Diagnostica della tubercolina

La diagnostica tubercolinica è un insieme di test diagnostici per determinare la sensibilizzazione specifica dell'organismo al Mycobacterium tuberculosis utilizzando la tubercolina, un filtrato autoclavato di colture di Mycobacterium tuberculosis. La tubercolina è classificata come un antigene incompleto - aptene, che non è in grado di causare malattia o lo sviluppo di immunità ad esso, ma provoca una risposta specifica correlata all'allergia di tipo ritardato. Allo stesso tempo, la tubercolina ha un'elevata specificità, agendo anche in diluizioni molto elevate. Il verificarsi di una reazione specifica alla tubercolina è possibile solo in presenza di una sensibilizzazione preliminare dell'organismo al Mycobacterium a seguito di infezione spontanea o vaccinazione con BCG.

Nella sua composizione chimica, la tubercolina è un preparato complesso contenente tubercoloproteine, polisaccaridi, lipidi, acidi nucleici, stabilizzanti e antisettici. L'attività biologica della tubercolina, fornita dalla tubercoloproteina, viene misurata in unità tubercoliniche (TU) e standardizzata rispetto allo standard nazionale. Lo standard nazionale, a sua volta, deve essere confrontato con lo standard internazionale. Nella pratica internazionale, si utilizza la PPD-S (tubercolina Seibert o tubercolina standard).

Attualmente nel Paese vengono prodotte le seguenti forme di PPD-L (tubercolina purificata nazionale di Linnikova):

• l'allergene tubercolare liquido purificato in diluizione standard (tubercolina purificata in diluizione standard) è una tubercolina pronta all'uso utilizzata per la diagnostica tubercolinica di massa e individuale;
• allergene della tubercolosi purificato secco per uso cutaneo, sottocutaneo e intradermico (tubercolina purificata secca) - una preparazione in polvere (che si scioglie nel solvente fornito), utilizzata per la diagnostica tubercolinica individuale e per la terapia tubercolinica solo nelle strutture antitubercolari.

Lo scopo del test di Mantoux

Se il corpo umano è pre-sensibilizzato al Mycobacterium tuberculosis (per infezione spontanea o a seguito di vaccinazione con BCG), in risposta all'introduzione della tubercolina si verifica una reazione specifica, basata sul meccanismo DTH. La reazione inizia a svilupparsi 6-8 ore dopo l'introduzione della tubercolina sotto forma di un infiltrato infiammatorio di varia gravità, la cui base cellulare è costituita da linfociti, monociti, macrofagi, cellule epitelioidi e cellule giganti. Il meccanismo scatenante del DTH è l'interazione dell'antigene (tubercolina) con i recettori sulla superficie dei linfociti effettori, con conseguente rilascio di mediatori dell'immunità cellulare, che coinvolgono i macrofagi nel processo di distruzione dell'antigene. Alcune cellule muoiono, rilasciando enzimi proteolitici che hanno un effetto dannoso sui tessuti. Altre cellule si accumulano attorno alle lesioni. Il tempo di sviluppo e la morfologia delle reazioni con qualsiasi metodo di somministrazione della tubercolina non differiscono sostanzialmente da quelli con somministrazione intradermica. Il picco della reazione DTH si verifica dopo 48-72 ore, quando la componente aspecifica è minima e quella specifica raggiunge il suo massimo.

La diagnosi della tubercolina si divide in di massa e individuale.

Lo scopo della diagnostica tubercolinica di massa è quello di effettuare lo screening della popolazione per la tubercolosi. I compiti della diagnostica tubercolinica di massa sono:

• identificazione dei bambini e degli adolescenti affetti da tubercolosi;
• identificazione dei soggetti a rischio di sviluppare la tubercolosi per la successiva osservazione da parte di un tisiatrico (soggetti infettati per la prima volta da micobatteri della tubercolosi con una "svolta" nei test alla tubercolina, con un aumento dei test alla tubercolina, con test alla tubercolina iperergici, con test alla tubercolina che si sono mantenuti a un livello moderato e alto per lungo tempo), se necessario - per il trattamento preventivo;
• selezione di bambini e adolescenti per la rivaccinazione con BCG;
• determinazione degli indicatori epidemiologici della tubercolosi (tasso di infezione della popolazione, rischio annuale di infezione).

