Studi immunologici in urologia

Prescrivere un immunogramma a un paziente urologico significa che il medico curante sospetta la presenza di disturbi del sistema immunitario. Infezioni batteriche, virali e fungine ricorrenti, manifestazioni allergiche e malattie sistemiche possono essere segni di questi disturbi, caratterizzati da diverse sindromi (infettiva, oncologica, allergica, autoimmune, linfoproliferativa). Un paziente può presentare diverse sindromi. Ad esempio, le malattie infettive croniche (sindrome infettiva) possono causare immunodeficienza, e l'immunodeficienza può manifestarsi come predisposizione a malattie infettive e oncologiche (sindrome oncologica). La predisposizione alle infezioni può verificarsi sullo sfondo di un'immunodeficienza secondaria, sviluppatasi a seguito di una malattia linfoproliferativa, come la leucemia. Esistono tre gruppi principali di alterazioni patologiche del sistema immunitario:

• carenza quantitativa o funzionale di uno o dell'altro anello del sistema immunitario, che porta allo sviluppo di uno stato di immunodeficienza;
• un disturbo nel riconoscimento degli antigeni da parte del sistema immunitario, che porta allo sviluppo di processi autoimmuni;
• una risposta immunitaria iperreattiva o "perversa", che si manifesta con lo sviluppo di malattie allergiche.

Esistono metodi di immunodiagnostica di screening (test di livello 1) e di chiarimento (test di livello 2). I primi servono a registrare le alterazioni del sistema immunitario, i secondi a stabilire i meccanismi coinvolti nella loro attuazione al fine di un'ulteriore immunocorrezione.

Immunità delle cellule B

Metodi di screening

• Determinazione del numero relativo e assoluto di linfociti B mediante immunofluorescenza o citofluorimetria a flusso con anticorpi monoclonali diretti contro gli antigeni delle cellule B (CD19, CD20, dove CD indica i cluster di differenziazione). Il contenuto normale di linfociti B negli adulti è pari all'8-19% del numero totale di leucociti, ovvero 190-380 cellule/μl. Un aumento del contenuto di linfociti B si verifica in caso di infezioni batteriche e fungine acute e croniche, epatopatie croniche, malattie sistemiche del tessuto connettivo, leucemia linfatica cronica e mieloma.
• Determinazione della concentrazione di immunoglobuline aspecifiche (F, M, G, E) mediante immunodiffusione radiale semplice, nefelometria o turbometria, radioimmunoanalisi o immunoenzimatico (ELISA). Valori normali per gli adulti: immunoglobuline (Ig) A 0,9-4,5 g/l. IgM 0,3-3,7 g/l. IgG 8,0-17 g/l. Un aumento della concentrazione di immunoglobuline si verifica nelle stesse condizioni patologiche in cui si verifica un aumento del contenuto di linfociti B. Una diminuzione della concentrazione di immunoglobuline si verifica in caso di ipogammaglobulinemia congenita, neoplasie del sistema immunitario, asportazione della milza, perdita di proteine, malattie renali o intestinali, trattamento con citostatici e immunosoppressori.

Metodi di chiarimento

• Determinazione degli immunocomplessi circolanti nel sangue mediante precipitazione selettiva in polietilenglicole seguita da test di densità spettrofotometrica (normale 80-20 U). Un aumento degli immunocomplessi circolanti è tipico di infezioni batteriche, fungine e virali acute, malattie autoimmuni da immunocomplessi, malattia da siero e reazioni allergiche di tipo 3;
• Determinazione delle immunoglobuline specifiche nel sangue in relazione ad antigeni batterici e virali, acido desossiribonucleico (DNA) nelle malattie autoimmuni, rilevazione di anticorpi antispermatozoi (infertilità autoimmune) e antirenali (pielonefrite e glomerulonefrite) mediante il metodo dell'immunodiffusione radiale o ELISA.
• Determinazione degli anticorpi antispermatozoi nello sperma [test MAR (reazione antiglobulinica mista)], risultato normale - negativo.
• Determinazione della concentrazione delle immunoglobuline nelle urine ai fini della diagnosi differenziale tra pielonefrite e glomerulonefrite (selettività della proteinuria).
• Determinazione del contenuto di IgE nel succo prostatico ai fini della diagnosi di prostatite allergica mediante il metodo dell'immunodiffusione radiale o ELISA.
• Studio della risposta nella reazione di trasformazione blastica dei linfociti B al mitogeno delle cellule B (mitogeno di fitolacca per la stimolazione della reazione di trasformazione blastica dei linfociti B in presenza di linfociti T), il cui valore normativo è del 95-100%.

