che predetermina l'inevitabilità di una nuova intersezione di problemi morali, etici, morali, legali e religiosi al momento della nascita della vita umana. La scoperta di ESC ha dato un forte impulso alla ripresa di dure discussioni su dove si trova la linea tra cellule viventi e materia, sostanza e personalità. Allo stesso tempo, non ci sono norme universali, regole e leggi riguardanti l'uso dell'ESC in medicina, nonostante i ripetuti tentativi di crearli e accettarli. Ogni stato all'interno della propria legislazione risolve questo problema da solo. Da parte loro, i medici di tutto il mondo continuano a cercare di sviluppare la medicina plastica rigenerativa oltre a queste discussioni, principalmente attraverso l'uso di cellule staminali non embrionali e le riserve di cellule staminali di un organismo adulto.

Parte della storia dell'isolamento delle cellule staminali embrionali

Terato- (embrione), le cellule sono state isolate da -kartsinomnye verificano spontaneamente testicolare ceppo teratomi topo 129 cellule / ter-Sv, spontanei ovariche linee teratomi topo Lt / Sv, e da teratomi, ektopichno fonte sono state trapiantate o tessuto embrionale. Tra linee così ottenute terato- stabili topo (embrione) -kartsinomnyh alcune cellule sono pluripotenti, altri sono stati sottoposti alla differenziazione solo nelle cellule di un tipo particolare, e alcuni sono generalmente incapaci di citodifferenziazione.

Al momento, il focus è la ricerca che ha mostrato un possibile terato- ritorno (embrione) cellule -kartsinomnyh al fenotipo normale dopo la loro introduzione nel tessuto embrionale di sviluppo, così come lavoro per creare in vitro terato- geneticamente modificati (embrione) -kartsinomnyh cellule, con l'aiuto di quali topi mutanti sono stati ottenuti per la modellizzazione biologica della patologia ereditaria umana.

Per isolare le linee delle cellule di terato-embrione-carcinoma è stata utilizzata la coltivazione a sospensione condizionata. Nella cultura terato- (embrione) -kartsinomnye cellule, come CES, crescere per formare corpi embrionali e richiedono di essere tradotti in una linea di dissociazione vincolante mantenendo pluripotency su uno strato alimentatore di fibroblasti embrionali o coltura in sospensione mezzi condizionati. Terato- cellule pluripotenti (embrione) - linee di carcinoma grande, sferiche, hanno una elevata attività di fosfatasi alcalina, formano aggregati e sono in grado di differenziazione multidirezionale. Quando introdotto in una blastocisti sono aggregati con morule, causando la formazione di embrioni chimerici, nei vari organi e tessuti che si trovano derivati terato- (embrione) cellule -kartsinomnyh. Tuttavia, la maggior parte di tali embrioni chimerici muoiono in utero, e in organi sopravvivere chimere cellule estranee neonati e raramente rilevata con una bassa densità. Allo stesso tempo, l'incidenza di tumori (fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, e altri tipi di gonfiore maligne e adenoma Pancreas) aumenta bruscamente, e degenerazione neoplastica spesso si verifica anche in utero embrioni chimerici.

La maggior parte delle cellule di terato-embrione-carcinoma nel microambiente delle normali cellule embrionali quasi naturalmente acquisiscono caratteristiche neoplastiche maligne. Si ritiene che la neoplasia irreversibile sia dovuta all'attivazione dei proto-oncogeni nel processo di riarrangiamenti strutturali. Un'eccezione sono le linee cellulari embriokartsinomnoy SST3, teratoma derivato dal testicolo murino (line 129 / Sv-ter), che presentano una elevata capacità di integrarsi nel tessuto e organi del feto senza la successiva formazione di tumori nei topi chimerici. Derivati di linee cellulari di terato-embrinea-carcinoma in topi chimera praticamente non partecipano alla formazione di gonociti primari. Ovviamente, è collegato con una elevata frequenza di aberrazioni cromosomiche comuni alla maggior terato- (embrione) linee -kartsinomnyh in cui le cellule osservate per quanto aneuploidia o anomalia cromosomica.

In laboratorio sono state ottenute diverse linee stabili di carcinomi terato-embrionali umani, caratterizzati da pluripotenza, alta attività proliferativa e capacità di differenziarsi con la crescita in colture. In particolare, la linea di cellule umane di carcinoma-terato-embrione NTERA-2 è stata utilizzata per studiare i meccanismi del citodifferenziamento neurale. Dopo il trapianto di cellule di questa linea nella regione subventricolare del proencefalo dei ratti neonati, è stata osservata la loro migrazione e neuronogenesi. Ci sono stati anche tentativi di trapiantare terato- neuronale ottenute coltivando cellule (embrione) linea -kartsinomnoy NTERA-2, a pazienti con ictus, che, secondo gli autori, che portano ad un miglioramento clinico della malattia. In questo caso, i casi di malignità delle cellule trapiantate della linea terato-embryo-carcinoma NTERA-2 in pazienti con ictus non sono stati notati.