Per la diagnosi di massa della tubercolina si utilizza solo il test di Mantoux con 2 TE, utilizzando solo tubercolina purificata in una diluizione standard.

Per selezionare bambini e adolescenti da sottoporre a rivaccinazione con BCG, il test di Mantoux con 2 TE, secondo il calendario vaccinale preventivo, viene eseguito nelle fasce d'età previste a 7 anni (scuola secondaria di primo grado e prima elementare) e a 14 anni (ottavo e nono anno di scuola). La rivaccinazione viene eseguita su soggetti clinicamente sani, non precedentemente infetti, con reazione negativa al test di Mantoux.

La diagnostica tubercolinica individuale viene utilizzata per condurre esami individuali. Gli obiettivi della diagnostica tubercolinica individuale sono:

• diagnosi differenziale tra allergia post-vaccinazione e allergia infettiva (PVA);
• diagnosi e diagnosi differenziale della tubercolosi e di altre malattie;
• determinazione della “soglia” di sensibilità individuale alla tubercolina;
• determinazione dell'attività del processo tubercolare;
• valutazione dell'efficacia del trattamento.

Per la diagnosi di tubercolina individuale, vengono utilizzati diversi test tubercolinici con somministrazione cutanea, intradermica e sottocutanea. Per i vari test tubercolinici, vengono utilizzate sia tubercolina purificata in diluizione standard (allergene tubercolare purificato in diluizione standard) sia tubercolina purificata secca (allergene tubercolare purificato secco). La tubercolina purificata in diluizione standard può essere utilizzata in istituti antitubercolari, cliniche pediatriche, ospedali per malattie somatiche e infettive. La tubercolina purificata secca è approvata per l'uso solo in istituti antitubercolari (dispensari antitubercolari, ospedali per la tubercolosi e sanatori).

Tecnica di ricerca e valutazione dei risultati

I preparati di tubercolina PPD-L vengono somministrati al corpo umano per via cutanea, intradermica e sottocutanea. La via di somministrazione dipende dal tipo di test tubercolinico.

Test cutaneo graduato di Grinchar e Karpilovsky

Il GKP è un test tubercolinico cutaneo con soluzioni di tubercolina al 100%, 25%, 5% e 1%. Per ottenere una soluzione tubercolinica al 100%, 2 fiale di tubercolina PPD-L purificata secca vengono diluite successivamente in 1 ml di solvente e le successive soluzioni tubercoliniche vengono preparate dalla soluzione al 100% risultante. Per ottenere una soluzione al 25%, si preleva 1 ml da una fiala contenente una soluzione al 100% utilizzando una siringa sterile e si versa in una fiala sterile asciutta. Si aggiungono 3 ml di solvente utilizzando un'altra siringa sterile, si agita accuratamente la fiala e si ottengono 4 ml di soluzione tubercolinica al 25%. Per ottenere una soluzione di tubercolina al 5%, si preleva 1 ml da una fiala con una soluzione al 25% utilizzando una siringa sterile e si trasferisce in un'altra fiala sterile asciutta, quindi si aggiungono 4 ml di solvente, si agita e si ottengono 5 ml di una soluzione di tubercolina al 5%, ecc.

Sulla pelle asciutta della superficie interna dell'avambraccio, pretrattata con una soluzione di alcol etilico al 70%, si applicano goccia a goccia tubercolina a diverse concentrazioni (100%, 25%, 5%, 1%) con pipette sterili in modo che la concentrazione di tubercolina diminuisca dalla piega del gomito verso l'esterno. Sotto la goccia con la soluzione tubercolinica all'1%, si applica una goccia di solvente senza tubercolina come controllo. Si utilizzano pipette marcate separate per ciascuna soluzione tubercolinica e per il controllo. La pelle dell'avambraccio viene stirata dal basso con la mano sinistra, quindi si viola l'integrità degli strati superficiali della pelle con una penna vaiolosa a forma di graffio lungo 5 mm, fatta passare attraverso ogni goccia in direzione dell'asse longitudinale del braccio. La scarificazione viene eseguita prima con una goccia di solvente, poi successivamente con soluzioni tubercoliniche all'1%, 5%, 25% e 100%, strofinando la tubercolina 2-3 volte con il lato piatto della penna dopo ogni scarificazione per consentire al preparato di penetrare nella pelle. L'avambraccio viene lasciato aperto per 5 minuti per asciugare. Viene utilizzata una penna sterile separata per ogni soggetto. Una cresta bianca appare nel sito di scarificazione, a indicare che c'è tempo sufficiente affinché la tubercolina venga assorbita. Successivamente, la tubercolina rimanente viene rimossa con cotone sterile.

