Valvole cardiache artificiali

Le moderne valvole cardiache artificiali biologiche disponibili per uso clinico, ad eccezione dell'autotrapianto polmonare, sono strutture non vitali prive del potenziale di crescita e riparazione tissutale. Ciò impone significative limitazioni al loro utilizzo, soprattutto nei bambini, per la correzione delle patologie valvolari. L'ingegneria tissutale si è sviluppata negli ultimi 15 anni. L'obiettivo di questo orientamento scientifico è quello di creare in condizioni artificiali strutture come le valvole cardiache artificiali con una superficie tromboresistente e un interstizio vitale.

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Come vengono sviluppate le valvole cardiache artificiali?

Il concetto scientifico dell'ingegneria tissutale si basa sull'idea di popolare e far crescere cellule viventi (fibroblasti, cellule staminali, ecc.) in un'impalcatura assorbibile sintetica o naturale (matrice), che è una struttura valvolare tridimensionale, nonché sull'uso di segnali che regolano l'espressione genica, l'organizzazione e la produttività delle cellule trapiantate durante il periodo di formazione della matrice extracellulare.

Tali valvole cardiache artificiali vengono integrate con i tessuti del paziente per il ripristino finale e l'ulteriore mantenimento della loro struttura e funzione. In questo caso, una nuova struttura di collagene-elastina o, più precisamente, una matrice extracellulare si forma sulla matrice originale grazie al funzionamento di cellule (fibroblasti, miofibroblasti, ecc.). Di conseguenza, le valvole cardiache artificiali ottimali create mediante ingegneria tissutale dovrebbero essere simili a quelle native in termini di struttura anatomica e funzione, e possedere anche adattabilità biomeccanica, capacità di riparazione e crescita.

L'ingegneria tissutale sviluppa valvole cardiache artificiali utilizzando diverse fonti di raccolta cellulare. Pertanto, è possibile utilizzare cellule xenogeniche o allogeniche, sebbene le prime siano associate al rischio di trasmissione di zoonosi all'uomo. È possibile ridurre l'antigenicità e prevenire le reazioni di rigetto dell'organismo mediante la modificazione genetica delle cellule allogeniche. L'ingegneria tissutale richiede una fonte affidabile di cellule. Tale fonte è rappresentata dalle cellule autogene prelevate direttamente dal paziente e che non producono reazioni immunitarie durante il reimpianto. Valvole cardiache artificiali efficaci vengono prodotte a partire da cellule autologhe ottenute da vasi sanguigni (arterie e vene). È stato sviluppato un metodo basato sull'utilizzo del sorting cellulare attivato da fluorescenza (FACS) per ottenere colture cellulari pure. Una popolazione cellulare mista ottenuta da un vaso sanguigno viene marcata con un marcatore lipoproteico acetilato a bassa densità, che viene assorbito selettivamente sulla superficie degli endoteliociti. Le cellule endoteliali possono quindi essere facilmente separate dalla massa delle cellule ottenute dai vasi, che sarà una miscela di cellule muscolari lisce, miofibroblasti e fibroblasti. La provenienza delle cellule, arteriosa o venosa, influenzerà le proprietà del costrutto finale. Pertanto, le valvole cardiache artificiali con una matrice seminata con cellule venose sono superiori in termini di formazione di collagene e stabilità meccanica rispetto ai costrutti seminati con cellule arteriose. La scelta delle vene periferiche sembra essere una fonte più conveniente per la raccolta delle cellule.

I miofibroblasti possono essere prelevati anche dalle arterie carotidi. Tuttavia, le cellule derivate dai vasi presentano caratteristiche significativamente diverse dalle cellule interstiziali naturali. Le cellule autologhe del cordone ombelicale possono essere utilizzate come fonte cellulare alternativa.

Valvole cardiache artificiali basate sulle cellule staminali

Negli ultimi anni, il progresso nell'ingegneria tissutale è stato facilitato dalla ricerca sulle cellule staminali. L'utilizzo di cellule staminali del midollo osseo rosso presenta i suoi vantaggi. In particolare, la semplicità della raccolta del biomateriale e della coltivazione in vitro con successiva differenziazione in vari tipi di cellule mesenchimali consente di evitare l'utilizzo di vasi intatti. Le cellule staminali sono fonti pluripotenti di linee cellulari e presentano caratteristiche immunologiche uniche che contribuiscono alla loro stabilità in condizioni allogeniche.

