Ricerca immunologica in urologia

L'assegnazione di un immunogramma a un paziente urologico significa che il medico curante assume la presenza di disturbi nel sistema immunitario. Duplicare, virali, infezioni fungine batteriche, reazioni allergiche, malattie sistemiche possono essere sintomi di questi disturbi, che sono caratterizzati da un certo numero di sindromi (infezione, cancro, allergie, autoimmune, linfoproliferativa). Un paziente può avere diverse sindromi. Ad esempio, le malattie infettive croniche (sindrome infettiva) possono causare deficit immunitario e immunodeficienza possono essere manifestato predisposizione alle malattie infettive e il cancro (Sindrome Cancro). La predisposizione alle infezioni può verificarsi in un contesto di immunodeficienza secondaria, che si è sviluppata a seguito di una malattia linfoproliferativa, ad esempio la leucemia. Ci sono tre gruppi principali di cambiamenti patologici nel sistema immunitario:

• l'insufficienza quantitativa o funzionale dell'uno o dell'altro legame di immunità, che porta allo sviluppo di uno stato di immunodeficienza;
• una violazione nel riconoscimento dell'antigene da parte del sistema immunitario, che porta allo sviluppo di processi autoimmuni;
• risposta immunitaria iperreattiva o "pervertita", manifestata dallo sviluppo di malattie allergiche.

Sono disponibili metodi di screening (test di livello 1) e di qualifica (test dei 2 livelli) di immunodiagnosi. I primi esistono per correggere le violazioni nel sistema immunitario, il secondo - per stabilire i meccanismi coinvolti nella loro attuazione allo scopo di un'ulteriore immunocorrection.

B-collegamento cellulare di immunità

Metodi di screening

• Determinazione del numero relativo e assoluto di linfociti B mediante immunofluorescenza o citometria a flusso utilizzando anticorpi monoclonali per antigeni delle cellule B (CD19, CD20, in cui CD - cluster di differenziazione). Il contenuto di linfociti B è normale negli adulti: 8-19% del numero totale di leucociti o 190-380 cellule / μl. Aumentando il contenuto di linfociti B avviene nelle infezioni batteriche e fungine acute e croniche, malattia epatica cronica, malattie del tessuto connettivo sistemici, leucemia linfocitica cronica, mieloma multiplo.
• Determinazione della concentrazione di immunoglobuline nespespetsificheskih (F, M, G, E) per singola immunodiffusione radiale, o nefelometria turbometrii, radioimmunologico o immunoenzimatico (EIA). Norme per adulti: immunoglobulina (Ig) A 0.9-4.5 g / l. IgM 03-3,7 g / l. IgG 8,0-17 g / l. Un aumento della concentrazione di immunoglobuline si verifica con le stesse condizioni patologiche in cui si verifica un aumento del contenuto di linfociti B. Ridurre la concentrazione di immunoglobuline è in ipogammaglobulinemia congenita, tumori del sistema immunitario, la rimozione della milza, perdita di proteine, nelle malattie dei reni o intestino, trattamento con citostatici e immunodepreesantami.

Specifica dei metodi

• Determinazione dei complessi immunitari circolanti nel sangue mediante precipitazione selettiva in glicole di polisilene seguita da test di densità spettrofotometrica (normale 80-20 UE). L'aumento di complessi immunitari circolanti è caratteristico per infezioni batteriche acute, fungine, virali, autoimmuni, malattie immunocomplessi, malattia da siero, reazioni allergiche di tipo 3;
• Determinazione di immunoglobuline specifiche nel sangue rispetto ad antigeni batterici e virali, acido desossiribonucleico (DNA) in malattie autoimmuni, l'identificazione degli spermatozoi (infertilità autoimmune) e anticorpi protivopochechnyh (pielonefrite e glomerulonefrite) mediante immunodiffusione radiale o ELISA.
• Determinazione degli anticorpi antispermatozoi nello spermatozoo [test MAR (reazione antiglobulina mista)], la norma è negativa.
• Determinazione della concentrazione di immunoglobuline nelle urine ai fini della diagnosi differenziale tra pielonefrite e glomerulonefrite (selettività della proteinuria).
• Determinazione delle IgE nel succo di prostata per la diagnosi di prostatite allergica mediante immunodiffusione radiale o ELISA. 
• La ricerca in risposta reazione blasttransformation dei linfociti B in un mitogeno delle cellule B (pokeweed mitogeno per la stimolazione di reazione blasttransformation di B-linfociti in presenza di linfociti T), in cui il valore standard del 95-100%.