La GCP viene valutata secondo NA Shmelev dopo 48 ore. Si distinguono le seguenti reazioni alla GCP:

• reazione anergica - mancanza di risposta a tutte le soluzioni di tubercolina;
• reazione aspecifica - leggero arrossamento nel sito di applicazione della soluzione tubercolinica al 100% (estremamente raro);
• reazione norergica - sensibilità moderata ad alte concentrazioni di tubercolina, nessuna reazione alle soluzioni di tubercolina all'1% e al 5%:
• reazione iperergica - risposte a tutte le concentrazioni di tubercolina, la dimensione degli infiltrati aumenta con l'aumentare della concentrazione di tubercolina, sono possibili alterazioni vescicolo-necrotiche, linfangite e screening;
• reazione di equalizzazione: dimensioni dell'infiltrato approssimativamente uguali per tutte le concentrazioni di tubercolina, concentrazioni elevate di tubercolina non causano una risposta adeguata;
• reazione paradossa - reazione meno intensa ad alte concentrazioni di tubercolina, reazioni più intense a basse concentrazioni di tubercolina.

Le reazioni equalizzanti e paradosse sono anche chiamate reazioni inadeguate alla GKP. Talvolta, le reazioni inadeguate alla GKP sono definite reazioni iperergiche.

La GKP ha un valore diagnostico differenziale nel determinare la natura dell'allergia alla tubercolina. La GRT post-vaccinazione è caratterizzata da reazioni norergiche adeguate, mentre nell'infezione da tubercolosi (IA) la reazione alla GKP può essere iperergica, equalizzante o paradossa. Nel periodo iniziale dell'infezione primaria ("turn"), che si verifica con alterazioni funzionali, si osservano reazioni paradosse e equalizzante.

Nei bambini praticamente sani che sono sopravvissuti con successo all'infezione tubercolare primaria, anche il GKP può essere norergico.

La GKP è di grande importanza per la diagnosi differenziale della tubercolosi e di altre malattie, per determinare l'attività del processo tubercolare. Nei pazienti con tubercolosi attiva, sono più comuni le reazioni iperergiche, equalizzanti e paradosse. La tubercolosi grave può essere accompagnata da reazioni energiche.

Una diminuzione della sensibilità alla tubercolina secondo i dati GKP (passaggio da reazioni iperergiche a normergiche, da inadeguate ad adeguate, da energetiche a normergiche positive) nei pazienti con tubercolosi sullo sfondo di una terapia antibatterica indica la normalizzazione della reattività dell'organismo e l'efficacia della terapia.

Test intradermico con diverse diluizioni di tubercolina

La soluzione iniziale di tubercolina viene preparata mescolando una fiala di tubercolina PPD-L purificata secca (50 mila TU) con una fiala di solvente; si ottiene la diluizione base di tubercolina: 50 mila TU in 1 ml. Il preparato deve essere sciolto per 1 minuto, fino a quando la soluzione non risulta limpida e incolore. La prima diluizione di tubercolina viene preparata aggiungendo 4 ml di solvente alla fiala con la diluizione base (si ottengono 1000 TU in 0,1 ml di soluzione). La seconda diluizione di tubercolina viene preparata aggiungendo 9 ml di solvente a 1 ml della prima diluizione (si ottengono 100 TU in 0,1 ml di soluzione). Tutte le successive diluizioni di tubercolina (fino all'ottava) vengono preparate in modo analogo. Pertanto, le diluizioni della tubercolina corrispondono alle seguenti dosi di tubercolina in 0,1 ml di soluzione: 1a diluizione - 1000 TE, 2a - 100 TE, 3a - 10 TE, 4a - 1 TE. 5a - 0,1 TE, 6a - 0,01 TE. 7a - 0,001 TE. 8a - 0,0001 TE.