Collegamento delle cellule T con l'immunità

Metodi di screening

• Determinazione del numero relativo e assoluto di linfociti T CD3 maturi mediante reazione di immunofluorescenza o citofluorimetria a flusso utilizzando anticorpi monoclonali anti-CD3. Il valore normale per gli adulti è del 58-76% o 1100-1700 cellule/μl. Una diminuzione del numero di linfociti T è un indicatore di insufficienza del sistema immunitario cellulare. Questo è tipico di alcune immunodeficienze secondarie e primarie (infezioni batteriche e virali croniche: tubercolosi, sindrome da immunodeficienza acquisita, tumori maligni, insufficienza renale cronica, lesioni, stress, invecchiamento, malnutrizione, trattamento con citostatici, esposizione a radiazioni ionizzanti). Un aumento del numero di linfociti T si verifica in presenza di iperattività immunitaria o di malattie linfoproliferative. In caso di infiammazione, il numero di linfociti T prima aumenta e poi diminuisce. L'assenza di una diminuzione dei linfociti T indica un processo infiammatorio cronico.
• Valutazione delle sottopopolazioni linfocitarie.
  • Determinazione del numero di cellule T-helper (anticorpi anti-CD4). Normalmente 36-55% o 400-1100 cellule/mcl. Un aumento del numero di queste cellule si verifica in caso di malattie autoimmuni, malattia di Waldenström e attivazione dell'immunità antitrapianto; una diminuzione del numero di cellule T-helper si verifica in caso di infezioni croniche batteriche, virali e protozoarie, tubercolosi, sindrome da immunodeficienza acquisita, tumori maligni, ustioni, lesioni, malnutrizione, invecchiamento, trattamento con citostatici ed esposizione a radiazioni ionizzanti.
  • Determinazione del numero di soppressori dei recettori T (anticorpi anti-CD4). Normalmente 17-37% o 300-700 cellule/μl. Un aumento del numero di soppressori dei recettori T si verifica nelle stesse condizioni in cui il numero di T-helper diminuisce, e una loro diminuzione si verifica nelle stesse condizioni in cui il contenuto di T-helper aumenta.
  • Indice immunoregolatore CD4/CD8, normalmente 1,5-2,5. Iperattività con valori superiori a 2,5 (malattie allergiche e autoimmuni); ipoattività - inferiore a 1,0 (predisposizione alle infezioni croniche). All'inizio del processo infiammatorio, l'indice immunoregolatore aumenta e, quando si attenua, si normalizza.

Metodi di chiarimento

• Determinazione del numero di cellule natural killer (NK) - anticorpi anti-CD16 e anti-CD56. La norma per i linfociti CD16 è del 6-26%, per i CD56 del 9-19%. Un aumento del numero di cellule NK si verifica in caso di rigetto di trapianto, mentre una diminuzione si verifica in caso di infezioni virali, cancro, immunodeficienze primarie e secondarie, ustioni, lesioni e stress, trattamento con citostatici ed esposizione a radiazioni ionizzanti.
• Determinazione del numero di linfociti T con un recettore per l'interleuchina-2 (marcatore di attivazione) - anticorpi anti-CD25. La norma è del 10-15%. Un aumento del loro numero si osserva nelle malattie allergiche, nel rigetto di trapianto, nella risposta ad antigeni timo-dipendenti nella fase acuta dell'infezione primaria, mentre una diminuzione si osserva nelle stesse malattie in cui si osserva una diminuzione del numero di cellule NK.
• Studio dell'espressione del marcatore di attivazione - molecola di istocompatibilità di classe II HLA-DR. Un'espressione aumentata si verifica nei processi infiammatori, nei pazienti con epatite C, celiachia, sifilide e malattie respiratorie acute.
• Valutazione dell'apoptosi linfocitaria. Un'idea approssimativa della predisposizione dei linfociti all'apoptosi può essere determinata dall'espressione del recettore Fas (CD95) sulla loro superficie e del proto-oncogene bd-2 nei mitocondri. L'apoptosi linfocitaria viene valutata trattandoli con due coloranti fluorescenti: ioduro di propidio, che si lega ai frammenti di DNA, e annessina Y, che si lega alla fosfatidilserina, che compare sulla membrana cellulare all'inizio dell'apoptosi. I risultati vengono valutati utilizzando un citofluorimetro a flusso. I risultati vengono calcolati in base al rapporto tra cellule colorate con diversi coloranti. Le cellule non colorate sono vitali, le cellule legate solo all'annessina Y sono manifestazioni precoci di apoptosi, mentre la colorazione con solo ioduro di propidio e annessina Y è indicativa di necrosi.
• Valutazione della proliferazione dei linfociti T in vitro.
  • Alterazioni nella blastogenesi cellulare - reazione di trasformazione blastica dei linfociti. I leucociti vengono incubati con qualsiasi mitogeno di origine vegetale (lectine). La fitoemoagglutinina viene solitamente utilizzata per 72 ore, dopodiché viene prelevato uno striscio, colorato e si conta il numero di blasti! L'indice di stimolazione è il rapporto tra la percentuale di cellule trasformate nell'esperimento (coltura con fitoemoagglutinina) e la percentuale di cellule trasformate nel controllo (coltura senza fitoemoagglutinina). La reazione di trasformazione blastica dei linfociti può essere valutata mediante l'inclusione di un marcatore radioattivo (ZN-timndinum) nelle cellule in coltura, poiché la sintesi di DNA aumenta durante la divisione cellulare. Alterazioni nella risposta proliferativa si verificano sia nelle immunodeficienze primarie che secondarie associate a infezioni, cancro, insufficienza renale e interventi chirurgici.
  • In questi studi, viene valutata l'espressione dei marcatori di attivazione (CD25, recettore della transferrina - CD71) e della molecola del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II HLA-DR, praticamente assenti sui linfociti T a riposo. I linfociti T vengono stimolati con fitoemoagglutinina e, dopo 3 giorni, l'espressione dei marcatori di attivazione viene analizzata mediante immunofluorescenza diretta o indiretta, citofluorimetria a flusso, utilizzando anticorpi monoclonali diretti contro i recettori isolati.
  • Misurazione della quantità di mediatori sintetizzati dai linfociti T attivati [interleuchina (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferone, ecc.] mediante radioimmunoanalisi o ELISA. Di particolare importanza è la valutazione della concentrazione di γ-interferone e IL-4 come marcatori di Th1 e Th2 nel surnatante delle colture attivate e all'interno della cellula. Se possibile, è utile determinare l'espressione genica della citochina corrispondente in base al livello di acido ribonucleico della matrice nella cellula produttrice e all'intensità di espressione dei recettori per le citochine corrispondenti.
    
