Virus dell'epatite A

L'epatite virale A è una malattia infettiva umana, caratterizzata principalmente da danno epatico e clinicamente manifestata da intossicazione e ittero. Il virus dell'epatite A è stato scoperto nel 1973 da S. Feinstone (et al.) utilizzando il metodo della microscopia elettronica immunitaria e infettando scimmie (scimpanzé e marmoset). L'essenza del metodo della microscopia elettronica immunitaria consiste nell'aggiunta di anticorpi specifici (siero convalescente) al filtrato delle feci di un paziente affetto da epatite A e il sedimento viene sottoposto a microscopia elettronica. A causa dell'interazione dei virus con anticorpi specifici, questi subiscono un'aggregazione specifica. In questo caso, sono più facili da rilevare e l'aggregazione sotto l'influenza degli anticorpi conferma la specificità del patogeno. La scoperta di S. Feinstone è stata confermata da esperimenti su volontari.

Il virus dell'epatite A è sferico, il diametro del virione è di 27 nm. Il genoma è rappresentato da RNA positivo a singolo filamento con 2,6 mm di diametro medio. Non è presente supercapside. La simmetria è cubica - icosaedrica. Il capside ha 32 capsomeri ed è formato da quattro polipeptidi (VP1-VP4). In base alle sue proprietà, il virus dell'epatite A appartiene al genere Heparnovirus, famiglia Picornaviridae. In termini di antigeni, il virus dell'epatite A (HAV - virus dell'epatite A) è omogeneo. L'HAV si riproduce bene nell'organismo di scimpanzé, babbuini, babbuini amadriade e scimmie marmoset. Per lungo tempo, il virus non è stato coltivabile. Solo negli anni '80 è stato possibile ottenere colture cellulari in cui l'HAV si riproduce. Inizialmente, per questi scopi venivano utilizzate linee cellulari continue di embrioni renali di macaco rhesus (coltura FRhK-4); ora viene utilizzata una linea cellulare continua di cellule renali di cercopiteco verde (coltura 4647).

Secondo le raccomandazioni degli esperti dell'OMS, è stata adottata la seguente nomenclatura dei marcatori del virus dell'epatite A: virus dell'epatite A - anticorpi HAV contro il virus dell'epatite A: IgM anti-HAV e IgG anti-HAV.

L'HAV è una piccola particella con un diametro di 27-30 nm, dotata di simmetria icosaedrica e omogeneità. L'elettronogramma ottenuto con il metodo dell'aggregazione immunitaria rivela particelle elettron-dense con capsomeri superficialmente disposti simmetricamente. Con contrasto negativo, nei preparati vengono rivelate sia particelle piene che vuote. Il nucleocapside dell'HAV, a differenza di quello dell'influenza, non presenta protrusioni superficiali né membrana. È inoltre importante che il virione dell'HAV non abbia una struttura a forma di cuore.

In base alle sue proprietà fisico-chimiche, il virus dell'epatite A è classificato come appartenente alla famiglia dei picornavirus, genere enterovirus con numero di serie 72. Tuttavia, questa tassonomia si è rivelata troppo insolita e l'OMS ha ritenuto possibile mantenere la terminologia "virus dell'epatite A".

Come tutti i virus della famiglia dei Picornaviridae, il virus dell'epatite A contiene acido ribonucleico. Alcuni laboratori hanno dimostrato la possibilità di clonare il genoma del virus dell'epatite A, aprendo la possibilità di ottenere vaccini.

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Resistenza al virus dell'epatite A

Il virus è relativamente resistente alle alte temperature, agli acidi, ai solventi grassi (senza lipidi), ai disinfettanti e tollera bene le basse temperature. Tutto ciò contribuisce alla sua conservazione a lungo termine nell'ambiente esterno. A temperatura ambiente sopravvive per diverse settimane, a 60 °C perde parzialmente la sua infettività dopo 4-12 ore e completamente dopo pochi minuti a 85 °C. È altamente resistente al cloro, grazie al quale è in grado di penetrare nell'acqua del rubinetto attraverso le barriere degli impianti di trattamento delle acque.

Riassumendo tutti i dati, possiamo caratterizzare il virus dell'epatite A come segue:

• l'ospite naturale è l'uomo;
• animali da esperimento: uistitì, scimpanzé;
• la fonte dell'infezione sono le feci;
• la malattia è epidemica ed endemica;
• via di trasmissione: oro-fecale;
• periodo di incubazione - 14-40 giorni;
• transizione verso l'epatite cronica - non osservata.

Le proprietà immunologiche dell'HAV sono le seguenti:

• Ceppi prototipici: Ms-1, CR-326, GВG. Tutti immunologicamente simili o identici;
• Anticorpi - IgM e IgG, vengono prodotti in risposta all'introduzione di proteine strutturali del virus e hanno una funzione protettiva;
• I. L'effetto protettivo della gammaglobulina sierica umana - previene o attenua la malattia se somministrata prima dell'infezione o durante il periodo di incubazione.