Il test di Mantoux con diverse diluizioni di tubercolina viene eseguito allo stesso modo del test con 2 TE. Per ogni diluizione, utilizzare una siringa e un ago separati. Su un avambraccio, viene eseguito un test con due diluizioni di tubercolina a una distanza di 6-7 cm l'una dall'altra. Contemporaneamente, è possibile eseguire un terzo test con un'altra diluizione di tubercolina sull'altro avambraccio. Il test viene valutato dopo 72 ore:

• reazione negativa - assenza di papule e iperemia, presenza solo di una reazione pungente (0-1 mm);
• reazione dubbia: papula inferiore a 5 mm o iperemia di qualsiasi dimensione;
• reazione positiva - papula di 5 mm o più.

La titolazione (determinazione della soglia di sensibilità alla tubercolina) si completa al raggiungimento di una reazione positiva alla minima diluizione di tubercolina. Reazioni positive ad alte diluizioni di tubercolina con dosi di 0,1 TB, 0,01 TE, ecc. indicano un elevato grado di sensibilizzazione dell'organismo e solitamente accompagnano la tubercolosi attiva. Una reazione negativa a 100 TE nella stragrande maggioranza dei pazienti con una probabilità del 97-98% ci consente di escludere la diagnosi di tubercolosi o la natura infettiva dell'allergia.

Nella stragrande maggioranza dei pazienti e degli individui infetti, si rileva solo una reazione locale alla tubercolina durante l'esecuzione dei test cutanei e intradermici. In casi isolati, si osservano reazioni generali al test di Mantoux con 2 TE. Tali pazienti sono sottoposti a un esame clinico e radiologico approfondito. Reazioni focali si osservano ancora più raramente.

Test tubercolinico sottocutaneo di Koch

Il test tubercolinico sottocutaneo di Koch è un'iniezione sottocutanea di tubercolina.

Nella pratica pediatrica, il test di Koch viene solitamente iniziato con 20 TE. A questo scopo, 1 ml di tubercolina purificata in diluizione standard o 0,2 ml di tubercolina purificata secca alla terza diluizione vengono iniettati per via sottocutanea, senza considerare lo studio preliminare della soglia di sensibilità alla tubercolina.

Diversi autori raccomandano la prima dose di 20 TE per il test di Koch in caso di test di Mantoux norergico con 2 TE e reazione negativa o debolmente positiva alla soluzione tubercolinica al 100% in GKP. In caso di reazione negativa al test di Koch con 20 TE, la dose viene aumentata a 50 TE e poi a 100 TE. Nei bambini con reazioni iperergiche al test di Mantoux con 2 TE, il test di Koch inizia con l'introduzione di 10 TE.

In risposta al test di Koch si sviluppano reazioni locali, generali e focali.

• Si verifica una reazione locale nel sito di iniezione della tubercolina. La reazione è considerata positiva quando le dimensioni dell'infiltrato sono di 15-20 mm. In assenza di una reazione generale e focale, la reazione è di scarsa utilità.
• Reazione focale: alterazioni dopo l'introduzione della tubercolina nel focolaio della lesione tubercolare. Oltre ai segni clinici e radiologici, è consigliabile esaminare l'espettorato e i lavaggi bronchiali prima e dopo l'introduzione della tubercolina. Una reazione focale positiva (aumento dei sintomi clinici, aumento dell'infiammazione perifocale all'esame radiologico, comparsa di escrezione batterica) è importante sia nella diagnosi differenziale della tubercolosi con altre malattie, sia nel determinare l'attività del processo tubercolare.
• La reazione generale si manifesta con un peggioramento delle condizioni dell'organismo nel suo complesso (temperatura corporea, composizione cellulare e biochimica del sangue).
  • La reazione termica è considerata positiva se si verifica un aumento della temperatura corporea di 0,5 °C rispetto al massimo registrato prima della somministrazione sottocutanea di tubercolina (si consiglia di effettuare la termometria ogni 3 ore, 6 volte al giorno per 7 giorni, 2 giorni prima e 5 giorni dopo il test). Nella stragrande maggioranza dei pazienti, si osserva un aumento della temperatura corporea già al 2° giorno, sebbene sia possibile un successivo aumento anche al 4°-5° giorno.
  • Trenta minuti o un'ora dopo la somministrazione sottocutanea di tubercolina, si osserva una diminuzione del numero assoluto di eosinofili (test di Mikhailov). Dopo 24-48 ore, la VES aumenta di 5 mm/h, il numero di neutrofili a banda del 6% o più, il contenuto di linfociti diminuisce del 10% e quello di piastrine del 20% o più (test di Bobrov).
  • Dopo 24-48 ore dalla somministrazione sottocutanea di tubercolina, il coefficiente albumina-globulina diminuisce a causa di una diminuzione del contenuto di albumina e di un aumento delle α1- _, α2- _e γ-globuline (test di Rabukhin-Ioffe per la proteina-tubercolina). Questo test è considerato positivo quando gli indicatori variano di almeno il 10% rispetto al livello iniziale.