• Reazione di inibizione della migrazione linfocitaria. I linfociti T sensibilizzati, in reazione con l'antigene, secernono linfochine, inclusi fattori che inibiscono la migrazione linfocitaria. Il fenomeno di inibizione si osserva quando i mitogeni vengono introdotti nella coltura cellulare. La valutazione del grado di inibizione consente di valutare la capacità dei linfociti di secernere citochine. Normalmente, la frequenza di migrazione, a seconda del mitogeno specifico, è del 20-80%.
• Valutazione della citotossicità delle cellule NK. Viene determinata la capacità delle cellule natural killer di uccidere le cellule bersaglio della linea eritromieloide K-562. Se si valuta la citotossicità anticorpo-dipendente, vengono utilizzate cellule bersaglio rivestite con anticorpi IgG. Le cellule bersaglio vengono marcate con 3H-uridina e incubate con cellule effettrici. La morte delle cellule bersaglio viene valutata mediante il rilascio del marcatore radioattivo nella soluzione. Una diminuzione della citotossicità si verifica nelle neoplasie maligne. In alcuni casi, quando è necessario prevedere l'efficacia del trattamento con interleuchine, la citotossicità delle cellule NK viene valutata durante l'incubazione con determinate citochine.

Studio della funzione dei fagociti

Metodi di screening

Studio dell'intensità di assorbimento delle cellule microbiche da parte dei fagociti (fagocitosi di particelle di lattice, coltura di prova di stafilococco, Escherichia coli o microrganismi isolati dal paziente). Centrifugando il sangue eparinizzato, si isola una sospensione di leucociti, a cui si aggiunge siero del gruppo sanguigno IV per opsonizzazione (le opsonine sono proteine che favoriscono la fagocitosi). La sospensione microbica viene diluita, miscelata con i leucociti e incubata per 120 minuti, prelevando campioni per l'analisi 30-90-120 minuti dopo l'inizio dell'incubazione. Dalla sospensione leucocitaria raccolta vengono preparati degli strisci. Vengono determinati i seguenti indicatori di fagocitosi:

• indice fagocitario - percentuale di cellule entrate in fagocitosi entro 30 min e 120 min di incubazione; il valore standard dell'indice fagocitario (30) è del 94%, l'indice fagocitario (120) è del 92%;
• numero fagocitario - numero medio di batteri situati intracellularmente; il valore standard del numero fagocitario (30) è 11%, il numero fagocitario (120) è 9,8%;
• coefficiente del numero fagocitario - rapporto tra il numero fagocitario (30) e il numero fagocitario (120); normalmente 1,16;
• Indice battericida dei neutrofili: rapporto tra il numero di microbi uccisi nei fagociti e il numero totale di microbi assorbiti; normalmente è il 66%.