Le caratteristiche fisico-chimiche della NAU sono le seguenti:

• Morfologia: particella sferica senza guscio con simmetria cubica, il capside è costituito da 32 capsomeri;
• Diametro - 27-30 nm;
• Densità in CsCl (g/cm3) - 1,38-1,46 (particelle aperte), 1,33-1,34 (virione maturo), 1,29-1,31 (virion immaturi, particelle vuote);
• Coefficiente di sedimentazione - 156-160 virioni maturi;
• L'acido nucleico è un RNA lineare a filamento singolo;
• Peso molecolare relativo - 2,25 106-2,8 106KD;
• Il numero di nucleotidi è 6.500-8.100.

La stabilità dell'HAV sotto l'influenza fisica e chimica è la seguente:

• Cloroformio, etere - stabile;
• Cloro, 0,5-1,5 mg/l, 5 °C, 15 min - inattivazione parziale;
• Cloramina, 1 g/l, 20 °C, 15 min - inattivazione completa;
• Formalina, 1:4000, 35-37 °C, 72 h - inattivazione completa, 1:350, 20 °C, 60 min - inattivazione parziale.

Temperatura:

• 20-70 °C - stabile;
• 56 °C, 30 min - stabile;
• 60 °C, 12 h - inattivazione parziale;
• 85 °C, 1 min - inattivazione completa;
• Autoclavaggio, 120 °C. 20 min - inattivazione completa;
• Calore secco, 180 °C, 1 ora - inattivazione completa;
• UFO, 1,1 W, 1 min - inattivazione completa.

I dati presentati mostrano che, per quanto riguarda le sue proprietà fisico-chimiche, il virus dell'epatite A è il più vicino agli enterovirus. Come altri enterovirus, l'HAV è resistente a molte soluzioni disinfettanti e viene completamente inattivato in pochi minuti a 85 °C e in autoclave.

È stato dimostrato che il virus dell'epatite A può riprodursi in linee monostrato primarie e continue di colture cellulari umane e di scimmia. Una riproduzione particolarmente attiva del virus dell'epatite A in colture in vitro si osserva quando si utilizzano estratti di fegato di scimmie malate come materiale di partenza. Va tuttavia notato che in tutti gli esperimenti sulla riproduzione del virus dell'epatite A in colture in vitro, l'attenzione è rivolta al lungo periodo di incubazione durante i passaggi primari (fino a 4-10 settimane); successivamente, l'accumulo di materiale genetico virale aumenta, ma i valori assoluti rimangono molto insignificanti, il che induce molti ricercatori a parlare di replicazione incompleta del virus dell'epatite A in colture tissutali.

Riassumendo i dati della letteratura sulla riproduzione del virus dell'epatite A in colture extra-tissutali, si può affermare che la sopravvivenza a lungo termine dell'HAV in vitro è indubitabile. Le condizioni ottimali per un livello elevato e stabile di replicazione virale non sono state ancora identificate definitivamente, e questo ostacola lo studio delle sue proprietà biologiche, l'ottenimento di una fonte di reagenti per la produzione di test diagnostici e la progettazione di vaccini.

Allo stesso tempo, in letteratura si possono trovare giudizi più ottimistici su questo problema. La soluzione di tutte le problematiche relative alla coltivazione del virus dell'epatite A è una questione di prossimo futuro. Studiando le condizioni ottimali per la riproduzione dell'HAV nella coltura di cellule renali embrionali di macaco rhesus, sono state identificate due fasi: la fase di produzione del virus infettivo (fino a 6-8 giorni al quinto passaggio) e la fase di accumulo intensivo dell'antigene virale. È stato inoltre dimostrato che l'accumulo più significativo dell'antigene virale si verifica nelle condizioni della cosiddetta coltivazione a rulli (beute rotanti). Questo metodo apre ampie opportunità per ottenere grandi quantità di antigene colturale e, di conseguenza, la materia prima per la preparazione di sistemi diagnostici e la produzione di vaccini.

Epidemiologia dell'epatite A

Il virus dell'epatite A è altamente patogeno per l'uomo. Secondo l'OMS (1987), l'infezione con un solo virione è sufficiente a causare la malattia. Tuttavia, la dose infettante pratica è probabilmente molto più elevata. L'unica fonte di infezione è una persona infetta. Il virus viene escreto in grandi quantità con le feci 12-14 giorni prima della comparsa dell'ittero e durante le 3 settimane del periodo itterico. Non sono state riscontrate differenze significative nell'escrezione del patogeno nei pazienti con forme itteriche, anitteriche e asintomatiche di epatite A. La via di infezione è oro-fecale, principalmente tramite acqua, nonché per via domestica e alimentare. La principale (primaria) via di trasmissione del virus è l'acqua. È possibile anche l'infezione tramite goccioline trasportate dall'aria. La suscettibilità della popolazione è universale. Sono colpiti principalmente i bambini di età inferiore ai 14 anni. La malattia ha una spiccata stagionalità autunno-inverno.