Metodi alternativi

Oltre alle tubercoline utilizzate in vivo, sono stati creati preparati per l'uso in vitro, per la cui produzione vengono utilizzate tubercoline o vari antigeni micobatterici.

Per rilevare gli anticorpi contro il Mycobacterium tuberculosis, viene prodotto un test diagnostico, l'antigene eritrocitario tubercolare secco, costituito da eritrociti di pecora sensibilizzati con un antigene fosfatidico. Il test diagnostico è destinato all'esecuzione di una reazione di emoagglutinazione indiretta (IHA) al fine di rilevare anticorpi specifici contro gli antigeni del Mycobacterium tuberculosis. Questo test immunologico viene utilizzato per determinare l'attività del processo tubercolare e monitorare il trattamento. Un sistema di test immunoenzimatico è inoltre destinato alla determinazione degli anticorpi contro il Mycobacterium tuberculosis nel siero sanguigno dei pazienti: un set di ingredienti per l'esecuzione del test ELISA. Viene utilizzato per la conferma in laboratorio della diagnosi di tubercolosi di varie localizzazioni, per valutare l'efficacia del trattamento e per decidere l'eventuale somministrazione di immunocorrezione specifica. La sensibilità dell'ELISA per la tubercolosi è bassa, pari al 50-70%, mentre la specificità è inferiore al 90%, il che ne limita l'impiego e non consente l'impiego del test per lo screening dell'infezione tubercolare.

Per rilevare i micobatteri si utilizzano sistemi di test PCR.

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Controindicazioni al test di Mantoux

Controindicazioni al test di Mantoux con 2 TE:

• malattie della pelle, malattie infettive acute e croniche e malattie somatiche (inclusa l'epilessia) durante la fase di esacerbazione;
• condizioni allergiche, reumatismi in fase acuta e subacuta, asma bronchiale, idiosincrasia con manifestazioni cutanee pronunciate durante l'esacerbazione;
• quarantena per le infezioni infantili nei gruppi di bambini;
• un intervallo inferiore a 1 mese dopo altre vaccinazioni preventive (DPT, vaccinazioni contro il morbillo, ecc.).

In questi casi, il test di Mantoux viene eseguito 1 mese dopo la scomparsa dei sintomi clinici o subito dopo la revoca della quarantena.

Non vi sono controindicazioni assolute ai test cutanei e intradermici alla tubercolina. Si sconsiglia di eseguirli durante periodi di riacutizzazione di malattie allergiche croniche, dermatite esfoliativa, malattie cutanee pustolose o durante infezioni respiratorie acute.

La somministrazione sottocutanea di tubercolina è indesiderabile nei pazienti con un processo reumatico attivo, in particolare con malattie cardiache, e durante l'esacerbazione di malattie croniche degli organi digestivi.

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Fattori che influenzano il risultato del test di Mantoux

L'intensità della reazione alla tubercolina dipende da molti fattori. I bambini hanno una maggiore sensibilità alla tubercolina rispetto agli adulti. Nelle forme gravi di tubercolosi ( meningite, tubercolosi miliare, polmonite caseosa ), si nota spesso una bassa sensibilità alla tubercolina a causa della forte soppressione della reattività dell'organismo. Alcune forme di tubercolosi ( tubercolosi oculare, tubercolosi cutanea), al contrario, sono spesso accompagnate da un'elevata sensibilità alla tubercolina.