Metodi di chiarimento

• Studio della capacità battericida dei fagociti nel test con nitroblu di tetrazolio (NBT) - Test NBT. Il colorante giallo nitroblu di tetrazolio viene aggiunto ai leucociti. Quando un neutrofilo assorbe il colorante, si verifica un processo di riduzione sotto l'influenza dei radicali liberi dell'ossigeno, con conseguente colorazione blu. La reazione viene condotta in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. La soluzione di Hanks (NBT spontaneo) viene aggiunta ai primi tre pozzetti con una miscela di NBT e leucociti, mentre al secondo vengono aggiunte particelle di lattice; la miscela viene incubata a 37 °C per 25 minuti. I risultati vengono letti a 540 nm su un lettore ed espressi in unità arbitrarie. Viene calcolato il coefficiente di stimolazione (Kst ₎, pari al rapporto tra la densità ottica nei pozzetti stimolati e la densità ottica media nei pozzetti non stimolati. Nelle persone sane, NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. M a _dir = 1,78±0,36.
• Studio delle molecole di adesione. La citofluorimetria a flusso viene utilizzata per determinare l'espressione degli antigeni di superficie CD11a/CD18, CD11b/CD18 e CD11c/CD18. Le immunodeficienze con compromissione dell'adesione si manifestano con infezioni ricorrenti, lenta guarigione delle ferite e assenza di pus nei focolai di infezione.

Studio del sistema del complemento

Metodi di screening

La determinazione dell'attività emolitica del complemento è uno studio della via classica di attivazione del complemento. Diverse diluizioni di siero, provenienti da una persona malata e sana, vengono aggiunte a eritrociti di montone rivestiti con anticorpi. L'unità di attività emolitica è il reciproco della diluizione del siero alla quale viene distrutto il 50% degli eritrociti. Il grado di emolisi viene stimato fotometricamente in base al rilascio di emoglobina nella soluzione. Una diminuzione dell'attività emolitica del complemento si osserva nel lupus eritematoso sistemico con danno renale, glomerulonefrite acuta, immunodeficienze combinate, miastenia, epatite virale, linfomi, mentre un aumento si osserva in ittero ostruttivo, tiroidite di Hashimoto, reumatismi, artrite reumatoide, periarterite nodulare, dermatomiosite, infarto del miocardio, colite ulcerosa, sindrome di Reiter e gotta.

Metodi di chiarimento

• Determinazione dei componenti del complemento. La determinazione quantitativa viene eseguita mediante immunodiffusione radiale e nefelometria.
  Lo studio non è informativo a meno che non vengano alterate le proprietà antigeniche dei componenti del complemento.
• È stato dimostrato che la componente Clq del complemento aumenta la fagocitosi e media la citotossicità cellulare. La sua diminuzione si verifica nelle malattie da immunocomplessi, nel lupus eritematoso sistemico, nelle infezioni purulente e nei tumori.
• La componente C3 è coinvolta nell'attivazione delle vie classiche e alternative del complemento. Una diminuzione della sua concentrazione è associata a infezioni batteriche e fungine croniche e alla presenza di immunocomplessi circolanti o tissutali.
• La componente C4 è coinvolta nell'attivazione della via classica. Una diminuzione della sua concentrazione è associata a un'attivazione prolungata del complemento da parte di immunocomplessi e a una diminuzione della concentrazione dell'inibitore di C1, che controlla l'attivazione della via classica del complemento. La carenza di C4 si verifica nel lupus eritematoso sistemico, mentre un aumento di C4 si verifica nelle malattie renali, nel rigetto di trapianto, nell'infiammazione acuta e nelle malattie gastrointestinali.
• Il C5a è un piccolo frammento della molecola C5, che viene separato da quest'ultima in seguito all'attivazione del sistema del complemento. La sua concentrazione aumenta durante infiammazioni, sepsi, malattie atopiche e allergiche.
• Il Cl-inibitore è un fattore multifunzionale. Controlla l'attivazione della componente C1 del complemento, inibisce l'attività della callicreina, della plasmina e del fattore di Hageman attivato, delle proteasi Cls e Or. La carenza di C1-inibitore porta ad angioedema.
• Studi funzionali del complemento. Il siero in esame viene aggiunto a un siero standard privo di qualsiasi componente del complemento e se ne determina l'attività emolitica. Se l'attività emolitica non viene ripristinata alla normalità, l'attività di questa componente del complemento nel siero in esame è considerata ridotta.

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