Collegamento a cellule T dell'immunità

Metodi di screening

• Determinazione del numero relativo e assoluto di maturo CD3 T reazione dei linfociti mediante immunofluorescenza o portata citofluorimetria utilizzando anticorpi anti-SDZ anticorpi monoclonali. La norma per gli adulti è del 58-76% o 1100-1700 cellule / μl. La diminuzione del numero di linfociti T è un indicatore dell'insufficienza del legame cellulare di immunità. Questa caratteristica è di diversi immunodeficienze primarie e secondarie (infezioni batteriche e virali croniche: tubercolosi, acquisita sindrome da immunodeficienza, cancro, insufficienza renale cronica, traumi, stress, invecchiamento, malnutrizione, il trattamento con farmaci citotossici, radiazioni ionizzanti). Un aumento del numero di linfociti T si verifica in un contesto di iperattività dell'immunità o nelle malattie linfoproliferative. Con l'infiammazione, il numero di linfociti T prima aumenta e poi diminuisce. L'assenza di una diminuzione dei linfociti T suggerisce la cronicizzazione del processo infiammatorio.
• Valutazione delle sottopopolazioni di linfociti.
  • Determinazione del numero di T-helper (anticorpi anti-CD4). Normalmente, 36-55% o 400-1100 cellule / μl. Un aumento del numero di queste cellule si verifica nelle malattie autoimmuni, nella malattia di Waldenstrom, nell'attivazione dell'impianto antigraft; riduzione del numero di cellule T-helper avviene in, virali, infezioni croniche batteriche protozoi, tubercolosi, sindrome da immunodeficienza acquisita, neoplasie, ustioni, traumi, malnutrizione, invecchiamento, trattamenti citostatici, radiazioni ionizzanti.
  • Determinazione del numero di soppressori di T (anticorpi anti-CD4). Normalmente, 17-37% o 300-700 cellule / μl. Un aumento del numero di soppressori di T avviene con le stesse condizioni in cui il numero di aiutanti T diminuisce e la loro diminuzione alle stesse condizioni, quando il contenuto di T-helper aumenta.
  • Indice Immunoregolatore CD4 / CD8, nella norma 1,5-2,5. Iperattività a velocità superiori a 2,5 (malattie allergiche e autoimmuni); ipoattività - meno di 1,0 (predisposizione alle infezioni croniche). All'inizio del processo infiammatorio, l'indice immunoregolatore aumenta e quando si abbassa, si normalizza.

Specifica dei metodi

• Determinazione del numero di killer naturali (cellule NK) - anticorpi anti-CD16 e anti-CD56. La norma per i linfociti CD 16 è del 6-26%, CD56 - 9-19%. Aumentando il numero di cellule NK si verifica nel rigetto del trapianto, diminuire - nelle infezioni virali, cancro, immunodeficienze primarie e secondarie, ustioni, traumi e stress, trattamento con citostatici e radiazioni ionizzanti. 
• Determinazione del numero di linfociti T con il recettore per l'interleuchina-2 (marker di attivazione) - anticorpi anti-CD25. La norma è del 10-15%. Un aumento del loro numero è osservato nelle malattie allergiche, nel rigetto del trapianto, nella risposta agli antigeni timo-dipendenti nel periodo acuto dell'infezione primaria, diminuzione nelle stesse malattie in cui il numero di cellule NK diminuisce.
• Esame dell'espressione del marcatore di attivazione - la molecola di istocompatibilità della classe II HLA-DR. L'espressione aumentata si verifica nei processi infiammatori, nei pazienti con epatite C, celiachia, sifilide, infezioni respiratorie acute.
• Valutazione dell'apoptosi dei linfociti. Un'indicazione della prontezza di apoptosi dei linfociti possono essere identificati dalla loro espressione di superficie Fas-recettore (CD95) nei mitocondri e bd-2 protooncogene. L'apoptosi è stata valutata mediante lavorazione linfociti due coloranti fluorescenti: ioduro di propidio, che si lega ai frammenti di DNA e annessina Y, legame a fosfatidilserina sulla membrana cellulare appare in apoptosi precoce. La valutazione dei risultati viene effettuata su un citofluorimetro a flusso. Il calcolo dei risultati si basa sul rapporto delle cellule colorate con vari coloranti. Le cellule non colorate sono cellule vitali, associate solo con l'annessina Y, - i primi segni di apoptosi, con ioduro di propidio e annessina I - manifestazioni tardive di apoptosi, colorazione solo ioduro di propidio indica necrosi.
• Valutazione della proliferazione dei linfociti T in vitro.
  • Il cambiamento nella blastogenesi cellulare è una reazione della trasformazione dell'esplosione dei linfociti. I leucociti sono incubati con qualsiasi mitogeno di origine vegetale (lectine). Fitoagglutinina più comunemente usata per 72 ore, quindi fare uno striscio, macchiarlo e contare il numero di esplosioni! L'indice di stimolazione è il rapporto tra la percentuale di cellule trasformate nell'esperimento (coltura con fitoemagglutinina) e la percentuale di cellule trasformate nel controllo (coltura senza fitoemagglutinina). La reazione della trasformazione di esplosione dei linfociti può essere valutata mediante l'inclusione di un'etichetta radioattiva (ZN-timina) in cellule in coltura, poiché la sintesi del DNA aumenta quando si dividono le cellule. Disturbi nella risposta proliferativa si verificano sia nelle immunodeficienze primarie che secondarie associate a infezioni, malattie oncologiche, insufficienza renale e interventi chirurgici.
  • Valutazione di questi studi, l'espressione di marcatori di attivazione (CD25, il recettore della transferrina a - CD71) molecole e MHC classe II HLA-DR, che sono sostanzialmente assenti su linfociti T riposo. I linfociti T stimolate con fitoemoagglutinina dopo 3 giorni marcatori di attivazione di espressione sono stati analizzati mediante immunofluorescenza diretta o indiretta, citometria a flusso utilizzando anticorpi monoclonali secreti recettori.
  • Misurazione del numero di mediatori sintetizzati dai linfociti T attivati [interleuchina (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, interferone-γ, ecc.], Mediante dosaggio radioimmunologico o ELISA. Particolarmente importante è la valutazione della concentrazione di y-interferone e IL-4 come marker di TH e Th2 nel supernatante di colture attivate e all'interno della cellula. Se possibile, è utile determinare l'espressione del gene per la citochina corrispondente dal livello dell'acido ribonucleico della matrice nella cellula producente e l'intensità di espressione dei recettori per le citochine corrispondenti.
    