L'intensità della reazione a 2 TE dipende dalla frequenza e dalla molteplicità delle rivaccinazioni tubercolari. Ogni rivaccinazione successiva comporta un aumento della sensibilità alla tubercolina. A sua volta, una diminuzione della frequenza delle rivaccinazioni con BCG porta a una riduzione del numero di risultati positivi al test di Mantoux di 2 volte, e di 7 volte in caso di iperattività. Pertanto, l'annullamento delle rivaccinazioni contribuisce a identificare il reale livello di infezione di bambini e adolescenti con micobatteri tubercolari, il che, a sua volta, consente la copertura completa degli adolescenti con rivaccinazioni con BCG entro i tempi previsti.

È stata evidenziata la dipendenza dell'intensità della reazione di Mantoux dalla dimensione della cicatrice post-vaccinazione con BCG. Maggiore è la cicatrice post-vaccinazione, maggiore è la sensibilità alla tubercolina.

In caso di invasioni elmintiche, ipertiroidismo, malattie respiratorie acute, epatite virale e focolai infettivi cronici, la sensibilità alla tubercolina aumenta. Inoltre, fino ai 6 anni, l'IA (GTH) è più intensamente espressa nei bambini più grandi.

Si osserva una maggiore sensibilità alla tubercolina quando il test di Mantoux viene somministrato entro 1 giorno e 10 mesi dalla vaccinazione contro le infezioni infantili (vaccini contro DPT, DPT-M, ADS-M, morbillo e parotite). Le reazioni precedentemente negative diventano dubbie e positive, e dopo 1-2 anni tornano negative. Pertanto, la diagnosi tubercolinica è pianificata prima delle vaccinazioni preventive contro le infezioni infantili o non prima di 1 mese dalla vaccinazione.

Reazioni alla tubercolina meno pronunciate si registrano in estate. L'intensità delle reazioni alla tubercolina diminuisce in caso di febbre, malattie oncologiche, infezioni virali infantili, durante le mestruazioni e durante il trattamento con ormoni glucocorticoidi e antistaminici.

La valutazione dei risultati del test alla tubercolina può essere difficile nelle aree in cui è diffusa una bassa sensibilità alla tubercolina causata da micobatteri atipici. Le differenze nella struttura antigenica dei diversi tipi di micobatteri causano diversi gradi di reazioni cutanee quando si utilizzano antigeni diversi. Quando si esegue un test differenziale con diversi tipi di tubercolina, le reazioni più pronunciate sono causate dalla tubercolina preparata dal tipo di micobatterio da cui l'organismo è infetto. Tali preparati sono solitamente chiamati sensibilitine.

Una reazione negativa alla tubercolina è chiamata anergia tubercolinica. È possibile un'anergia primaria (nessuna reazione alla tubercolina in individui non infetti) e un'anergia secondaria (che si sviluppa in individui infetti). L'anergia secondaria, a sua volta, può essere positiva (come variante della cura biologica per l'infezione tubercolare o come stato di immunoanergica, osservato, ad esempio, nel caso di "microbico latente") e negativa (nelle forme gravi di tubercolosi). L'anergia secondaria si verifica anche nella linfogranulomatosi, nella sarcoidosi, in molte malattie infettive acute (morbillo, rosolia, mononucleosi, pertosse, scarlattina, tifo, ecc.), nelle carenze vitaminiche, nella cachessia e nelle neoplasie.

Bambini e adolescenti con ipersensibilità alla tubercolina, sulla base dei risultati della diagnosi di massa della tubercolina, rappresentano il gruppo a maggior rischio di tubercolosi e richiedono l'esame più approfondito da parte di un tisiatrico. La presenza di ipersensibilità alla tubercolina è spesso associata allo sviluppo di forme locali di tubercolosi. Con iperergia alla tubercolina, il rischio di tubercolosi è 8-10 volte superiore rispetto alle reazioni norergiche. Particolare attenzione deve essere prestata ai bambini infetti da Mycobacterium tuberculosis, con reazioni iperergiche e a contatto con pazienti affetti da tubercolosi.

In ogni singolo caso è necessario studiare tutti i fattori che influiscono sulla sensibilità alla tubercolina, il che è di grande importanza per formulare una diagnosi, scegliere la corretta tattica medica, il metodo di gestione del paziente e il trattamento.

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