Evans e Martin hanno ricevuto le prime linee di cellule staminali embrionali pluripotenti indifferenziate dai topi nei primi anni '80 del secolo scorso, isolandole dalla massa cellulare interna della blastocisti, l'embrioblasto. Le linee ESC isolate hanno a lungo conservato la pluripotenza e la capacità di differenziarsi in diversi tipi di cellule sotto l'influenza di fattori di un particolare terreno di coltura.

Il termine "cellule staminali pluripotenti embrionali" appartiene Leroy Stevens che l'indagine dell'impatto catrame tabacco sulla frequenza di sviluppo del tumore ha attirato l'attenzione al verificarsi di teratocarcinoma spontanea testicolare lineare (129 / v) di topi del gruppo di controllo. Cellule teratocarcinoma testicolari sono stati caratterizzati da un tasso di proliferazione elevata, e in presenza di liquido rimasto nella cavità addominale con la formazione di differenziazione spontanea di neuroni, cheratinociti, condrociti, cardiomiociti, così come frammenti di capelli e ossa, ma senza alcuna indicazione di un cytoarchitectonics ordinate tessuto appropriato. Quando piantare nella coltura cellulare teratocarcinoma cresciuto distaccato da cloni pluripotenti substrato e corpi embrionali formate furono quindi spenta e sottoposti a disordinata fissione spontanea differenziarsi in neuroni, glia, cellule muscolari e cardiomiociti. Stevens trovato che teratocarcinoma topo 129 / v contiene meno di 1% di cellule capaci di differenziarsi in una varietà di linea somatica specializzata, e si differenziazione dipende da fattori che li riguardano (composizione del fluido peritoneale, i prodotti aggiunti alla coltura di cellule o tessuti maturi). Leroy Stevenson ipotesi circa la presenza tra cellule teratocarcinoma cellule germinali sessuale embrionale progenitrici stata confermata: la sospensione embrioblasto cellule embrioni preimpianto in tessuti di topo adulto teratocarcinoma formata e separata dal loro linee cellulari pure dopo somministrazione intraperitoneale di animali recipienti aveva differenziate in neuroni, cardiomiociti e altre kletki somatica derivati di tutti tre strati germinali. In esperimenti in vivo trapianto ESK (ottenuto da embrioblasto ma non trofoblasto) in embrioni di topo a differenti linee fasi 8-32 blastomere chiuso nascita dell'animale chimerico (senza formazione di tumori) in organi che rileva il tessuto donatore germogli. Chimerismo è stata osservata anche nella linea di cellule sessuali.

Cellule germinali progenitrici primaria isolati da embrione di topo germe di sesso, la morfologia, il fenotipo immunologico e caratteristiche funzionali coerenti con hESC derivate da teratocarcinoma Stevenson e embrioblasto. Al chimere nati dopo somministrazione di hESC in blastocisti, allofenny morfogenesi organo caratterizzato mosaico donatore e ricevente alternata strutturale e unità funzionali del fegato, polmone e rene. In un certo numero di casi, è stata osservata la formazione di cripte intestinali o di lobuli del fegato, costituiti contemporaneamente da cellule riceventi e donatrici. Tuttavia, sempre la realizzazione della morfogenesi avveniva secondo il programma genetico della specie a cui apparteneva il ricevente, e il chimerismo era limitato unicamente al livello cellulare.

Poi, si è constatato che la proliferazione delle hESC senza citodifferenziazione su un alimentatore cellule mesenchimali strato di derivazione (fibroblasti fetali) avviene in presenza di legare LIF in terreni di coltura selettivi che forniscono selettivamente solo la sopravvivenza delle cellule staminali e progenitrici, mentre la maggior parte degli elementi cellulari specializzati muore. Con l'aiuto di queste tecniche nel 1998 da James Thomson è stato allocato cinque linee immortalizzate di cellule staminali embrionali dalla massa cellulare interna della blastocisti una persona. Nello stesso anno, John Gerhart ha sviluppato un metodo per isolare le linee ESC immortali dal soffio sessuale di quattro-cinque settimane embrioni umani. A causa delle loro proprietà uniche, in soli due anni, le cellule staminali embrionali e le cellule staminali dei tessuti definitivi hanno già iniziato ad essere utilizzate nella pratica della medicina rigenerativa e della terapia genica.