• La reazione di inibizione della migrazione dei linfociti. Linfociti T sensibilizzati nella reazione con le linfochine rilasciano l'antigene, compresi i fattori. Inibendo la migrazione dei linfociti. Il fenomeno dell'inibizione si osserva quando i mitogeni vengono introdotti nella coltura delle cellule. La valutazione del grado di inibizione consente di giudicare la capacità dei linfociti di rilasciare citochine. Normalmente, la frequenza di migrazione, a seconda del mitogeno specifico, è del 20-80%.
• Valutazione della citotossicità delle cellule NK. Determinare la capacità delle cellule killer naturali di uccidere le cellule bersaglio della linea eritromiloidale K-562. Se viene valutata la citotossicità anticorpo-dipendente, vengono utilizzate cellule target rivestite con anticorpi IgG. Le cellule bersaglio sono etichettate con urina 3H e incubate con cellule effettrici. La morte delle cellule bersaglio è stimata dal rilascio dell'etichetta radioattiva nella soluzione. La riduzione della citotossicità si verifica con neoplasie maligne. In alcuni casi, quando è richiesta una prognosi dell'efficacia del trattamento con interleuchine, la citotossicità delle cellule NK viene valutata durante l'incubazione con determinate citochine.

Indagine sulla funzione dei fagociti

Metodi di screening

Studio dell'assorbimento delle cellule microbiche da parte dei fagociti (fagocitosi delle particelle di lattice, coltura sperimentale di stafilococco, Escherichia coli o microrganismi isolati dal paziente). Mediante centrifugazione del sangue eparinizzato, una sospensione di leucociti è isolata, si aggiunge il siero del gruppo sanguigno IV per la opsonizzazione (opsonine sono proteine che migliorano la fagocitosi). La sospensione microbica viene diluita, miscelata con leucociti e incubata per 120 minuti, per l'analisi dopo 30. 90 minuti dopo l'inizio dell'incubazione. Delle sospensioni leucocitarie selezionate fanno sbavature. Determina i seguenti indicatori di fagocitosi:

• indice fagocitico - la percentuale di cellule che sono entrate nella fagocitosi in 30 minuti e 120 minuti di incubazione; valore normativo dell'indice fagocitico (30) 94% dell'indice fagocitico (120) - 92%;
• numero fagocitico - il numero medio di batteri che sono intracellulari; il valore normativo del numero fagocitico (30) 11%, numero fagocitico (120) - 9,8%;  
• coefficiente di numero fagocitico - rapporto tra numero fagocitico (30) e numero fagocitico (120); normale 1,16;
• l'indice battericida dei neutrofili è il rapporto tra il numero di microbi uccisi all'interno dei fagociti e il numero totale di microbi assorbiti; nella norma del 66%.