Le cellule staminali umane del midollo osseo rosso si ottengono mediante puntura sternale o puntura della cresta iliaca. Vengono isolate da 10-15 ml di aspirato sternale, separate dalle altre cellule e coltivate. Una volta raggiunto il numero di cellule necessario (solitamente entro 21-28 giorni), vengono seminate (colonizzate) su matrici e coltivate in un terreno nutritivo in posizione statica (per 7 giorni in un incubatore umidificato a 37 °C in presenza del 5% di CO2). Successivamente, la crescita cellulare viene stimolata attraverso il terreno di coltura (stimoli biologici) o creando condizioni fisiologiche per la crescita del tessuto durante la sua deformazione isometrica in un apparato di riproduzione a flusso pulsante - un bioreattore (stimoli meccanici). I fibroblasti sono sensibili agli stimoli meccanici che ne promuovono la crescita e l'attività funzionale. Il flusso pulsante provoca un aumento delle deformazioni sia radiali che circonferenziali, che porta all'orientamento (allungamento) delle cellule popolate nella direzione di tali sollecitazioni. Questo, a sua volta, porta alla formazione di strutture fibrose orientate delle valvole. Un flusso costante causa solo sollecitazioni tangenziali sulle pareti. Il flusso pulsante ha un effetto benefico sulla morfologia cellulare, sulla proliferazione e sulla composizione della matrice extracellulare. Anche la natura del flusso del mezzo nutritivo e le condizioni fisico-chimiche (pH, pO₂ e pCO₂) nel bioreattore influenzano significativamente la produzione di collagene. Pertanto, il flusso laminare e le correnti parassite cicliche aumentano la produzione di collagene, con conseguente miglioramento delle proprietà meccaniche.

Un altro approccio alla crescita di strutture tissutali consiste nel creare condizioni embrionali in un bioreattore, anziché simulare le condizioni fisiologiche del corpo umano. Le biovalvole tissutali coltivate a base di cellule staminali presentano lembi mobili e flessibili, funzionalmente capaci di resistere ad alta pressione e a flussi superiori al livello fisiologico. Studi istologici e istochimici dei lembi di queste strutture hanno mostrato la presenza di processi attivi di biodistruzione della matrice e la sua sostituzione con tessuto vitale. Il tessuto è organizzato secondo la tipologia a strati, con caratteristiche delle proteine della matrice extracellulare simili a quelle del tessuto nativo, presenza di collagene di tipo I e III e glicosaminoglicani. Tuttavia, non è stata ottenuta la tipica struttura a tre strati dei lembi: ventricolare, spugnoso e fibroso. Le cellule ASMA-positive che esprimevano vimentina, presenti in tutti i frammenti, presentavano caratteristiche simili a quelle dei miofibroblasti. La microscopia elettronica ha rivelato elementi cellulari con caratteristiche tipiche dei miofibroblasti vitali, secretori attivi (filamenti di actina/miosina, filamenti di collagene, elastina) e cellule endoteliali sulla superficie del tessuto.

Sui lembi sono stati rilevati collagene di tipo I, III, ASMA e vimentina. Le proprietà meccaniche dei lembi tissutali e delle strutture native erano comparabili. Le valvole cardiache artificiali tissutali hanno mostrato prestazioni eccellenti per 20 settimane e assomigliavano alle strutture anatomiche naturali in termini di microstruttura, profilo biochimico e formazione della matrice proteica.

Tutte le valvole cardiache artificiali ottenute mediante ingegneria tissutale sono state impiantate in animali in posizione polmonare, poiché le loro caratteristiche meccaniche non corrispondono ai carichi in posizione aortica. Le valvole tissutali espiantate dagli animali presentano una struttura simile a quelle native, il che ne indica l'ulteriore sviluppo e ristrutturazione in vivo. Ulteriori studi dimostreranno se il processo di ristrutturazione e maturazione dei tessuti continuerà in condizioni fisiologiche dopo l'impianto delle valvole cardiache artificiali, come osservato negli esperimenti sugli animali.

Le valvole cardiache artificiali ideali dovrebbero avere una porosità di almeno il 90%, essenziale per la crescita cellulare, l'apporto di nutrienti e l'eliminazione dei prodotti metabolici cellulari. Oltre alla biocompatibilità e alla biodegradabilità, le valvole cardiache artificiali dovrebbero avere una superficie chimicamente favorevole alla semina cellulare e corrispondere alle proprietà meccaniche del tessuto naturale. Il livello di biodegradazione della matrice dovrebbe essere controllabile e proporzionale al livello di formazione di nuovo tessuto per garantire la stabilità meccanica nel tempo.

Attualmente, si stanno sviluppando matrici sintetiche e biologiche. I materiali biologici più comuni per la creazione di matrici sono le strutture anatomiche dei donatori, il collagene e la fibrina. Le valvole cardiache artificiali polimeriche sono progettate per biodegradarsi dopo l'impianto, una volta che le cellule impiantate iniziano a produrre e organizzare la propria rete di matrice extracellulare. La formazione di nuovo tessuto di matrice può essere regolata o stimolata da fattori di crescita, citochine o ormoni.