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Sintomi dell'epatite A

Il periodo di incubazione varia da 15 a 50 giorni, a seconda della dose infettante del virus, ma in media è di 28-30 giorni. Una volta nell'organismo, il virus dell'epatite A si moltiplica nei linfonodi regionali, penetra nel sangue e quindi nelle cellule epatiche, causando un'epatite diffusa acuta, accompagnata da danni agli epatociti e agli elementi reticoloendoteliali del fegato e da una riduzione delle sue funzioni di detossificazione e barriera. Il danno agli epatociti non si verifica a causa dell'azione diretta del virus, ma a causa di meccanismi immunopatologici. Il quadro più tipico dell'epatite A è una forma ciclica itterica acuta: periodo di incubazione, fase prodromica (pre-itterica), fase itterica e convalescenza. Tuttavia, nei focolai di infezione, viene rilevato un gran numero di pazienti con forme di infezione anitteriche e asintomatiche, la cui predominanza numerica è significativa rispetto a quella itterica ("fenomeno dell'iceberg").

L'immunità post-infezione è forte e duratura, causata dagli anticorpi neutralizzanti il virus e dalle cellule della memoria immunitaria.

Diagnostica microbiologica dell'epatite A

La diagnosi dell'epatite A (ad eccezione delle infezioni negli animali - scimpanzé, uistitì, babbuini, che non abbiamo) si basa su vari metodi immunologici: RSC, metodo di immunofluorescenza, emoagglutinazione dell'adesione immunitaria (il complesso antigene virale + anticorpo in presenza di complemento viene adsorbito sugli eritrociti e ne causa l'adesione). Tuttavia, le possibilità di utilizzo di questi metodi sono limitate a causa della mancanza di antigeni virali specifici e la reazione di immunofluorescenza richiede una biopsia epatica, il che è indesiderabile. Il metodo di immunomicroscopia elettronica è affidabile e specifico, ma richiede molto lavoro. Pertanto, finora l'unica reazione immunologica accettabile è il metodo di analisi immunosorbente della fase solida sotto forma di IFM o RIM, in particolare nella modifica della "cattura" delle immunoglobuline di classe M. Nel nostro Paese è stato proposto un sistema di test per questo scopo: "DIAGN-A-HEP". Il principio di funzionamento di questo sistema di test è il seguente. In primo luogo, gli anticorpi contro le immunoglobuline di classe M (anti-immunoglobuline M) vengono adsorbiti sulle pareti dei pozzetti di polistirolo, quindi viene aggiunto il siero del paziente da testare. Se contiene anticorpi IgM, questi si legheranno agli anticorpi anti-anticorpi di classe M, quindi viene aggiunto un antigene virale specifico (virus dell'epatite A), ottenuto tramite coltura cellulare. Il sistema viene lavato e gli vengono aggiunti anticorpi antivirali marcati con perossidasi di rafano. Se tutti e quattro i componenti del sistema interagiscono, si forma un "sandwich" a quattro strati:

• antiimmunoglobuline M,
• immunoglobuline M (contro il virus dell'epatite A - nel siero del paziente in studio),
• antigene virale,
• anticorpi antivirali marcati con enzimi.

Per rilevare questo complesso, un substrato per l'enzima viene aggiunto ai pozzetti. Sotto l'azione dell'enzima, il complesso viene distrutto e si forma un prodotto colorato. L'intensità del colore può essere misurata quantitativamente utilizzando uno spettrofotometro o un fotocolorimetro.

Il vantaggio del metodo di "cattura" delle IgM è che gli anticorpi di questa classe di immunoglobuline compaiono durante la risposta immunitaria primaria e indicano la fase attiva dell'infezione, per poi scomparire dopo la malattia. Gli anticorpi antivirali appartenenti alla classe IgG, al contrario, persistono a lungo dopo la malattia, conferendo immunità acquisita. È stato proposto un metodo basato su sonda a DNA per rilevare il virus dell'epatite A: il DNA complementare a vRNA viene utilizzato come sonda.

Trattamento dell'epatite A

Poiché nell'epatite virale la produzione di interferone è interrotta, il trattamento dell'epatite A si basa sull'uso dell'interferone e dell'induttore della sua sintesi endogena, l'amisina.

Prevenzione specifica dell'epatite A

La sieroprofilassi dell'epatite A con gammaglobuline, ampiamente utilizzata in precedenza, non era giustificata, pertanto l'enfasi principale è stata posta sulla profilassi vaccinale, con la vaccinazione contro l'epatite A. A tal fine, sono in fase di sviluppo e sono già in uso diversi tipi di vaccini. In Russia, un vaccino efficace contro l'epatite A è stato ottenuto già nel 1995 e ora viene utilizzato con successo.