Specifica dei metodi

• La ricerca sull'attività battericida dei fagociti nel test con nitrosina tetrazolio (NST) è il test NST. Ai leucociti, il colorante ossido nitroso tetrazolio viene aggiunto in giallo. Quando il colorante viene assorbito dai neutrofili, il processo di riduzione avviene sotto l'azione dei radicali liberi dell'ossigeno, risultando in una colorazione blu. La reazione viene condotta in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. Nei primi tre pozzetti con una miscela di HCT e leucociti viene aggiunta la soluzione di Hanks (HCT spontanea), nell'ultima - particelle di lattice; incubare a 37 ° C per 25 minuti. I risultati sono letti a 540 nm sul lettore ed espressi in unità convenzionali. Calcolare il fattore di stimolazione (K _st ), uguale al rapporto tra la densità ottica nei pozzetti stimolati e la densità ottica media dei pozzetti senza stimolazione. Nelle persone sane, _{HCT spont} = 90 ± 45 UE, NST _Stim = 140 ± 60 UE. K _st = 1,78 ± 0,36.
• Indagine sulle molecole di adesione. Con l'aiuto della citofluorimetria a flusso, viene determinata l'espressione degli antigeni di superficie CD11a / CD18, CD11b / CD18, CD11c / CD18. Le immunodeficienze con violazione dell'adesione si manifestano con infezioni recidivanti, lenta guarigione delle ferite e assenza di pus nei focolai di infezione.

Indagine sul sistema del complemento

Metodi di screening

Determinazione dell'attività emolitica del complemento - uno studio della via classica dell'attivazione del complemento. Diverse diluizioni del siero del paziente e una persona sana vengono aggiunte agli eritrociti di un ariete coperto di anticorpi. Un'unità di attività emolitica è considerata l'inverso della diluizione del siero, in cui il 50% degli eritrociti viene distrutto. Il grado di emolisi viene valutato fotometricamente dalla resa di emoglobina nella soluzione. La riduzione dell'attività emolitica del complemento è osservata nel lupus eritematoso sistemico con interessamento renale, glomerulonefrite acuta. Immunodeficienze combinate, miastenia grave, epatite virale, linfomi, aumento - con ittero ostruttivo, tiroidite di Hashimoto. Reumatismi, artrite reumatoide, periarterite nodulare. Dermatomiosite, infarto miocardico, colite ulcerosa, sindrome di Reiter, gotta.

Specifica dei metodi

• Determinazione dei componenti del complemento. La determinazione quantitativa viene effettuata con il metodo di immunodiffusione radiale e nefelometria.
  Lo studio non è informativo, a meno che le proprietà antigeniche dei componenti del complemento non vengano modificate.
• È stato scoperto che la componente Clq del complemento migliora la fagocitosi e media la citotossicità cellulare. La sua diminuzione si verifica in malattie di complessi immuni, lupus eritematoso sistemico, infezioni purulente e tumori.
• La componente C3 partecipa all'attivazione della via classica e del complemento alternativo. La riduzione della sua concentrazione è associata a infezioni batteriche e fungine croniche, alla presenza di complessi immuni circolanti o tissutali.
• La componente C4 partecipa all'attivazione della via classica. La riduzione della sua concentrazione è associata ad una prolungata attivazione del complemento da parte dei complessi immunitari e ad una diminuzione della concentrazione dell'inibitore C1, che controlla l'attivazione della via classica del complemento. La carenza di C4 si verifica con il lupus eritematoso sistemico, un aumento di C4 si verifica con malattia renale, rigetto del trapianto, infiammazione acuta e malattie del tratto gastrointestinale.
• C5a è un piccolo frammento della molecola C5, separato da esso come risultato dell'attivazione del sistema del complemento. Aumento della sua concentrazione si verifica con l'infiammazione, sepsi, atopica e malattie allergiche.
• L'inibitore del Cl è un fattore multifunzionale. Controlla l'attivazione della componente C1 del complemento, inibisce l'attività della callicreina, della plasmina e del fattore attivato Hageman, delle proteasi di Cls e Or. La carenza di C1-inibitore porta all'angioedema.
• studi complementari. Al siero standard privo di qualsiasi componente del complemento, viene aggiunto il siero del test e viene determinata l'attività emolitica del complemento. Se l'attività emolitica non viene ripristinata alla normalità, si ritiene che l'attività di questo componente del complemento nel siero del test sia ridotta.

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