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Valvole cardiache artificiali donate

Le valvole cardiache artificiali ottenute da donatori umani o animali e private degli antigeni cellulari mediante decellularizzazione per ridurne l'immunogenicità possono essere utilizzate come matrici. Le proteine conservate della matrice extracellulare costituiscono la base per la successiva adesione delle cellule seminate. Esistono i seguenti metodi per la rimozione degli elementi cellulari (acellularizzazione): congelamento, trattamento con tripsina/EDTA, detergenti - sodio dodecil solfato, sodio desossicolato, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, nonché metodi di trattamento enzimatico multistadio. In questo caso, le membrane cellulari, gli acidi nucleici, i lipidi, le strutture citoplasmatiche e le molecole solubili della matrice vengono rimosse preservando collagene ed elastina. Tuttavia, non è ancora stato trovato un metodo ideale. Solo il sodio dodecil solfato (0,03-1%) o il sodio desossicolato (0,5-2%) hanno portato alla rimozione completa delle cellule dopo 24 ore di trattamento.

L'esame istologico delle biovalvole decellularizzate rimosse (allotrapianto e xenotrapianto) in un esperimento su animali (cane e maiale) ha mostrato una parziale endotelizzazione e la crescita di miofibroblasti del ricevente nella base, senza segni di calcificazione. È stata osservata una moderata infiltrazione infiammatoria. Tuttavia, si è sviluppato un fallimento precoce durante gli studi clinici sulla valvola SynerGraftTM decellularizzata. È stata rilevata una pronunciata reazione infiammatoria nella matrice della bioprotesi, inizialmente aspecifica e accompagnata da una reazione linfocitaria. Nel corso di un anno si sono sviluppate disfunzioni e degenerazioni della bioprotesi. Non è stata osservata alcuna colonizzazione cellulare della matrice, ma sono stati rilevati calcificazione delle valvole e residui cellulari preimpianto.

Le matrici acellulari seminate con cellule endoteliali e coltivate in vitro e in vivo hanno formato uno strato coerente sulla superficie delle valvole, e le cellule interstiziali seminate di struttura nativa hanno dimostrato la loro capacità di differenziarsi. Tuttavia, non è stato possibile raggiungere il livello fisiologico richiesto di colonizzazione cellulare sulla matrice in condizioni dinamiche del bioreattore, e le valvole cardiache artificiali impiantate sono state accompagnate da un ispessimento piuttosto rapido (tre mesi) dovuto all'accelerazione della proliferazione cellulare e alla formazione di una matrice extracellulare. Pertanto, allo stato attuale, l'utilizzo di matrici acellulari di donatori per la loro colonizzazione con cellule presenta una serie di problemi irrisolti, tra cui quelli immunologici e infettivi; il lavoro sulle bioprotesi decellularizzate continua.

È importante notare che il collagene è anche uno dei potenziali materiali biologici per la produzione di matrici biodegradabili. Può essere utilizzato sotto forma di schiuma, gel o piastre, spugne e come materiale grezzo a base di fibre. Tuttavia, l'uso del collagene è associato a una serie di difficoltà tecnologiche. In particolare, è difficile ottenerlo direttamente dal paziente. Pertanto, attualmente, la maggior parte delle matrici di collagene è di origine animale. La lenta biodegradazione del collagene animale può comportare un aumento del rischio di infezioni zoonotiche e causare reazioni immunologiche e infiammatorie.

La fibrina è un altro materiale biologico con caratteristiche di biodegradazione controllata. Poiché i gel di fibrina possono essere prodotti dal sangue del paziente per la successiva produzione di una matrice autologa, l'impianto di tale struttura non ne causerà la degradazione tossica e la reazione infiammatoria. Tuttavia, la fibrina presenta svantaggi come la diffusione e la lisciviazione nell'ambiente e scarse proprietà meccaniche.

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Valvole cardiache artificiali realizzate in materiali sintetici

Anche le valvole cardiache artificiali sono realizzate in materiali sintetici. Diversi tentativi di produrre matrici valvolari si sono basati sull'uso di poliglactina, acido poliglicolico (PGA), acido polilattico (PLA), copolimero di PGA e PLA (PLGA) e poliidrossialcanoati (PHA). Un materiale sintetico altamente poroso può essere ottenuto da fibre intrecciate o non intrecciate utilizzando la tecnologia di lisciviazione salina. Un promettente materiale composito (PGA/P4HB) per la produzione di matrici si ottiene da anse non intrecciate di acido poliglicolico (PGA) rivestite con poli-4-idrossibutirrato (P4HB). Le valvole cardiache artificiali prodotte con questo materiale vengono sterilizzate con ossido di etilene. Tuttavia, la notevole rigidità e spessore iniziale delle anse di questi polimeri, la loro rapida e incontrollata degradazione, accompagnata dal rilascio di prodotti citotossici acidi, richiedono ulteriori ricerche e la ricerca di altri materiali.

L'utilizzo di piastre di coltura tissutale di miofibroblasti autologhi, coltivate su uno scaffold per formare matrici di supporto stimolando la produzione di queste cellule, ha permesso di ottenere campioni di valvola con cellule vitali attive circondate da una matrice extracellulare. Tuttavia, le proprietà meccaniche dei tessuti di queste valvole sono ancora insufficienti per il loro impianto.

Il livello richiesto di proliferazione e rigenerazione tissutale della valvola in fase di creazione potrebbe non essere raggiunto combinando solo cellule e matrice. L'espressione genica cellulare e la formazione tissutale possono essere regolate o stimolate aggiungendo fattori di crescita, citochine o ormoni, fattori mitogenici o fattori di adesione a matrici e scaffold. La possibilità di introdurre questi regolatori nei biomateriali della matrice è in fase di studio. Nel complesso, vi è una significativa carenza di ricerca sulla regolazione della formazione tissutale delle valvole mediante stimoli biochimici.

La bioprotesi polmonare xenogenica suina acellulare Matrix P è costituita da tessuto decellularizzato processato secondo una speciale procedura brevettata da AutoTissue GmbH, che include il trattamento con antibiotici, desossicolato di sodio e alcol. Questo metodo di lavorazione, approvato dall'Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione (IOM), elimina tutte le cellule viventi e le strutture post-cellulari (fibroblasti, cellule endoteliali, batteri, virus, funghi, micoplasmi), preserva l'architettura della matrice extracellulare e riduce al minimo il livello di DNA e RNA nei tessuti, azzerando così la probabilità di trasmissione del retrovirus endogeno suino (PERV) all'uomo. La bioprotesi Matrix P è costituita esclusivamente da collagene ed elastina con integrazione strutturale preservata.

Negli esperimenti condotti su pecore, è stata registrata una minima reazione da parte dei tessuti circostanti 11 mesi dopo l'impianto della bioprotesi Matrix P, con buoni tassi di sopravvivenza, particolarmente evidenti nella superficie interna lucida dell'endocardio. Reazioni infiammatorie, ispessimento e accorciamento dei lembi valvolari erano praticamente assenti. Sono stati inoltre registrati bassi livelli di calcio tissutale nella bioprotesi Matrix P, con una differenza statisticamente significativa rispetto ai pazienti trattati con glutaraldeide.

La valvola cardiaca artificiale Matrix P si adatta alle condizioni individuali del paziente entro pochi mesi dal suo impianto. L'esame al termine del periodo di controllo ha rivelato una matrice extracellulare intatta e un endotelio confluente. Lo xenotrapianto Matrix R impiantato in 50 pazienti con difetti congeniti durante la procedura di Ross tra il 2002 e il 2004 ha dimostrato prestazioni superiori e gradienti di pressione transvalvolare inferiori rispetto agli alloinnesti SynerGraftMT crioconservati e decellularizzati e alle bioprotesi senza scaffold trattate con glutaraldeide. Le valvole cardiache artificiali Matrix P sono destinate alla sostituzione della valvola polmonare durante la ricostruzione del tratto di efflusso del ventricolo destro in chirurgia per difetti congeniti e acquisiti e durante la sostituzione della valvola polmonare durante la procedura di Ross. Sono disponibili in 4 misure (in base al diametro interno): per neonati (15-17 mm), per bambini (18-21 mm), intermedi (22-24 mm) e adulti (25-28 mm).

I progressi nello sviluppo di valvole tissutali ingegnerizzate dipenderanno dai progressi nella biologia delle cellule valvolari (inclusi gli aspetti relativi all'espressione e alla regolazione genica), dagli studi sullo sviluppo embriogenico e legato all'età delle valvole (inclusi i fattori angiogenici e neurogenici), dalla conoscenza precisa della biomeccanica di ciascuna valvola, dall'identificazione delle cellule idonee per la semina e dallo sviluppo di matrici ottimali. L'ulteriore sviluppo di valvole tissutali più avanzate richiederà una comprensione approfondita della relazione tra le caratteristiche meccaniche e strutturali delle valvole native e gli stimoli (biologici e meccanici) per ricreare tali caratteristiche in vitro.

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